POP Análise de eritrócitos e contagem diferencial de leucócitos

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Procedimento Operacional Padrão (POP) - 
Análise de eritrócitos e contagem diferencial de leucócitos
	Procedimento:
 
Este exame tem a finalidade de analisar e avaliar as hemácias, leucócitos e plaquetas, observar o aspecto e quantidade das células, diferenciar os tipos de leucócitos e determinar a porcentagem relativa no sangue, auxiliar em diagnósticos de deficiências, doenças ou distúrbios, no qual envolvam a função ou produção de células do sangue e usado para monitorar a produção e a maturidade das células do sangue em doenças como leucemias (durante radioterapia ou quimioterapia). Quando os resultados não são satisfatórios, é examinado o esfregaço de sangue e feita uma contagem diferencial de leucócitos para analisar a presença de células anormais ou imaturas.
Objetivo:
Realizar a contagem diferencial de leucócitos bem como analisar possíveis alterações morfológicas existentes
	Material:
· Coleta:
 - luvas de procedimentos;
- seringa de 3ml;
- agulha ou escalpe, compatível com acesso venoso do paciente;
- garrote; 
- tubo coletor de sangue EDTA;
- álcool a 70%;
- algodão. 
· Análise:
- lâminas;
- capilares ou pipeta de Pasteur;
- panótico de 3 fases (coloração rápida);
- microscópio;
- óleo de imersão;
- contador de células sanguíneas.
	Descrição do procedimento: 
· Coleta:
1. Conferir a identificação do paciente;
2. Conferir o material a ser usado no paciente;
3. Informar ao paciente sobre o procedimento;
4. Higienizar as mãos em lavatório com água e sabão ou por meio de fricção com soluções alcóolicas a 70% (álcool etílico líquido ou gel), pois possuem maior eficácia germicida in vitro; 
5. Posteriormente, calçar luvas de procedimento;
6. Posicionar corretamente o braço do paciente, inclinando-o para baixo, na altura do ombro; 
7. Se o torniquete for usado para seleção preliminar da veia, pedir para que o paciente abra e feche a mão. Afrouxar o torniquete e esperar cerca de 2 minutos para usá-lo novamente;
8. Fazer a antissepsia do local da punção com álcool etílico a 70% (em gaze ou algodão), em movimento circular do centro para a periferia. Pode-se também usar álcool etílico em gel 70%, álcool isopropílico 70% ou álcool etílico iodado 10%;
9. Garrotear o braço do paciente por não mais de 1 minuto (idealmente até 3 segundos). Isso evita hemoconcentração e falsos resultados nos parâmetros hematológicos; 
10. Retirar embalagens, rosquear a agulha no adaptador (coleta a vácuo) ou acoplar seringa/agulha;
11. Fazer a punção (agulha com ângulo de 30o ) com o bisel voltado para cima. Se necessário, para melhor visualizar a veia, esticar a pele com a outra mão, sem tocar o local onde foi feita a antissepsia;
12. Caso haja outros exames além do hemograma, inserir tubo a tubo na sequência recomendada a seguir pelo CLSI (item Sequência de coleta para tubos plásticos de coleta de sangue). 
13. Caso a coleta seja feita com agulha/seringa, aspirar lentamente o sangue para o interior da seringa e também seguir o preenchimento dos tubos, conforme a sequência do CLSI. 139;
14. Retirar o garrote do braço do paciente;
15. Transferir o sangue tubo a tubo na sequência recomendada (sistema seringa/agulha); 
16. Para auxiliar a oclusão do local da venopunção, usar curativos ou adesivos hipoalergênicos;
17. Os tubos devidamente identificados (ideal que se faça na frente do paciente) devem ser enviados ao setor analítico do laboratório, sempre que possível acompanhados do pedido médico e no menor tempo possível.
· Esfregaço:
1. Colocar uma gota ( 2 a 3 mm de diâmetro) de sangue devidamente homogeneizado (usando tubo de micro-hematócrito) aproximadamente a 1 cm do final de uma lâmina para microscopia limpa, seca e isenta de pó e gordura e apoiada em uma superfície plana ( bancada de trabalho).
2. Com o polegar e o indicador segurar o final (extremidade) da lâmina distensora com ângulo de 30 a 45 graus em frente à gota de sangue na lâmina descrita acima. 
3. Puxar a lâmina distensora para traz até entrar em contato com a gota de sangue. Deixar o sangue espalhar-se e completar o angulo formado entre as duas lâminas.
4. Empurrar a lâmina distensora para frente a uma velocidade moderada e constante, até que a gota de sangue tenha sido espalhada em um filme moderadamente delgado. Observar para que o ângulo entre as lâminas seja mantido igual em todo o processo.
5. Secar a distensão ao ar por agitação ou por meio de um ventilador.
6. Identificar as lâminas com número seqüencial do setor e com as iniciais do nome do paciente, usando lápis dermográfico.
7. Limpar a lâmina distensora utilizando uma gaze embebida em solução fisiológica.
8. Repetir o processo para todos os hemogramas solicitados.
	Interpretação do resultado: 
· Leitura e análise de hemácias:
As hemácias têm a forma homogênea de corpúsculos circulares, bicôncavos e de tamanho relativamente uniforme, com diâmetro médio de 8 μm. Na análise microscópica de esfregaços do sangue, apenas as faces achatadas são observadas e, portanto, as hemácias são vistas como células circulares com coloração central mais tênue, correspondente às regiões bicôncavas.
Codócitos:
Sinônimo de hemácias em alvo. A hemácia apresenta dupla biconcavidade de tal maneira que, quando projetada em um plano, a hemoglobina é visualizada em uma pequena faixa periférica e, geralmente, na parte central, o que lhe dá o aspecto “em alvo”. 
Podem ser encontrados nas hemoglobinopatias (SS, SC), talassemias, hepatopatias, em pacientes esplenectomizados e na anemia ferropriva.
Esferócitos
São eritrócitos com a biconcavidade reduzida. Quando visualizados no microscópio perdem a zona clara central, são mais densos e ocorre redução do diâmetro, em comparação com os demais eritrócitos. Por isso, também são chamados de microesferócitos.
Pode ser causado por defeitos genéticos nas proteínas de membrana ou pode ser adquirida, aparecendo nos casos de anemia hemolítica autoimune.
Eliptócitos/Ovalócitos
São eritrócitos que apresentam formas ovaladas e eliptocíticas. As causas dessa alteração são defeitos genéticos nas proteínas do citoesqueleto da célula.
Drepanócitos
Sinônimo de hemácias em forma de foice. Os eritrócitos adquirem essa forma devido a presença da Hemoglobina S, que polimeriza e se precipita na membrana da célula, ocasionando a deformação.
É encontrado nas doenças falciformes.
Dacriócitos
São eritrócitos em forma de gota ou lágrima. A deformação ocorre quando as células passam nas fenestrações entre cordões e sinus medulares do baço, sofrendo estiramento além dos limites da elasticidade.
É muito comum na mielofibrose, devido à hematopoese extramedular (o baço produz células sanguíneas devido a hipocelularidade da medula óssea). Pode ser encontrado também nas talassemias, anemias hemolíticas e em pacientes esplenectomizados.
Equinócitos
São hemácias com a membrana irregular, apresentando espículas regularmente distribuídas.
In vitro pode ser artefato. In vivo decorre de hiperuremia, tratamento com heparina IV, hipotireoidismo e após transfusões sanguíneas.
Acantócitos
São hemácias com a membrana irregular, apresentando espículas irregularmente distribuídas.
In vitro pode ser artefato. In vivo decorre de hepatopatias, diminuição da função do baço e esplenectomia.
Esquizócitos
São eritrócitos fragmentados, irregularmente contraídos e mordidos.
São causados por traumas mecânicos, válvulas cardíacas artificiais, agressão térmica nas queimaduras e agressão química pelo uso de fármacos oxidantes. Se a fragmentação for significativa, o paciente irá apresentar manifestações clínicas de anemia hemolítica.
Aparecem também em condições clínicas como coagulação intravascular disseminada (CIVD), púrpura trombocitopênica trombótica (PTT) e Síndrome Hemolítico-Urêmica (SHU).
· Leitura:
Os glóbulos brancos formam o grupo mais heterogêneo de células do sangue, tanto do ponto de vista morfológico quanto fisiológico. Embora os leucócitos desempenhem papel de defesa do organismo, cada subtipo leucocitário detém funções bastante específicas e distintas entre si, que,em conjunto, estruturam o sistema imunológico. Os leucócitos são agrupados em duas categorias diferentes: os leucócitos mononucleares e os polimorfonucleares. Os primeiros incluem os linfócitos, plasmócitos e os monócitos, cuja característica peculiar é a de possuir um núcleo único e uniforme. Os últimos, também chamados de granulócitos, pela presença de granulação citoplasmática, incluem os neutrófilos, eosinófilos e basófilos e possuem um núcleo multiforme e segmentado. Apesar de todos os leucócitos se originarem de um precursor hematopoético comum na medula óssea, os precursores intermediários são distintos e são influenciados por diferentes fatores de crescimento.
GRANULÓCITOS
Neutrófilo 
Os neutrófilos possuem quatro tipos diferentes de grânulos em seu citoplasma: grânulos azurófilos ou primários, grânulos específicos ou secundários, grânulos terciários ou de gelatinase, e vesículas secretoras.
Os neutrófilos têm papel crucial na defesa do organismo, fagocitando e digerindo micro-organismos.Uma vez no local da infecção, o neutrófilo pode tanto fagocitar o micro-organismo ou liberar para o meio extracelular o conteúdo de seus grânulos ricos em enzimas antimicrobianas e superóxidos de oxigênio.
O processo de maturação mieloide – desde mieloblasto até neutrófilo segmentado – dura em torno de 14 dias, o neutrófilo tem vida-média em circulação bastante curta, de 7,6 horas.
Basófilo
Os basófilos também se originam e amadurecem na medula óssea e, após os últimos passos de diferenciação, são colocados na corrente sanguínea. São caracterizados pela presença de grânulos citoplasmáticos que se tingem com corantes básicos nas colorações usais em cor purpúrea escura. Produzem diversos mediadores inflamatórios, sendo um dos principais deles a histamina, além de possuírem receptores de IgE na membrana plasmática.
Além dos grânulos basófilos que distinguem este subtipo celular, morfologicamente caracteriza-se como uma célula relativamente grande, com diâmetro entre 10 e 15 μm, citoplasma abundante, róseo, rico em grânulos basófilos. Também possuem estruturas citoplasmáticas elétron-densas chamadas de corpos lipídicos, ricos em ácido aracdônico. O núcleo multilobulado apresenta cromatina densa.
Eosinófilos 
Os eosinófilos originam-se na medula óssea e têm a característica peculiar de apresentar no citoplasma grânulos com alta afinidade pela eosina, um corante ácido utilizado nas colorações de Romanowsky. Estão presentes predominantemente no sangue periférico e têm função importante na mediação de processos inflamatórios associados à alergia, à defesa contra parasitas metazoários helmínticos, em certos distúrbios cutâneos alérgicos e neoplásicos.
Morfologicamente, apresentam diâmetro de aproximadamente 8 μm, citoplasma abundante, rico em grânulos eosinofílicos (em torno de vinte por célula) e núcleo de cromatina densa bilobulado.
AGRANULÓCITOS
Linfócito
Nas colorações de Romanowsky são células de tamanho pequeno (6 a 15 μm), regulares e arredondadas, relação nucleocito-plasmática elevada com o núcleo ocupando cerca de 90% da área da célula, citoplasma escasso e basófilo, núcleo regular e esférico, de tonalidade azul-arroxeada e com cromatina sem nucléolo evidente. São também frequentes formas maiores (até 20 μm), com citoplasma mais abundante e num certo número deles observam-se granulações escassas azurófilas, de 5 a 15 por célula; tal subtipo é chamado de grande linfócito granular (LGL = Large Granular Lymphocyte) e agrupa os linfócitos NK (Natural Killer) e um subgrupo de linfócitos T maduros, os T-LGL. A estimulação ou ativação dos linfócitos leva a alterações fisiológicas que culminam também por alterar a sua morfologia, assumindo uma forma mais imatura (linfoblasto) ou mesmo linfoplas-mocitoide. O citoplasma torna-se mais abundan te e basófilo, e o núcleo passa a apresentar nucléolo mais evidente, com cromatina mais frouxa.
Monócito
Os monócitos, macrófagos e seus precursores originam-se na medula óssea a partir de precursores vinculados à diferenciação em fagócitos mononucleares, sendo os mais imaturos chamados monoblastos, e os de diferenciação intermediária, promonócitos, encontrados somente na medula óssea em condições normais. Após entrarem em circulação, os monócitos têm meia-vida curta de 8,4 horas, logo migrando para diferentes tecidos, onde recebem o nome de macrófagos tissulares de morfologia e fisiologia semelhantes às dos monócitos. Nos diferentes tecidos, participam da fagocitose de células mortas, senescentes, corpos estranhos, regulação da função de outras células, processamento e apresentação de antígenos, reações inflamatórias e destruição de micróbios e células tumorais.
Quanto à sua morfologia, são células de tamanho entre 12 e 15 μm de diâmetro, variando bastante em forma, mas distinguíveis dos outros leucócitos do sangue. O citoplasma é abundante, de coloração cinza ou azul-claro acinzentada, com fina granulação. Esta granulação com aspecto de fina poeira dá ao citoplasma uma aparência de vidro fosco. É comum encontrar vacúolos citoplasmáticos nessas células.
Hematopoiese:
Hematopoiese é o processo de formação, desenvolvimento e maturação dos elementos do sangue (eritrócitos, plaquetas e leucócitos) a partir de um precursor celular comum e indiferenciado conhecido como célula hematopoiética pluripotente, ou célula-tronco, unidade formadora de colônias (UFC), hemocitoblasto ou stem-cell. As células-tronco que no adulto encontram-se na medula óssea são as responsáveis por formar todas as células e derivados celulares que circulam no sangue.
A hematopoiese é função do tecido hematopoiético, que aporta a celularidade e o microambiente tissular necessários para gerar os diferentes constituintes do sangue. No adulto, o tecido hematopoiético forma parte da medula óssea e ali é onde ocorre a hematopoiese normal. A medula óssea é o órgão mais importante da gênese das mais diversas células sanguíneas pois lá estão as células-tronco que dão origem a células progenitoras de linhagens mielocíticas, linfocítica, megacariócitos e eritroblastos.
· Leitura de plaquetas:
As plaquetas são as células do sangue, responsáveis por elaborados processos bioquímicos envolvidos na hemostasia, trombose e coagulação do sangue. São formadas na medula óssea a partir da fragmentação do citoplasma do seu precursor, o megacariócito, uma célula gigante e multilobulada presente na medula. Do ponto de vista da morfologia, as plaquetas são fragmentos citoplasmáticos anucleados de tamanho variado, entre 2,9 e 4,3 μm, e espessura entre 0,6 e 1,2 μm. É importante salientar que o tamanho das plaquetas varia de um indivíduo para outro. Apresenta-se como uma célula arredondada ou ovoide, citoplasma azul-claro com grânulos vermelho-purpúreos homogeneamente distribuídos.
Possuem um tempo de vida entre 8 e 10 dias. Depois disso são destruídas e retiradas de circulação pelo baço. 
· Contagem diferencial de Leucócitos:
A contagem é realizada com o contador de células sanguíneas.
Referencias: 
Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/ Medicina Laboratorial (SBPC/ML): Coleta e Preparo de Amostra Biológica, 47. 2013, São Paulo.
ZAGO, FALCAO, PASQUINI. Tratado de hematologia – 2013. Atheneu, 1ªEd., 2013.
Renato Failace. Hemograma – Manual de interpretação. Artmed, 5ª Ed., 2009.