UNICSUL - IMUNOLOGIA CLINICA - EXERCICIO DIRIGIDO - FINAL

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Nome: Anna Oliveira da Silva Razzano
RGM: 20019530
Estudo Dirigido
1. Um dos testes padrão ouro para o diagnóstico de HIV é o teste de Western blot, sabe-se que novos testes imunoenzimáticos tem sido desenvolvido. Dados:
	 WB para HIV 
	Teste ELISA 
	Positiva 
	Negativa 
	TOTAL 
	Positivo 
	60 
	44 
	104 
	Negativo 
	40 
	156 
	196 
	TOTAL 
	100 
	200 
	400 
a) Defina o conceito de sensibilidade analítica e a calcule utilizando os dados acima.
é a capacidade de um método analítico obter resultados positivos frente a resultados positivos obtidos pelo método de referencia. A menor quantidade do analito que poder ser mensurada.
Calculo: 
b) Defina o conceito de especificidade analítica e a calcule utilizando os dados acima.
é a habilidade de avaliar inequivocadamente o analito na presença de componentes que se esperam estar presentes. Estes componentes podem incluir diluentes, degradados componentes da matriz, impurezas e etc...
Calculo: 
c) Qual é a principal característica de um teste para ser utilizado numa etapa de triagem?
Alta sensibilidade e especificidade.
d) Qual é a principal característica de um teste para ser utilizado numa etapa de confirmação?
Basear-se no principio metodológico ELISA 4 indireto
 
2. O teste de hemaglutinação para Chagas é muito utilizado para a confirmação do diagnóstico da infecção pelo T. cruzi. Sobre esse ensaio, responda:
a) Escreva o princípio do método de hemaglutinação indireta para Chagas.
As hemácias estão entre os melhores suportes de antígenos para testes de aglutinação. Na hemaglutinação indireta (HAI), elas são suportes para antígenos que são adsorvidos á sua superfície, que para doença de Chagas são antígenos de T cruzi, agente etiológico da doença.
b) Como é realizada a leitura desse teste?
Reação Negativa: As hemácias se depositam no fundo da cavidade com um formato semelhante a um botão. Significa ausência de anticorpos específicos anti T cruzi ou que antes existem abaixo do limite de detecção.
Reação Positiva: Presença de aglutinação. As hemácias se depositam no fundo da cavidade como um tapete, às vezes com bordas irregulares. Significa presença de anticorpos específicos anti T cruzi.
c) Qual é o papel dos controles na reação?
Maior diluição que apresenta uma reação positiva. O ponto final é quando o tapete de hemácias cobre 50% do fundo da cavidade. Títulos menores que 1 \ 32: não reagentes títulos iguais ou maiores 1 \ 32: reagentes.
d) Classifique o teste de hemaglutinação para Chagas.
O conjugado deve ser titulado antes do teste das amostras.
3. O teste de aglutinação para detecção de proteína C reativa é muito utilizado na definição de quadros de perfis infecciosos. Sobre esse ensaio, responda:
a) Escreva o princípio do método de aglutinação direta para PCR.
Baseia-se na aglutinação das partículas de látex sensibilizadas com anticorpos anti-PCR humana (antígeno), quando misturadas com soro de pacientes contendo uma concentração de Proteína C Reativa (PCR) igual ou superior a 6mg\ L.
Inibição da hemaglutinação direta: Ac + Vírus = Ausência de aglutinação (positivo para presença de Ac na amostra) antígenos virais aglutinam hemácias 
b) Como é realizada a leitura desse teste?
Examinar macroscopicamente a presença ou ausência de aglutinação logo após dois minutos.
Amostra reagente: Presença de fluorescência uniforme em toda a membrana dos tripanossomas;
Amostra não reagente: Ausência total de fluorescência nos tripanossomas que se apresentam, geralmente com coloração “vermelho tijolo”;
Amostra indeterminada: Qualquer padrão diferente dos descritivos anteriormente. Geralmente, os tripanossomas apresentam fluorescência inespecífica, ou seja, em varias partes. 
c) Classifique o teste de aglutinação para PCR precauções e cuidados especiais
A - Aplicar os cuidados habituais de segurança na manipulação dos reagentes e amostras biológicas;
B - Recomenfamos seguir as boas práticas de laboratório clinica (BPLC) para a execução do teste e para a conservação, manuseio e descarte das matérias;
C - O látex PCR contém azida sódica como conservante. Evitar contato com os olhos, pele e mucosa. Não aspirar ou ingerir. Embora, o reagente contenha azida sódica como conservante todo cuidado deve ser tomado para evitar contaminação bacteriana;
D - Todos os reagente derivados do sangue humano foram testados para anticorpos anti-HCV, anti-HIV e antígeno HBsAg e apresentam resultados negativos. No entanto, devem ser tratados com preocupação, como potencialmente infectantes. Manusear e descartar segundo as normas de biossegurança;
E - Todo o material contaminado deve ser autoclavado por uma hora a 120 C ou deixado em solução de hipoclorito de sódio a 10% por uma hora;
F- De acordo com as instruções de biossegurança, todas as amostras devem ser manuscritas como materiais potencialmente infectantes.
4. Considere a figura abaixo:
 
a) Qual é o método representado acima? 
ELISA (Enzyme likedlmmunosorbentAssay)
b) Descreva o que acontece em cada uma das 4 etapas. 
Etapa 1: Antígeno adsorvido no poço;
Etapa 2: Anticorpo especifico liga-se ao antígeno; 
Etapa 3: Anticorpos ligados á enzima ligam-se aos anticorpos humanos;
Etapa: 4: Substrato é adicionado e convertido pela enzima á uma determinada cor. A coloração é proporcional à quantidade de anticorpos.
c) Qual a importância das etapas de lavagem? 
A lavagem é de extrema importância, pois é nesta fase que retira-se a parte não ligada, restando o complexo de ligação Ag-Ac ou a fase fixa, apenas. A lavagem retira excessos, e deve ser padronizada.
d) Qual o tipo de suporte utilizado neste ensaio? 
A reação pode ser avaliada como reagente não reagente ou indeterminada a partir da absorbância ou densidade óptica obtida pelo espectrofotômetro em comparação ao cut-off (ponto de corte). Amostras com valores a cima do cut-off são consideradas positivas, abaixo negativas e as amostras com valores em torno do cut-off, chamada de zona cinza ou borderline, são consideradas indeterminadas e não se pode ter certeza do resultado.
e) Como é realizada a leitura e a sua interpretação?
O estudo aponta dois tipos de técnicas utilizadas para diagnósticos da doença de chagas. São eles: Hemaglutinação e ELISA. Os métodos possuem alta sensibilidade especificidade na pesquisa de anticorpos específicos se comparados com outros testes que também são utilizados para o diagnostico da doença como: imunofluorescencia indireta. 
5. A imagem seguinte representa um dot plot obtido por citometria de fluxo:
a) Cite uma das aplicações para esse método. 
Técnica bem estabelecida pela utilização de laser óptico tem como função realizar a separação, a contagem individual de células e detecção de biomarcadores em proteínas. Permite a quantificação das populações linfocitárias TCD4 e TCD8.
b) Como é possível diferenciar as subpopulações de linfócitos.
No timo, os linfócitos T diferenciam-se e, diferentes subpopulações: Células T-helper, T-supressora e T- citotóxica (células NK). Os linfócitos T supressores inibem as respostas humoral na célula e apresentam o termino da resposta imunitária. Linfócitos T-helper e T supressores são as células reguladoras.
 
c) Por que não é possível a utilizarmos anticorpos policlonais nesse ensaio. 
Anticorpos policlonais (como diz o nome) possuem vários clones, ou seja, se originam de diferentes linfócitos B, o que significa que reagem com vários epitopos do antígeno (por exemplo, várias partes de uma proteína). O que não é o caso para o ensaio descrito.
6. Qual a importância da utilização dos testes NAT em banco de sangue? 
Identificar os ácidos ribonucléicos (RNA) desses vírus previamente aos testes sorológicos convencionais, além de identificá-los em bolsas doadas com níveis de anticorpos indetectáveis pelos testes sorológicos tradicionais, promovendo a redução do período denominado janela imunológicos – período compreendido entre o contato com o antígeno hemotransmissível e a produção de anticorpos em níveis detectáveis pelos testes sorológicos atuais. Reduz orisco de transmissão de agentes virais transmissíveis por transfusão, como HIV e HCV, uma vez que é possível a detecção mais precocemente dos antígenos em doações realizadas durante o período posterior a soro-conversão, porém, ainda em janela imunológica para sorologia.
7. Ao executar um teste rápido para sífilis, observou-se uma linha muito fraca na área de teste (T) da janela de leitura. Qual dos procedimentos a seguir devem ser realizados?
Considerar o resultado reagente e encaminhar a pessoa para realização do teste trepônico laboratotial para conclusão do diagnostico.
8. As infecções maternas que se disseminam atingindo o feto, seja pela placenta ou na hora do parto, foram coletivamente denominadas TORCH. Cite quais são essas infecções e quais as metodologias laboratoriais usadas nesse diagnóstico? 
Toxoplasmose, Rubéola, Hepatite B, Sífilis, Infecção pelo Citomegalovirus e pelo Vírus da Imunodeficiência Humana.
Toxoplasmose: O Ministério da Saúde recomenda realizar, sempre que possível, o rastreamento sorológico da toxoplasmose, por meio da detecção de anticorpos da classe IgM (ELISA ou imunofluorescência) durante a gestação. O diagnóstico molecular é realizado com o uso da Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) ou Convencional (cnPCR) para a identificação das sequencias genéticas do T. gondii. Estes métodos apresentam maior sensibilidade (92%-97,4%) e especificidade (100%) do que os outros métodos de diagnóstico na identificação do parasito em diversas amostras biológicas, tais como sangue, urina, líquido amniótico, líquido cefalorraquiano, humor aquoso, humor vítreo e alimento.
Rubéola: O teste mais utilizado é o ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção de anticorpos específicos IgM e IgG e/ou pela identificação do vírus a partir de secreção da nasofaringe e urina, até o quinto dia, preferencialmente, no terceiro dia do início do exantema,
 Citomegalovirus: Comprovada a infecção materna, é essencial verificar a possibilidade de comprometimento fetal, mediante investigação diagnóstica, utilizando-se de técnicas não invasivas ou invasivas. Dentre as técnicas diagnóstica destacam-se: a ultrassonografia (capacidade de o método revelar anomalias estruturais ou de crescimento causadas pelo CMV), a ressonância nuclear magnética (RNM) (indentificar as anormalidades cerebrais em fetos infectados pelo CMV), análise do líquido amniótico (LA) obtido por amniocentese (padrão-ouro do diagnóstico de infecção fetal pelo CMV). Obtido o LA, inicia-se a procura direta pelo CMV em cultura ou mediante pesquisa do genoma viral pela técnica de PCR. Não se recomenda o diagnóstico da infecção fetal pelo teste do IgM do sangue do
cordão umbilical, um vez que se onera o concepto com o risco iminente à cordocentese.
Hepatite B: O MS preconiza como metodologia de referência o ensaio imunoenzimático (ELISA), que pode ser realizado para a pesquisa do HBsAg, anti-HBc total, anti-HBc IgM, anti-HBs, HBeAg e anti-HBe. Como metodologia de triagem para a hepatite B, o Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais para ampliar o acesso ao diagnóstico, utiliza a testagem rápida (VIKIA–HBsAg), que utilizam a tecnologia imunocromatográfica (formato ICT ou lateral flow), que permite a detecção de antígeno do HBs no soro, plasma ou sangue total
Sífilis: Atualmente, existem três métodos para o diagnóstico laboratorial da sífilis: exame microscópico direto (técnica de campo escuro), testes não treponêmicos que são utilizados para triagem e acompanhamento e testes treponêmicos que são usados para confirmar resultados de baixa titulação dos não treponêmicos. Dentre os testes não-treponêmicos, tem-se o Venereal Disease Research Laboratory
(VDRL) e o Rapid Plasma Reagin (RPR).
Vírus da Imunodeficiência Humana: O Ministerio da Saúde recomenda realização do teste anti-HIV com aconselhamento e sob consentimento para todas as gestantes na primeira consulta pré-natal e repetição do teste, sempre que possível, no 3º trimestre durante o pré-natal na Atenção Básica no âmbito da Rede Cegonha, que objetiva a garantia de acesso às gestantes e suas parcerias sexuais com previsão da ampliação do acesso a toda a população.
9. Após colocar a amostra e o tampão em um dispositivo de teste rápido para diagnóstico da infecção pelo HIV-1 e 2, não foi possível observar na janela de leitura o aparecimento de nenhuma linha na região de controle (C). Qual o método desse exame? O que é recomendado para resolver a situação acima? 
Embora alguns esforços tenham sido direcionados no sentido de detectar o antígeno p24 ou o RNA do HIV-1 na ausência de anticorpos, a maioria deles baseia-se nas diferenças qualitativas e quantitativas observadas na evolução de produção de anticorpos anti-HIV após a soroconversão. Descartar o dispositivo e iniciar um novo teste do mesmo fabricante de um lote distinto. 
10. No gráfico abaixo está representada a evolução de uma infecção com o vírus da hepatite B, assim como a resposta imune (anti-HBc, IgM e IgG) a essa infecção.
Considerando um indivíduo doador de sangue, em qual das etapas seu sangue será fonte inadvertida de contaminação.
Na etapa A há risco para transmissão do vírus, mas este pode ser detectado com métodos que identificam antígenos virais. Considerando o gráfico apresentado no enunciado da questão, temos que o mesmo apresenta a evolução de uma infecção com o vírus da hepatite B, como também apresenta a resposta imune (anti-HBc, IgM e IgG). Caso um indivíduo doador de sangue, com potencial de ter sangue como fonte inadvertida de contaminação, temos que ressaltar que a etapa A apresentará risco para a transmissão do vírus, mas o mesmo pode apresentar detecção através de métodos que identificam antígenos virais.