Aula de Estudos Laboratoriais

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ESTUDOS LABORATORIAIS
David Júnio de Oliveira Pôppe
Salvador, Bahia
2020
Cultura de Células, Biologia Molecular, Testes Microbiológicos e Estudos Histológicos
•Situação controlada;
•Planejamento prévio;
•Redução de 
subjetividade;
•Instrumentos precisos 
de coleta;
•Análise de material.
Pesquisa Laboratorial
CULTURA DE CÉLULAS 
“É um processo complexo 
pelo qual as células são 
cultivadas sob condições 
controladas fora do seu 
ambiente natural.” 
TECIDOS 
Humanos
Animais
Vegetais
Peres & Curi., 2005,
TREINAMENTO E 
CONHECIMENTO
ATENÇÃO AOS 
DETALHES 
CONCENTRAÇÃO
TÉCNICA 
ASSÉPTICA
ORGANIZAÇÃO
Cells Culture Basics Handbook. Thermo Fisher Scientific, 2016.
O QUE PRECISAMOS PARA TRABALHAR 
COM CULTURA DE CÉLULAS? 
INCUBADORA DE CO2
CAPELA DE FLUXO 
LAMINAR VERTICAL
CENTRÍFUGA 
CÂMARA DE NEUBAUER
REAGENTES E SUPLEMENTOSBANHO-MARIA MICROSCÓPIO 
INVERTIDO 
ANCORAGEM
• Proliferam e ocupam a superfície de 
cultura (confluência);
• Inibição por contato (passagem);
• Necessidade de dissociação do substrato 
enzimaticamente/mecanicamente;
ADERIDAS 
(fibroblastos)
• Proliferam e depletam o meio de 
nutrientes;
• Sem inibição por contato (passagem); 
• Sem necessidade de dissociação do 
substrato.
SUSPENSÃO 
(hematopoiéticas)
Peres & Curi., 2005.
PRIMÁRIA
LINHAGEM 
CONTÍNUA
SECUNDÁRIA TRANSFORMADA
TIPOS
CULTURA DE CÉLULAS 
Primária
Necessidade de isolamento 
para cada experimento;
Proliferação lenta;
Exigente às condições da 
cultura;
Tempo de vida limitado;
Senescências;
Linhagens celulares.
Peres & Curi., 2005.
2D 3D
• Baixa densidade 
celular;
• Morfologia celular 
alterada;
• Diferenciação celular 
parcial; 
• Ineficiente para 
aumentar o 
crescimento.
• Heterogeneidade 
celular superior;
• Maior gradiente de 
nutrientes e O2;
• Ambiente de 
cultura onde a 
adesão célula-
célula é maior do 
que a adesão 
célula-material.
CULTURA DE CÉLULAS 
CÉLULAS 
RETIRADAS DA 
CULTURA 
PRIMÁRIA
PASSAGEM DE 
CÉLULAS
SUBCULTIVO
SECUNDÁRIA
ATCC® ANIMAL CELL CULTURE GUIDE, 2014
PASSAGEM DE CÉLULAS 
ATCC® ANIMAL CELL CULTURE GUIDE, 2014
“Linhagens aderentes requerem a 
{des}adesão para propagação.”
CENTRIFUGAR – SUSPENSÃO – CONTAR – PASSAGEM – PLAQUEAR
Células aderidas 
em garrafa 
de cultura
Solução PBS Solução tripsina-
EDTA
Desaderência
celular
lavagem adição
n
e
u
t
ra
liz
a
çã
o
AZUL DE TRYPAN
MEMBRANA 
CELULAR 
ÍNTEGRA
CORANTE 
INATIVO
CÉLULAS 
BRANCAS
MEMBRANA 
CELULAR 
ROMPIDA
CORANTE 
ATIVO
CÉLULAS 
AZUIS
CÉLULAS VIÁVEIS X CÉLULAS INVIÁVEIS
ATCC® ANIMAL CELL CULTURE GUIDE, 2014
❑MANUAL 
• Hemocitômetro: Câmara de Neubauer
CONTAGEM DE CÉLULAS 
❑AUTOMÁTICO 
• Contadores automáticos
ATCC® ANIMAL CELL CULTURE GUIDE, 2014
Regiões de contagem 1, 2, 3 e 4
Contar o número de células no grumo
Célula sobre a linha: Contar somente as superiores e da direita
ARMAZENAMENTO E MANUTENÇÃO
Peres & Curi., 2005.
PREPARAR PLACAS, 
FRASCOS E MEIOS 
ANTECIPADAMENTE
DESCONGELAMENTO 
RÁPIDO
REMOVER E COLOCAR 
NO BANHO-MARIA 
IMEDIATAMENTE
CONGELAMENTO RÁPIDO
CONGELAMENTO LENTO
VITRIFICAÇÃO
CRESCIMENTO CELULAR ATIVO
MEIO
90% SORO FETAL BOVINO + 10% CRIOPROTETOR
DMSO (DIMETILSULFÓXIDO)
GLICEROLARMAZENAMENTO
• Comportamento homogêneo e 
constante; 
• Possiblidade de conhecer as 
respostas de tipos celulares 
específicos; 
• Manipulação da expressão gênica; 
• Maior controle do ambiente (pH, 
temperatura, tensão de O2 e 
CO2); 
• Redução na utilização de 
animais nas pesquisas 
científicas. 
VANTAGENS LIMITAÇÕES
• Diferenças no fenótipo em 
relação a situação in vivo; 
• Contaminação:
• Química;
• Bacteriana;
• Fúngica.
• Ausência de matriz extracelular. 
Peres & Curi., 2005,
Cells Culture Basics Handbook. Thermo Fisher Scientific, 2016.
ARTIGO MODELO
1953
James Watson
Francis Crick 
ESTRUTURA QUÍMICA 
DO DNA
ESTRUTURA MOLECULAR
Citoplasma
Anti-Códon
Códon
Pesquisar 
risco de 
desenvolver 
uma doença 
de caráter 
hereditário
Pesquisar 
de DNA 
estranho ao 
indivíduo 
em um 
tecido
Determinar 
comporta-
mento
biológico de 
um tecido 
tumoral
PÔR QUE UTILIZAR 
A BIOLOGIA 
MOLECULAR?
ELISA BLOTTING PCR
CITOME-
TRIA DE 
FLUXO 
Molina e Tobo, 2004,
Pinho, 2006,
Strachan et al, 2002.
ELISA
TESTE IMUNOENZIMÁTICO QUE 
PERMITE A DETECÇÃO DE ANTÍGENOS 
OU ANTICORPOS ESPECÍFICOS
Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay
DIRETO INDIRETO
SANDUÍCHE COMPETIÇÃO
Pinho, 2006,
Strachan et al, 2002.
ELISA
Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay
Diagnóstico 
de doenças 
infecciosas;
Diagnóstico 
de doenças 
autoimunes 
e alergias;
Teste para 
diagnóstico 
de infecção 
HIV;
Teste 
sorológico 
para Doença 
de Chagas.
Pinho, 2006,
Strachan et al, 2002.
BLOTTING
“TÉCNICA UTILIZADA PARA ANÁLISE 
DE PROTEÍNAS POR MEIO DA 
TRANSFERÊNCIA DE BIOMOLÉCULAS DE 
UM GEL PARA UMA MEMBRANA.” 
Southern Blotting - Northern Blotting - Western Blotting
DNA RNA PROTEÍNA
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL 
DE DOENÇA GENÉTICA
DETECTAR MUDANÇAS NOS 
NÍVEIS DE EXPR. GÊNICA
DETECÇÃO E CONFIRMAÇÃO 
DE ANTICORPO ANTI-HIV 
Molina e Tobo, 2004,
Pinho, 2006,
Strachan et al, 2002.
BLOTTING
• solubilização da molécula com 
detergente - dodecil sulfato de 
sódio (SDS)
Etapa 1
• o antígeno viral fracionado em gel 
é adsorvido numa tira de 
nitrocelulose;
Etapa 2
• é adicionada amostra diluída que 
contém anticorpos primários 
específicos;
Etapa 3
• é aplicada uma corrente elétrica 
entre a placa movimentando as 
moléculas pela membrana;
Etapa 3
• lavagem e incubação com o 
anticorpo secundário e composto 
conjugado;
Etapa 4
• nova lavagem e adição de solução 
substrato-cromógeno.Etapa 5
Pinho, 2006,
Strachan et al, 2002.
Anticorpos primários 
específicos
Amostra aplicada numa 
tira com uma pipeta
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
Consiste na amplificação enzimática específica do DNA, 
visando à produção de milhões de cópias dessa sequência.
DNA Polimerase + Primers (oligonucleotídeos) + DNA
Molina e Tobo, 2004,
Pinho, 2006,
Strachan et al, 2002.
AMPLIFICAÇÃO 
DA REGIÃO DE 
INTERESSE
PCR
Esta amplificação ocorre durante repetidos ciclos de temperatura
TERMOCICLADORES
Reação em Cadeia da Polimerase
94ºC
DESNATURAÇÃO
45ºC a 70ºC
HIBRIDIZAÇÃO
ANELAMENTO
72ºC
EXTENSÃO
POLIMERIZAÇÃO
APLICAÇÕES:
• IDENTIFICAÇÃO RÁPIDA DE MARCADORES; 
• ANÁLISE DE MUTAÇÕES CONHECIDAS;
• MUTAÇÕES EM ONCOGENES;
• DETECTAR GENES SUPRESSORES DE TUMOR;
• MEDICINA FORENSE;
• TESTE DE PATERNIDADE.
RT-PCR: PCR em Tempo Real 
(TRANSCIRPTASE 
REVERSA) 
Molina e Tobo, 2004,
Pinho, 2006,
Strachan et al, 2002.
Sinal 
Luminoso
Sinal 
Eletrônico
Líquido contém 
o complexo: 
Células + Ac + 
Fluorocromos CITOMETRIA DE 
FLUXO
Técnica utilizada para contar, 
examinar e classificar partículas 
microscópicas suspensas em meio 
líquido em fluxo. Dang et al 2002,
Kelm et al 2003,
Koike et al 2007,
Fok and Zandstra 2005.
CITOMETRIA DE FLUXO
Fenotipagem
de leucócitos;
Fenotipagem
de células 
tumorais;
Análise de 
DNA;
Análise da 
função dos 
neutrófilos;
Expressão 
gênica.
Parâmetros
Medidos
Volume 
Celular
Pigmentos 
Celulares
DNA E 
RNA
CromossomosCitocinas
Antígenos
Proteínas
Dang et al 2002,
Kelm et al 2003,
Koike et al 2007,
Fok and Zandstra 2005.
A
R
T
I
G
O
M
O
D
E
L
O
“Muitas doenças têm uma causa microbiana que 
pode ser caracterizada e monitorada por testes 
microbiológicos.”
COLETA 
DA 
AMOSTRA
SALIVA
TECIDO 
INFECTA-
DO
DOENÇAS 
DA 
MUCOSA 
ORAL
(Pipeta)
Estimulada 
Nâo-estimulada
(Seringa)
Secreção 
purulenta
(Cotonete)
Materiais 
membranosos
Atlas of Oral Microbiology from Healthy Microflora to Disease
PROCESSAMENTO
Para obter culturas puras de bactérias individuais, as 
amostras clínicas orais geralmente requerem 
processamento e diluição antes da inoculação.
SOLUÇÃO 
PRÓPRIA DA 
AMOSTRA
SOLUÇÃO 
TAMPÃO 
FOSFATO (pH 
7.2)
Atlasof Oral Microbiology from Healthy Microflora to Disease
GRAU DE DILUIÇÃO – MÉTODO DE INOCULAÇÃO
AMBIENTE DE INCUBAÇÃO – TEMPO DE CRESCIMENTO
ESPÉCIES MICROBIANAS
ÁGAR MITIS 
SALIVARIUS
ÁGAR DE INFUSÃO 
CÉREBRO E CORAÇÃO
ÁGAR 
ROGOSA
ÁGAR TRIPTICASEÍNA 
DE SOJA
ESCOLHA DO MEIO
MÉTODO DE 
ESPALHAMENTO
MÉTODO DA 
GOTA
MÉTODO EM 
ESPIRAL
Métodos de Inoculação
Atlas of Oral Microbiology from Healthy Microflora to Disease
MÉTODOS DE INOCULAÇÃO
ESPALHAMENTO
GOTAESPIRAL
Ramos e Winkelhoff, 2017,
Koike et al 2007,
Fok and Zandstra 2005.
TESTES BIOQUÍMICOS
Os testes bioquímicos estão entre os métodos 
mais importantes de identificação microbiana. 
F E R M E N T A Ç Ã O D E C A R B O I D R A T O S – V E R M E L H O D E M E T I L A
Á C I D O C Í T R I C O – P R O D U Ç Ã O D E S U L F E T O D E H I D R O G Ê N I O
ESFREGAÇO
COLORAÇÃO
IDENTIFICAÇÃO 
MICROBIANA
• ESPOROS
• CÁPSULAS
• FLAGELO
• HIFAS
BACTÉRIA GRAM-POSITIVA
BACTÉRIA GRAM-NEGATIVA
DEMAIS 
TÉCNICAS
Atlas of Oral Microbiology from Healthy Microflora to Disease
MICROSCOPIA
ESTEROMICROSCÓPIO M. E. de VARREDURAM. C. de VARREDURA à 
LASER (CLSM)
Atlas of Oral Microbiology from Healthy Microflora to Disease
SENSIBILIDADE AOS 
ANTIBIÓTICOS
ANTIBIOGRAMA
A limitação do teste de sensibilidade in 
vitro é que ele provavelmente subestima
a atividade potencial in vivo de agentes 
antimicrobianos. Ramos e Winkelhoff, 2017,
Koike et al 2007,
Fok and Zandstra 2005.
A
R
T
I
G
O
M
O
D
E
L
O
“A HISTOLOGIA É CIÊNCIA QUE ESTUDA AS CÉLULAS 
NO CONTEXTO DA ESTRUTURA TECIDUAL E A 
INTERRELAÇÃO DELA COM OS CONSTITUINTES DA 
MATRIZ EXTRACELULAR.” 
COLETA DO 
MATERIAL
FIXAÇÃO E 
ENCAMINHA-
MENTO
PROCESSA-
MENTO 
LABORATO-
RIAL
COLORAÇÃO
DIAGNÓS-
TICO 
LABORATO-
RIAL
ETAPAS:
Bogliolo, 2016,
Robins, 2010,
Neville, 2009.
Tecido de um determinado 
organismo removido por 
meio de biópsia, durante 
uma cirurgia ou mesmo 
post-mortem
COLETA DO 
MATERIAL
Bogliolo, 2016,
Robins, 2010,
Neville, 2009.
FORMOL 10%
Líquido de Bouin
FIXAÇÃO E 
ENCAMINHAMENTO
Preservar as características morfológicas do tecido por 
reduzir metabolismo tecidual e impedir autólise:
1. Conservação na forma de formol a 40%;
2. Diluição no ato de colocação da amostra: 3:1;
3. Escolha recipiente: volume de líquido 10x maior
que tamanho da peça;
4. Coletor ou vidro: bem tampado;
5. Recipiente: nome do paciente, idade, nome do
profissional, local da biópsia e data.
Inibe a contaminação microbiana e enrijece o tecido
Bogliolo, 2016,
Robins, 2010,
Neville, 2009.
FICHA DE REQUISIÇÃO E REGISTRO EM 
LIVRO DE PROTOCOLO
FASE 
LABORATORIAL E 
MACROSCOPIA
Bogliolo, 2016,
Robins, 2010,
Neville, 2009.
LAPTAP – UEFS.
Desidratação
Clarificação ou 
Diafanização
Inclusão
Microtomia
Coloração
FASE LABORATORIAL
Série de 
soluções 
alcoólicas em 
concentrações 
diferentes, 
chegando até 
o álcool 100%;
Remover o 
álcool e 
preparar o 
tecido para a 
penetração 
da parafina, 
utilizando o 
xilol;
Forma-se 
um bloco de 
parafina, 
que contém 
o espécime 
em seu 
interior;
Cortes de 5 
a 15 μm, 
finos e 
transparen-
tes, 
montagem 
em lâminas 
de vidro;
Bogliolo, 2016,
Robins, 2010,
Neville, 2009.
COLORAÇÃO
APÓS A MICROTOMIA, AS CÉLULAS E O MATERIAL EXTRACELULAR SÃO 
HABITUALMENTE TRANSPARENTES E OS CORANTES MELHORAM A 
VISUALIZAÇÃO DAS ESTRUTURAS TECIDUAIS. 
HEMATOXILINA
EOSINA
ÁCIDO PERIÓDICO 
DE SHIFF
GROCOTT 
GOMORI
ZIEHL
NEELSEN
Bogliolo, 2016,
Robins, 2010,
Neville, 2009.
PRINCIPAIS COLORAÇÕES
•HE, FEULGEN, PAPANICOLAU, SHORR, GIEMSA, AZUL DE TOLUIDINA, 
METIL GREEN-PIRONINA
NÚCLEO E CITOPLASMA
•FONTANA-MASSONMELANÓCITOS
•VIOLETA CRESIL, AZUL DE TOLUIDINA, GOLGI (PRATA)TECIDO NERVOSO
•PAS, PAS ALCIAN BLUE pH 1,0 OU pH 2,5SECREÇÕES CELULARES
•AB-SAFRANINA, GEIMSA, AZUL DE TOLUIDINA, SIRIUS RED EM pH 10,2MASTÓCITOS E EOSINÓFILOS
•PASGLICOPROTEÍNAS NEUTRAS
•PAS-ALCIAN BLUE EM pH 1,0 OU pH 2,5PROTEOGLICANAS
Atlas of Oral Microbiology from Healthy Microflora to Disease
D E M O N S T R A Ç Ã O D E A N T Í G E N O S N O S 
C O R T E S H I S T O L Ó G I C O S A T R A V É S D E 
A N T I C O R P O S E S P E C Í F I C O S
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Quando o 
clínico-
patológicos 
são 
inconclusivos;
Identificação 
de materiais 
secretados 
por células;
Determinação 
do tecido de 
origem de uma 
neoplasia;
Classificação 
de linfomas;
Detecção 
células 
neoplásicas 
metastáticas;
Distinção 
entre tumores 
histologicamen
te semelhante.
•GLICOPROTEÍNA EXPRESSA EM CÉLULAS ENDOTELIAISCD31
•MARCADOR CÉLULAS HEMATOPOIÉTICAS PRIMITIVAS E ENDOTELIAISCD 34
•GLICOPROTEÍNA RESTRITA A LEUCÓCITOSCD 45 RB
•CITOPLASMA CÉLULAS MIELÓIDES E MACRÓFAGOSCD 68
•MARCADORES EPITELIAISCITOQUERATINAS AE1, AE3, CK7, CK20
•TUMORES DE MÚSCULO LISOCOLÁGENO TIPO IV
•MARCADOR DIFERENCIAÇÃO MUSCULARDESMINA
•DIFERENCIAÇÃO VASCULARFATOR VIII
•MELANOMAPROTEÍNA S-100
•CARCINOMAS RENAIS, MAMÁRIOS, ENDOMETRIAIS E PULMONARESVIMETINA
PRINCIPAIS MARCADORES
ETAPAS:
TIPOS
DIRETO
INDIRETO
PAP
ABP
EBP
EFA
LÂMINA 
HISTOLÓGICA 
PROCESSADA
RECUPERAÇÃO 
ANTIGÊNICA
APLICAÇÃO DE 
AC. + 
CROMÓGENO
ANÁLISE E 
INTERPRETA-
ÇÃO
Bloquear 
reações de 
proteínas e 
enzimas 
endógenas a 
fim de inibir 
ligações 
inespecíficas 
do anticorpos.
Bloquear a 
atividade da 
peroxidase 
tecidual a fim de 
inibir ligações 
cromógeno a ela.
FALSO-
POSITIVO
IMUNO-HISTOQUÍMICA
ARTIGO MODELO
• ALVES, VAF; BACCHI, CE; VASSALO, J – Manual de imunohistoquímica. São Paulo: Sociedade Brasileira de Patologia – 1999.
• BEÇAK, W.; PAULETE, J. Técnicas de Citologia e Histologia. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos Editora. 1976.
• COSTA, A. C; CHAVES, P. R. Manual de Técnicas Histológicas. 3ª Ed. Portugália Editora. Lisboa, 1941.
• MAIA, V. Técnica Histológica. 2ª Ed. São Paulo: Atheneu, 1979.
• MICHALANY, J.Técnicas Histológicas em Anatomia Patológica. Editora pedagógica Universitária. São Paulo. 1991.
• ROSS, M. H.; PAULINA, W. Histologia: Texto e Atlas. 5ª Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2008.
• HARRISON, Maureen A.; RAE, Ian F. General techniques of cell culture. Cambridge University Press, 1997.
• WAENY, Paula de Oliveira. Cultivo e isolamento de células destinadas a transferência nuclear em bovinos: revisão de literatura. 2016.
• http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/cd08_08.pdf
• Jordan RCK, et al. Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology. Pat I: Molecular Methods. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2001;92(6):650-69.
• Strachan T, Read AP. Genética Molecular Humana. 2ª ed. Porto Alegre: Artmed; 2002. p. 576.
• United States Patent 5,656,493 Mullis, et al. August 12, 1997: System for automated performance of the polymerase chain reaction
• Farah SB. DNA Segredos e Mistérios. São Paulo: Sarvier; 1997. p. 276.
• Jacques N. Molecular biological techniques and their use to study streptococci in dental caries. Aust Dental Journal 1998,43(2):87-98.
• Silva FB, Sousa SMG. Aplicações da biologia molecular na odontologia:conceitos e técnicas. Unimep, 2002;14(2), p.7-14.
• PINHO MSL. Pesquisa em Biologia Molecular: como fazer? Rev bras Coloproct, 2006;26(3): 331-336
• John Crocker and Paul G. Murray. Molecular Biology in Cellular Pathology, 2003. p.1-343
• Molina AL, Tobo PR. Uso das técnincas de biologia molecular para diagnóstico. einstein. 2004; 2(2):140
• Cury PR, Canavez F, de Arau´jo VC, Furuse C, de Arau´jo NS. Substance P regulates the expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinase in cultured human
gingival fibroblasts. J Periodont Res 2008; 43: 255–260.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/cd08_08.pdf
OBRIGADO!