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CENTRO UNIVERSITÁRIO – CATÓLICA DE SANTA CATARINA CURSO DE BIOMEDICINA 5ª FASE ALINE VIEIRA PANSTEIN JULIA KASPROWICZ MARAIKA SOEHTJE MIKAELA BORTOLI PROJETO INTEGRADOR: CASO 1 JOINVILLE Junho, 2020 SUMÁRIO 1. ESTUDO DE CASO .................................................................................... 3 2. POSSIBILIDADE DE CONTUDA PARA O CASO .................................. 4 3. LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA ............................................................. 7 3.1 REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................ 7 3.2 CONDUTAS PARA O DIAGNÓSTICO / SOLUÇÃO DO PROBLEMA ........... 8 3.3 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS.......................................................................... 11 3.4 CONDUTA TERAPÊUTICA ........................................................................... 14 3.5 INOVAÇÕES NA ÁREA ................................................................................. 16 REFERÊNCIAS ............................................................................................ 20 ANEXOS ........................................................................................................ 22 3 1. ESTUDO DE CASO O presente estudo visa relatar o caso de um paciente do sexo masculino, 19 anos, branco, que procurou atendimento no serviço de urgência e emergência de sua região apresentando quadro gripal há três dias, cefaleia intensa, vômitos, sudorese, cansaço e dores no corpo. O mesmo relata não ser a primeira vez que sente essas dores de cabeça que, segundo ele, parecem que “alguém está dando facadas na sua cabeça”. Exames laboratoriais anteriores, trazidos pelo paciente, evidenciaram contagem de leucócitos de 11.472/mm3 com presença de 10% de bastões e contagem de plaquetas de 170.000/mm3. No exame físico, apresentou linfadenomegalias na região axilar e inguinal, além de hepatoesplenomegalia. Haviam sinais de sangramento nas regiões de punção (realizada para coleta de exames), além equimoses e petéquias nos membros superiores. O paciente então foi internado na unidade de terapia intensiva, onde foram solicitados hemograma e tomografia. O laudo da tomografia computadorizada de crânio evidenciou uma ocasião volumosa de caráter hemorrágico intraparenquimatosa à esquerda com desvio da cisura média. Na investigação laboratorial (conforme Figura 1), apresentava: Figura 1. Relatório análise de hematologia Fonte: Projeto Integrador, 2020. Este hemograma teve sua lâmina revisada, com observação dos seguintes resultados: neutrófilo 40%, blastos 20%, linfócitos 17%, monócitos 20%, basófilos 1% e eosinófilos 2%. Outros exames realizados: Plaquetas: 20.000/mm3 Desidrogenase láctica (DHL): 7.850 IU/L Glicemia sérica de jejum: 153 mg 4 AST: 45 U/L ALT: 65 U/L Gama-GT: 74 U/L Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTP): 37 s (a relação P/N de 1,12 [plasma normal (N) de 33 s e plasma do paciente (P) de 37 s]) Tempo de protrombina (TP): 67,10% (com a relação P/N de 1,38 [plasma normal (N) de 13,20 s e plasma do paciente (P) de 18,20 s]) (O RNI = 1,48) Foi então requisitada avaliação da equipe de hematologia, que solicitou exame de medulograma e sorologia para doenças infecto contagiosas e infecciosas. Além de transfusão imediata de plaquetas e concentrado de hemácias. O laudo do medulograma, apresentou medula óssea intensamente hipercelular, com presença de 56% de células blásticas e 27% de componentes da linhagem monocítica imaturas. A avaliação citoquímica da medula óssea revelou reação para a enzima peroxidase positiva em blastos. Resultado sorologia para hepatite, método ELISA. Resultado Paciente (Cut-off) Anti-HVA IgG 480 (200) Anti-HVA IgM 080 (200) HBsAg 183 (200) Anti-HBsAg 250 (220) Anti-HBc IgM 230 (230) Anti-HBc IgG 640 (230) Anti-HBeAg 480 (480) Anti-HCV 220 (280) Anti-HTLV I/II Negativo Teste para sífilis Negativo Chagas Negativo Resultado anticorpos IgM para Dengue (método ELISA): DO= 0,109 Interpretação: DO > 0,220 - reação reativa: presença de anticorpos IgM DO < 0,180 - reação não reativa: ausência de anticorpos IgM DO 0,180 - 0,220 - reação indeterminada: sorologia não conclusiva. 2. POSSIBILIDADE DE CONTUDA PARA O CASO Inicialmente, analisando os resultados laboratoriais do paciente, a presença de 20% de blastos no hemograma, segundo HOFFBRAND & MOSS (2018) é um indicativo de leucemia aguda. Correlacionando com o resultado do medulograma, onde evidenciou-se a presença de 5 56% de células blásticas e 27% de componentes da linhagem monocítica imaturas, além da avaliação citoquímica da medula óssea que revelou reação para a enzima peroxidase positiva em blastos, sendo esta específica para diferenciação em mielóide. Portanto temos como principal hipótese de diagnóstico para este paciente, uma leucemia mieloide aguda, que terá seu subtipo confirmado por meio de exames citogenéticos e de imunofenotipagem solicitados posteriormente (HAMERSCHLAK, 2010). Levando em conta a patogênese da LMA, os principais sintomas decorrem do acúmulo de células leucêmicas na medula óssea, o que explica a anemia, neutropenia, linfopenia e plaquetopenia apresentados pelo paciente (conforme indicado na Tabela 1). Aspectos clínicos como febre, cefaleia, equimoses e petéquias, linfadenomegalias e hepatoesplenomegalia são também algumas das manifestações clínicas observadas em pacientes leucêmicos. Uma vez que as células presentes na corrente sanguínea são levadas a todos os órgãos e tecidos, as células leucêmicas possuem predileção à tecidos vascularizados, e portanto, isso explicaria a hepatoesplenomegalia, correlacionada também com o valor aumentado de DHL, este por sua vez, indicativo de lesão em órgãos e/ou tecidos (REUTER, 2014). Com relação a tomografia computadoriza de crânio, onde o paciente apresentou uma hemorragia intraparenquimatosa, sabe-se que as doenças hematológicas representam 4 a 5,8% das causas de lesões cerebrais isquêmicas ou hemorrágicas, devido ao déficit plaquetário e consequente mecanismo de coagulação. Sendo assim, o acidente vascular encefálico (AVE) sofrido diz respeito à uma apresentação inicial de LMA (SILVA, et al. 2011). Tabela 1. Interpretação do exame hematológico Resultado Paciente VR (ANEXO 1) Interpretação WBC 37.390 /mm3 3.600 – 10.600 /mm3 Leucocitose Neutrófilos 40 % 50 – 65% Neutropenia relativa Linfócitos 17 % 25 – 40% Linfopenia relativa Monócitos 20 % 2 – 11% Monocitose relativa Eosinófilos 2 % 1 – 3% Normal Basófilos 1 % 0 – 1% Normal Blastos 20 % 0% Elevado Plaquetas 20.000 /mm3 140.000 – 450.000 /mm3 Plaquetopenia Fonte: As autoras, 2020. 6 Adicionalmente, foram realizados também exames sorológicos para doenças infecto contagiosas, como hepatite A, B e C, HTLV I e II, sífilis, chagas e dengue, que obtiveram resultados negativos ou dentro dos valores de referência, exceto pelos marcadores de hepatite B, que apresentaram algumas alterações. O marcador HBsAg diz respeito ao antígeno de superfície do vírus HBV, indicador da presença do mesmo no organismo, o qual encontrava-se um pouco abaixo do valor de cut-off, 183 de 200, porém nota-se que o Anti-HBc (IgM) está no limite, 230 de 230, e o Anti-HBc (IgG) está elevado, 640 de 230, estes estabelecem se a infecção pelo vírus é recente ou passada. Para melhor interpretação do caso e consequente confirmação se a hepatite é crônica, foi necessário solicitar nova reação para o HBsAg, utilizando outra técnica imunológica, além do marcador HBeAg, que indicaria a replicação viral ou não. Neste contexto, sabe-se que o Instituto Nacional deCâncer (INCA, 2020) enquadra a hepatite B como possível fator de risco para leucemias. Por fim, os exames bioquímicos (interpretados na Tabela 2), mostraram um aumento moderado nas enzimas hepáticas ALT e AST (marcadores de lesão hepática), estas podem estar relacionadas com a hepatoesplenomegalia, ou com a hepatite viral. Em casos crônicos, apresentam-se em níveis moderadamente elevados, em contrapartida, hepatites virais agudas, geralmente encontram-se 10 X mais elevados. Além disso, a enzima lactato desidrogenase (LDH), indicando perda da integridade da membrana ou lise celular, por possuir ampla distribuição, é considerada de baixa especificidade, podendo estar associada tanto com o AVE quanto com a hepatite e hepatoesplenomegalia (PINTO, 2017). Adiante, verificando-se o exame de glicemia, constata-se também que este encontra-se elevado, podendo indicar um quadro de Diabetes Mellitus, entretanto, para confirmação do mesmo, necessita-se realizar uma segunda dosagem. Sabe-se que pacientes em tratamento de leucemias agudas, devido aos medicamentos e quimioterapia intensiva, possuem um risco atrelado de desenvolverem hiperglicemias, tornando esse marcador importante de ser avaliado à diante (NASCIMENTO, 2013). Tabela 2. Interpretação do exame bioquímico Resultado Paciente VR* Interpretação DHL 7.850 IU/L 200 – 480 U/L Elevado Glicemia 153 mg/dL Até 99 mg/dL Elevado AST 45 U/L 11 – 39 U/L Moderadamente elevado ALT 65 U/L 11 – 45 U/L Moderadamente elevado 7 GGT 74 U/L 7 – 58 U/L Moderadamente elevado TTP 37 s 24 – 40 s Normal TP 18,20 s 10 – 14 s Elevado *Valor de referência utilizado, conforme bula Labtest. Fonte: As autoras, 2020. 3. LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA 3.1 REFERENCIAL TEÓRICO A Leucemia Mieloide Aguda (LMA) é caracterizada como uma doença neoplásica maligna do tecido hematopoiético, onde ocorrerá a proliferação anormal de células progenitoras da linhagem mieloide, como eritrócitos, leucócitos e plaquetas, resultando em deficiência de células sanguíneas maduras na circulação por consequente infiltração na medula, concomitantemente acompanhada de neutropenia, anemia e plaquetopenia (HELMAN, 2011). As manifestações clínicas observadas na LMA são provenientes da infiltração das numerosas células imaturas advindas da medula óssea, principal local de produção de todas as células sanguíneas, esta pode ocorrer em diversos tecidos tais como amígdalas, linfonodos (ínguas), pele, rins, sistema nervoso central (SNC) e outros (REUTER, 2014). Em um contexto de distúrbios hematológicos, órgãos que realizam hematopoese nos primeiros meses de vida, como o baço e fígado, tendem a retomar seu papel de hematopoese extramedular, concomitantemente ao baço, que remove células sanguíneas, as células mieloides mutadas são sequestradas na conjuntura da LMA, resultando no aumento de seu tamanho, e consequente hepatoesplenomegalia e linfadenomegalia, portanto, gerando um círculo vicioso (HOFFBRAND & STEENSMA, 2020; JACOB, 2018). No processo de maturação de células e diferenciação de células pluripotentes acontecerá uma parada e/ou uma dificuldade no processo, visto que essa parada tanto da diferenciação quanto de maturação pode ocorrer em qualquer fase da granulocitose, onde sucede-se diversas alterações celulares, as quais servem de base para classificar os diferentes tipos de LMA (REUTER, 2014). A primeira classificação realizada para distinguir os tipos de leucemia, fundada em 1976 feita pelo Grupo Cooperativo Francês, Americano e Britânico, define oito subtipos (M0 a M7), baseado nas características morfológicas e citoquímicas das células leucêmicas, porém, conforme classificações atualizadas foram lançadas, esta entrou em desuso. A Organização Mundial da Saúde (OMS) lançou em 2016, uma classificação atualizada para LMA onde incorpora informações genéticas como morfologia, imunofenótipo e apresentação clínica para 8 definir seis principais grupos: LMA com anormalidades genéticas recorrentes; LMA com características relacionadas à mielodisplasia; LMA relacionada à terapia; LMA não especificado de outra forma; sarcoma mieloide; e proliferação mieloide relacionada à síndrome de Down (KOUCHKOVSKY, 2016). A LMA pode ter origem em pacientes previamente saudáveis, independentemente de sua etiologia, ainda que pouco conhecida, uma mutação genética pode ser identificada em mais de 97% dos casos, segundo Kouchkovsky e Abdul-Hay (2016). As mutações genéticas são encontradas especificamente nos genes NPM1 (nucleofosmina), FLT3 (fms-related tyrosine kinase 3); CEPBA (CCAAT/enhancer binding protein α); MLL PTD (myeloid- lymphoid ou mixed-lineage leukemia), NRAS-(neuroblastoma RAS viral oncogen), BAALC (brain and acute leukemia gene), ERG (v-ets erytroblastosis virus E26 oncogene-like), sendo os mais prevalentes variando de 45 a 55% e de 35 a 45% dos casos, as alterações nos genes NPM1 e FLT3, respectivamente (VELLOSO, 2011). O gene NPM1, localizado no cromossomo 5q35, além de possuir 12 éxons, tem como função sintetizar a fosfoproteína nucleofosmina, que irá transportar-se entre o núcleo celular e o citoplasma, bem como entre nucleoplasma e nucléolo, estando diretamente envolvido na regulação proteica ribossomal, controle da duplicação do centrossomo e estabilidade do genoma (BRUNETTI et al., 2018; FALINI et al., 2009). A mutação encontrada no éxon terminal (12) deste gene resultará em uma localização de proteína mutante (NPM1- citoplasmático ou NPM1c) exacerbada no citoplasma celular, sendo esta aberrante e consequentemente leucemogênico, em contraste com a proteína do tipo selvagem (WT- wild type) encontrada apenas com localização nucleolar, que apresenta essencialidade para sobrevivência celular, sucedendo em problemática no quesito terapêutica direcionada especificamente para a NPM1 mutante pela similaridade das proteínas (BRUNETTI et al., 2018). 3.2 CONDUTAS PARA O DIAGNÓSTICO / SOLUÇÃO DO PROBLEMA A partir das informações prévias, e exames iniciais do paciente, foram solicitados os exames de citogenética e imunofenotipagem, com o propósito de confirmar a suspeita de LMA. Estes, são exames específicos que auxiliam na classificação, delineando mais precisamente a linhagem hematopoiética e estágio de diferenciação das leucemias (REUTER, 2014). Na imunofenotipagem, a análise do aspirado de medula óssea foi realizada por citometria de fluxo e o resultado pode ser observado na Tabela 3. 9 Tabela 3. Laudo imunofenotipagem de aspirado medular do paciente Dados da amostra: 100245870009 Material: Medula óssea Leucócitos: 58.900/mL Informações clínicas: --- Análise realizada por citometria de fluxo População analisada: Total de células nucleados Diferencial de fluxo: Granulócitos: 24,7% Eosinófilos: 0,2% Linfócitos: 7,1% Eritroblastos: 0,2% Blastos mieloides: 33,4% Blastos monocíticos: 27,4% Total de eventos: 100% População anormal 1: presença de população clonal monocítica (cerca de 27,4% dos eventos) que expressa CD14, CD45, CD56, CD11b, CD11c, CD13, CD33, HLA-DR, CD64, CD4fraco e cMPO. População anormal 2: presença de população clonal mieloide (cerca de 33,4% dos eventos) que expressa CD55, CD45, HLA-DR forte, CD33, CD64 e cMPO. Marcadores utilizados: cCD3, cCD79a, cMPO, CD2, CD4, CD7, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD19, CD33, CD34, CD45, CD56, CD64, CD117 e HLA-DR. CONCLUSÃO: Compatível com leucemia mieloide aguda. Os achados sugerem primeiramente leucemia mielomonocítica aguda. O diagnóstico diferencial inclui leucemia mieloide aguda com alterações relacionadas à síndrome mielodisplásica. Correlacionar com demais exames diagnósticos. Fonte: Projeto Integrador, 2020. A citogenética analisa os cromossomos das células leucêmicas, afim de detectar qualquer anormalidade, sendo a maioria dessas alterações cromossômicas do tipo translocação,e as informações obtidas sobre o tipo podem ser úteis para prever a resposta do indivíduo frente ao tratamento (TRESSO, 2015). O paciente apresentou alteração no sequenciamento do fragmento de 568 pb do éxon 12 do gene NPM1, conhecido por seu prognóstico favorável, enquanto o gene FLT3-D835, cujo prognóstico seria desfavorável, apresentava-se sem alterações (LINÍCIO & SILVA, 2010). Portanto, conclui-se o diagnóstico de LMA com NPM1 mutado, expressando antígeno CD13, CD33 e MPO concomitantemente a expressão de antígenos monocíticos CD14 e CD11b, e ausência de expressão de CD34, sendo assim classificada como leucemia mieloide aguda do tipo mielomonocítica. 10 Diante das alterações sorológicas referentes a hepatite B no teste de ELISA, solicitou- se reação do marcador HBeAg, concomitantemente a nova reação do marcador HBsAg, pelo fato de ter se apresentado no limite de referência (cut-off). Sendo estes realizados pelo método de eletroquimioluminescência (ECLIA) obtendo como resultado não reagente para HBeAg e reagente para HBsAg. O ensaio imunoenzimático (ELISA) é a técnica mais utilizada na detecção de marcadores da infecção pelo HBV, devido sua alta sensibilidade, entretanto, o ECLIA apresenta como vantagem a simplicidade de preparação do processo, alta estabilidade dos reagentes e especificidade (BARBOSA, 2017; BRASIL, 2018). Sabe-se que a infecção crônica pelo vírus HBV, é definida pela presença persistente do marcador HBsAg no soro de um paciente por um período de seis meses ou mais. Aproximadamente 5 a 10% dos indivíduos infectados evoluem para hepatite crônica, destes, cerca de 20 a 25% apresentam replicação do vírus (presença de HBeAg reagente no soro) evoluindo para doença hepática avançada. Durante o curso da infecção, podem ocorrer integrações de parte do genoma do HBV ao genoma do hospedeiro, sendo assim, é possível ter indivíduos com HBsAg circulantes, mesmo com replicação viral mínima ou inexistente, como é o caso do nosso paciente. Por isso, o critério de definição da infecção crônica deve avaliar os diversos marcadores, correlacionando também com o estado clínico do paciente (BRASIL, 2018). A evolução dos marcadores sorológicos e consequente diferenciação entre aguda e crônica pode ser observada na Figura 2. Figura 2. Evolução ao longo do tempo dos marcadores sorológico para hepatite B Fonte: SÁEZ-ALQUEZAR, 2014. Portanto, com o resultado de HBsAg reagente, principalmente relacionando com o anti-HBc IgG elevado, e a presença de elevação moderada das enzimas hepáticas ALT e AST do paciente, uma vez que estes estariam bem mais elevados caso a doença estivesse se 11 manifestando de forma aguda, confirmam a cronicidade da doença, em fase não replicativa, conforme Figura 3, pois, segundo Junior (2016) o curso natural da hepatite B crônica pode ser dividido em até quatro fases. Figura 3. Fases do curso natural da hepatite B crônica Fonte: Junior, 2016. 3.3 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS Por se tratar de um defeito clonal das células progenitoras, o diagnóstico de LMA geralmente inicia a partir de uma suspeita clínica e consiste na avaliação do sangue periférico e da medula óssea. Embora a morfologia continue sendo o fundamento para o diagnóstico, incluem-se técnicas mais específicas como a imunofenotipagem, avaliação citogenética e estudos de genética molecular que determinarão a terapêutica e o prognóstico da leucemia (SILVA, et al. 2006; SANTOS, et. al. 2019). O primeiro método laboratorial requerido para análise é o hemograma de sangue periférico. Este exame visa diferenciar os tipos celulares presentes bem como suas quantidades e aparência das células. A técnica utilizada é a citometria de fluxo que tem como princípio a incidência de uma fonte de luz laser que intercepta cada partícula em suspensão orientada em um fluxo laminar e mensuradas através de detectores ópticos (USP, 2020). Ao passar pelo feixe de luz, cada partícula dispersa luz de uma forma, e os corantes químicos fluorescentes (fluorocromos) ligados aos anticorpos ali presentes podem ser excitados emitindo luz com comprimento de onda característico. Adiante, após a captação do sinal pelo sistema óptico que é sensível a diferentes comprimentos de onda, esta é transferida para um computador acoplado 12 ao sistema, que permitirá a leitura de um ou mais marcadores ao mesmo tempo (BRAGA, et al. 2016). Portanto, como já mencionado, a avaliação das células da medula óssea também chamada de mielograma é um procedimento realizado sob anestesia local em que se introduz a agulha de coleta até que esta alcance o interior do osso, geralmente a crista ilíaca do quadril, sendo feita a aspiração da medula óssea (MADEIRA, 2020). Após, realiza-se uma análise citológica do material em esfregaço corado por Leishman ou May-Grünwald-Giemsa de imediato, como forma de análise preliminar da morfologia que na maioria dos casos apresentará medula hipercelular com intensa infiltração de blastos nos espaços adiposos, substituindo os elementos normais da medula por células leucêmicas (SANTOS, et al. 2019). Para tanto, garante-se a adequação da amostra, já que aspirados hemodiluídos ou secos podem não refletir a verdadeira situação da medula óssea (TRESSO, 2015). Ainda utilizando o aspirado de medula ou mesmo sangue periférico, efetuam-se exames citoquímicos onde se aplica corantes bioquímicos ao material, de maneira a mostrar sua composição sem modificar apreciavelmente sua morfologia (SANTOS, et al. 2019; TRESSO, 2015). Para confirmação da origem mieloide, com uma identificação e diferenciação conclusiva para um diagnóstico e bom prognóstico da doença realiza-se colorações, segundo Silva et al. (2006) as principais usadas são: fosfatase alcalina; mieloperoxidase (MPO); sudão negro B (SBB); naftol AS-D; cloroacetato esterase (CAE); esterases inespecíficas, como alfa-naftil acetato esterase (ANAE); e fosfatase ácida. Dentre estes, MPO ou SBB com reação positiva confirmam a natureza mieloide dos blastos e revelam os bastonetes de Auer em aproximadamente 65% dos casos. Sendo a MPO específica para as linhagens de granulócitos, eosinófilos e monócitos. Tratando-se mais especificamente da fosfatase alcalina nas reações citoquímicas, vale ressaltar que sua atividade limita a linhagem neutrofílica, ou seja, em casos de positividade há evidencia de que existem grânulos neutrofílicos na amostra, indicando células maduras dessa linhagem, excluindo-se assim a possibilidade de LMC, cuja caracterização são de células jovens, demonstradas por score baixo ou indetectável (SANTOS, et al. 2019). Outro exame importante é a imunofenotipagem, método realizado com a técnica de citometria de fluxo, como já mencionado, pois ela auxilia na classificação, diagnóstico, prognóstico, estadiamento, monitoramento e nas análises das características fenotípicas das células hematopoiéticas patológicas (SILVA & NASCIMENTO, 2018). Nesta, são utilizados anticorpos monoclonais marcados por fluorescência, sendo possível observar antígenos de superfícies presentes nas células, identificando o tipo de leucemia pela caracterização e 13 quantidade de antígenos, pois quanto maior a quantidade, maior o grau de maturação celular. Por isso o método é eleito como um dos exames essenciais no diagnóstico para várias desordens hematopoiéticas, incluindo as leucemias agudas (SANTOS, et al. 2019; SILVA & NASCIMENTO, 2018). De acordo com Fleury (2020): A expressão anômala pode ser evidenciada por meio da detecção de antígenos de outras linhagens, como a presença de CD19, CD5 e CD2 em mieloblastos; expressão assíncrona de antígenos, como a presença de CD34 presente nos estágios iniciais de maturação juntamente com CD15, presente em estágios evolutivos tardios; hiperexpressão, diminuição ou ausência de antígenos normalmente presentes. Estas alterações são úteis paraa monitoração de doença residual mínima. Além disso, o exame de citogenética analisa os cromossomos das células leucêmicas para detectar qualquer anormalidade. O método envolve o cultivo celular de amostras da medula óssea, a extração de cromossomos (escolhidas em condensação máxima da mitose) e diferentes técnicas de bandamento para serem realocados aos pares corretamente observando através do microscópio possíveis inserções, deleções ou mutações durante a metástase (SILVA et al. 2006). Ainda segundo Silva, et al. (2006), a técnica de citogenética, Pode ser complementada por técnicas de hibridização in situ, particularmente a hibridização fluorescente in situ (FISH), sendo importante para confirmar a presença de rearranjos recorrentes [...]. O teste de FISH ou PCR são os mais sensíveis, sendo considerados importantes não só para o diagnóstico e avaliação da resposta ao tratamento, como para diferenciação com outras doenças mieloproliferativas. A partir do método baseado na biologia molecular, se identifica sequências alteradas, inseridas ou deletadas dos nucleotídeos, na fita de DNA em local específico para estabelecer o tipo de alteração apresentada por amplificação de DNA ou RNA através da PCR e hibridização fluorescente in situ (FISH) (SANTOS, et al. 2019). Tendo em vista os exames de hepatites mencionados, o método ELISA e ECLIA avaliaram os marcadores do HBV. Referente ao ELISA, segundo o Ministério da Saúde (2015), este é utilizado no diagnóstico das infecções virais por meio da detecção de antígenos e/ou anticorpos específicos isoladamente ou combinados; Em um teste ELISA, para a detecção de anticorpos, um antígeno deve ser imobilizado em uma superfície sólida. O anticorpo presente na amostra do paciente se liga ao antígeno, ficando preso na superfície sólida. Acrescenta-se ao sistema um conjugado (anticorpo ligado a uma enzima), que irá se ligar ao anticorpo preso ao antígeno. A detecção ocorre por meio da incubação desse complexo com um substrato que, ao ser consumido pela enzima, produzirá um produto detectável (colorido ou insolúvel). O principal elemento para a detecção é uma interação antígeno-anticorpo altamente específica. 14 Em contrapartida o ECLIA, é um método no qual a aplicação de uma corrente eléctrica induz uma emissão quimioluminescente a partir dos complexos imunológicos (antígeno- anticorpo ou anticorpo-antígeno), contendo espécies químicas altamente reativas presentes em um eletrodo. Essas espécies reagem entre si, produzindo luz. Sendo assim, a principal vantagem desse processo é a alta sensibilidade (BRASIL, 2015). 3.4 CONDUTA TERAPÊUTICA Para um tratamento bem sucedido algumas variantes devem ser levadas em consideração, como idade, sexo, avaliação clínica e condição imunológica do paciente. A terapêutica de LMA mais conhecida e utilizada é a quimioterapia de indução, que consiste em quimioterápicos em conjunto ou isolados para se alcançar o estado de remissão completa (RC), destaca-se, estado este que não necessariamente significa cura da doença e sim a não detecção desta em métodos morfológicos convencionais, sendo assim fundamental a administração de terapia pós remissão (SANTOS et al., 2019). É importante ressaltar que em pacientes HBV positivos a síndrome chamada de “reativação da hepatite B após quimioterapia” é extremamente fatal, pois caracteriza-se pela terapia imunossupressora permitir o escape da replicação viral e disseminação pelo fígado, e, após a conclusão da terapia, a resposta imune do hospedeiro é restaurada o que resulta em lise generalizada de hepatócitos infectados mediada por células T citotóxicas sucedendo uma lesão hepática grave. Este tipo de reativação ocorre mais comumente em pacientes com hepatite B crônica (HBC), concomitantemente a fatores de risco que incluem o sexo masculino, idades mais jovens e sorologia positiva para HBeAg, porém o maior risco de reativação é em pacientes com níveis de HBsAg detectáveis antes da quimioterapia (LUBEL & ANGUS, 2010), fatores estes que se encaixam com o quadro clínico e com o paciente do presente estudo excluindo apenas a sorologia positiva para HBeAg. Segundo Lubel e Angus (2010), a identificação de pacientes nessas condições é o primeiro e mais importante passo a se observar para diminuir o risco da morbidade pela reativação, além disso as evidências do uso de terapia antiviral profilática tem se mostrado eficaz. Apesar de haver alguns medicamentos para o tratamento da HBC, as revisões bibliográficas são limitadas a lamivudina, tendo segurança e eficácia certificados no impedimento da reativação do HBV após a quimioterapia tanto em cânceres sólidos quanto em cânceres hematológicos, porém é necessário atentar-se ao fato de que foram relatados casos de hepatite grave por reativação após o desenvolvimento da resistência à lamivudina. O início da 15 terapia antiviral deve preceder a quimioterapia, a fim de impedir o aumento na replicação viral e reativação da HBC, além de reduzir as chances de resistência ao medicamento. Em um estudo realizado por Hui et al. (2005), avaliou-se 46 pacientes com neoplasias hematológicas e HBsAg positivos que iniciaram a profilaxia com o medicamento lamivudina uma semana antecedente a quimioterapia. A média de tempo utilizando o fármaco foi de 9 meses e a interrupção de seu uso após 3 meses do término da quimioterapia, observando-se 11 dos 46 pacientes tendo reativação do HBV (aproximadamente 24%) e 3 desses 11 pacientes (27%) desenvolvendo insuficiência hepática fulminante. Sendo possível concluir que a terapia profilática com o antiviral lamivudina, deve ser realizada por um período prolongado de pelo menos 6 meses, conforme descrito por Lubel e Angus (2010). No Fluxograma 1, nota-se uma proposta de ordem para o manejo de pacientes que são candidatos a receberem terapias imunossupressoras, como é o caso do paciente do presente estudo. Rastreamos a hepatite B e observou-se infecção atual pelo HBsAg positivo, como demonstra o fluxograma, por não apresentar ALT elevado e nem fibrose, o início de lamivudina deve ser feito 1 semana antes da quimioterapia e continuar por pelo menos 6 meses após a conclusão desta ou até que seu sistema imunológico esteja reconstituído, além da indispensabilidade de monitoramento dos testes de função hepática (Liver function tests, LFTs) e marcadores da própria hepatite B por 1 ano. Fluxograma 1. Ordem proposta para o manejo de pacientes candidatos a quimioterapia expostos a Hepatite B. Fonte: Adaptado de LUBEL & ANGUS (2010). 16 Destaca-se que no caso do nosso paciente, não é indicado transplante de células tronco, o mesmo apresenta Anti-HBc positivo, assim se realizado o transplante, pode ocorrer uma reversão nos receptores e consequente reativação da Hepatite B (LUBEL & ANGUS, 2010). 3.5 INOVAÇÕES NA ÁREA Para fins de esclarecimento este tópico completo baseou-se no artigo “A biomaterial- based vaccine eliciting durable tumour-specific responses against acute myeloid leukaemia” publicado na revista Nature Biomedical Engineering, por Shah e colaboradores, no ano de 2020. Correntemente, pacientes com Leucemia Mieloide Aguda (LMA) apresentam uma rápida disseminação da doença e tratamentos muitas vezes ineficazes, ainda que feito o diagnóstico precoce. A quimioterapia por mais que apresente a possibilidade de alcançar a remissão completa demonstra a dificuldade de erradicar todas as células aberrantes, consequentemente ocasionando recidiva na maioria dos pacientes. Por esse motivo, a solução de vacinas terapêuticas mostrou grande potencial em obter uma resposta imune específica e duradoura contra células da LMA, tendo a capacidade de eliminar a doença residual que permanece após o tratamento com quimioterapia. O processo de desenvolvimento de vacinas contra o câncer, requer uma apresentaçãoeficaz de antígenos tumorais para que haja ativação de células T, a suscetibilidade da LMA a essas células se deve ao fato de que semelhante a outros tipos de células cancerígenas, a mesma exibe antígenos tumorais com potencial de gerar respostas imunes. O estudo citado, demonstrou uma vacina injetável chamada de criogel, que tem habilidade de gerar um local imunológico controlado, exercendo a função de regulação da resposta imune contra a LMA. O mesmo contém biomateriais macroporosos que fornecem localmente fatores imunorreguladores para resultar em uma resposta potente e duradoura, além de, quando associada a quimioterapia de indução citotóxica (iCt) apresenta resultados satisfatórios eliminando totalmente as células leucêmicas. Essa vacina que ativa as células imune do hospedeiro, é composta por uma associação de polietilenoglicol (PEG) e alginato como material de estruturação de suporte, por ter habilidade de em meio aquoso formar um gel, feito para encapsular antígenos associados a LMA. Além da coadjuvante citosina-guanosina oligodesoxinucleotídeo (CpG-ODN), DNA sintético que tem como função ser agonista de receptores Toll-Like 9 e também o Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos – Macrófagos (sigla em inglês GM-CSF) onde estimulará a proliferação de células hematopoiéticas, mais especificamente células dendríticas 17 (DCs). Já os antígenos associados a LMA podem variar de proteínas 1 do Tumor de Wilms (WT1), que se refere a um fator de transcrição intracelular onde é super expressado em leucemias, ou de células lisadas derivadas da medula óssea de camundongos em fase terminal do câncer. Na pesquisa apresentada o primeiro teste realizado refere-se à vacinação profilática, foram separados 3 grupos de camundongos que receberam a imunização da (1) vacina de criogel com lisados celulares como antígeno, (2) vacina de criogel com WT1126-134 (que consiste nos aminoácidos 126 a 134 da proteína) como antígeno e (3) vacina bolus, que consiste em uma injeção subcutânea de GM-CSF, CpG e WT1126–134 como antígeno combinados na mesma dose que a vacina criogel porém estas diferem no meio em que estão suspensas, uma em gel e a outra, bolus, em solução salina tamponada com fosfato (PBS), todas as vacinas foram aplicadas no dia -10 conforme demonstra a Figura 4 e consecutivamente os animais foram desafiados no dia 0, isto é, injetou-se intravenosamente 5 milhões de células MLL-AF9 LMA expressando WT1, no caso, induzindo uma leucemia nos animais. Observou-se números significativamente mais altos de T CD8+ em camundongos vacinados com o criogel comparados a vacina feita com bolus antes do desafio de LMA e em todos os momentos após. Ressalta-se conforme a Figura 5 que a taxa de sobrevivência dos animais vacinados com criogel, tanto com antígenos de células lisadas quanto antígenos de WT1126-134, foi sobrevivência total mesmo quando foram desafiados novamente com 5 milhões de células LMA, indicando que a vacina confere imunidade a longo prazo, o que difere dos animais não tratados que faleceram entre os dias 23 e 29 após o desafio e os vacinados com bolus, apesar do aumento da sobrevida faleceram entre os dias 49 e 59. Figura 4: Administração da vacina profilática, desafio LMA e monitoramento da leucemia. Adaptado de SHAH et al., 2020. 18 Figura 5: Taxa de sobrevivência após injeção profilática de formulações variadas de vacina, desafio LMA (dia 0) e novo desafio (dia 100). Adaptado de SHAH et al., 2020. Além da profilaxia, em outro teste observado, percebeu-se que a associação da vacina criogel e quimioterapia de indução citotóxica (iCt) aumentou significativamente as respostas das células T CD8+ em comparação somente com iCt isolado. A carga de leucemia nos camundongos foi medida pelo sinal de bioluminescência, que aumentou em animais não tratados, enquanto a carga diminuiu notavelmente após o tratamento com iCt. Entretanto, a LMA recidivou nos animais tratados apenas com iCt entre o dia 25 e o dia 35, o que acabou resultando no falecimento destes. Conclui-se que a combinação de iCt e vacina criogel com antígeno ou vacina criogel sem antígeno, resultou em uma taxa de sobrevivência em 100%, conferindo proteção total contra LMA conforme demonstrado na Figura 6. Figura 6: Comparação da taxa de sobrevivência entre grupos com diferentes tratamentos Adaptado de SHAH et al., 2020. 19 O benefício da vacinação com criogel notou-se mais consideravelmente em camundongos já com LMA estabelecida e tratados com iCt. Isso se deve ao fato de que ao recrutar DCs e sustentar sua ativação, o próprio criogel da vacina aproveita uma ampla diversidade de antígenos tumorais derivados da morte celular de LMA induzida por quimioterapia. Ou seja, a iCt reduz a carga de leucemia, observada por meio da bioluminescência na medula óssea e no baço, e a vacina de criogel quando administrada serve para eliminar as células de LMA residuais e evitar recidiva. A indução dessa forte resposta imune celular é referente ao alto número de DCs estimuladas pela vacina, assim como sua ativação e prolongada interação com células imunes no linfonodo. Devido às limitações apresentadas pelo paciente do presente estudo de caso decorrentes de doenças secundarias, como a Hepatite B crônica, a opção de uma terapêutica eficaz e que garanta a não recidiva da LMA se faz necessária. Pelos resultados acima encontrados, caso essa vacina venha a ser testada em humanos, a quimioterapia combinada com a vacina de criogel sem antígenos demonstra ser um tratamento alternativo com grandes chances de sucesso. 20 REFERÊNCIAS BARBOSA, J. R. Hepatites B e C em indivíduos infectados pelo HIV, donetes renais crônicos e coagulopatas: epidemiologia e avaliação do desempenho de testes rápido para incremento de ações de prevenção e diagnóstico. Doutorado em Medicina Tropical, FIOCRUZ. Rio de Janeiro/RJ, ago. 2017. Disponível em: <https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/27453/2/jakeline_barbosa_ioc_dout_2017.pdf>. Acesso em: 25 jun. 2020. BRAGA, K. M. S.; PIMENTA, V. S. C.; RODRIGUES, F. A.; SANTOS, T. P.; ARAÚJO, E. G. Citometria de fluxo: histórico, princípios básicos e aplicações em pesquisa. 2016. Disponível em: <http://www.conhecer.org.br/enciclop/2016a/agrarias/citometria.pdf> Acesso em: 24 jun. 2020. BRASIL. Ministério da Saúde. Manual técnico para o diagnóstico das hepatites virais. Brasília/DF, 2015. Disponível em: <https://www.cevs.rs.gov.br/upload/arquivos/201701/04162030-manual-diagnostico-das- hepatites-virais-ms-2015.pdf> Acesso em: 26 jun. 2020. BRASIL. Ministério da Saúde. Manual técnico para o diagnóstico das hepatites virais. Brasília/DF, 2018. Disponível em: <https://qualitr.paginas.ufsc.br/files/2018/08/manual_tecnico_hepatites_08_2018_web.pdf>. Acesso em: 25 jun. 2020. BRUNETTI, L., Gundry, M. C., Sorcini, D., Guzman, A. G., Huang, Y.-H., Ramabadran, R. et al. (2018). Mutant NPM1 Maintains the Leukemic State through HOX Expression. Cancer Cell, 34(3), 499– 512.e9. Disponível em: <https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610818303593> Acesso em: 18 jun. 2020. FAILACE, R. Hemograma: manual de interpretação. 5 ed. Porto Alegre: Artmed, 2009. FALINI, B. et al. (2009). Altered nucleophosmin transport in acute myeloid leukaemia with mutated NPM1: molecular basis and clinical implications. Leukemia, 23(10), 1731–1743. FLEURY. Leucemia mieloide aguda. 2020. Disponível em: <https://www.fleury.com.br/medico/manuais- diagnosticos/hematologia-manual/leucemia-mieloide-aguda> Acesso em: 23 jun. 2020. GREER, J. P. et al. Wintrobe’s Clinical Hematology. 14 ed. Wolters Kluwer Health, 2018. HAMERSCHLAK, N. Manual de Hematologia. Programa Integrado de Hematologia e Transplantes de Medula Óssea. Barueri, SP: Manole, 2010. HELMAN, Ricardoet al. Leucemia mieloide aguda: atualidade brasileira de diagnóstico e tratamento. Einstein (São Paulo), São Paulo, v. 9, n. 2, p. 179-183, Jun 2011. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1679-45082011000200179&lng=en&nrm=iso>. Acesso em: 16 jun. 2020. HOFFBRAND, A. V. & MOSS, P. A. H. Fundamentos em hematologia de Hoffbrand. 7 ed. Porto Alegre: Artmed, 2018. HOFFBRAND, A. V. & STEENSMA, D. P. Hoffbrand’s Essencial Haematology. 8 th. John Wiley & Sons Ltd. 2020. cap. 1. Disponível em: <https://media.wiley.com/product_data/excerpt/03/11194959/1119495903-2.pdf>. Acesso em: 23 jun. 2020. HUI, C. K. et al. Hepatitis B reactivation after withdrawal of pre-emptive lamivudine in patients with haematological malignancy on completion of cytotoxic chemotherapy. Gut. 2005;54(11):1597-1603. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16000641/>. Acesso em: 25 jun. de 2020. INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER (INCA). Leucemia. 04 fev. 2020. Disponível em: <https://www.inca.gov.br/tipos-de-cancer/leucemia>. Acesso em: 18 jun. 2020. JACOB, Harry S. Baço aumentado. Manual MSD, ago. 2018. Disponível em: <https://www.msdmanuals.com/pt/casa/dist%C3%BArbios-do-sangue/dist%C3%BArbios-do- ba%C3%A7o/ba%C3%A7o-aumentado>. Acesso em: 23 jun. 2020. JUNIOR, L. P. C. Perfil clínico-epidemiológico da hepatite B na população do estado de Roraima. Boa Vista/RR, 2016. KOUCHKOVSKY, I. De, Abdul-Hay M. Acute myeloid leukemia: a comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer J. 2016;6(7):e441. 2016. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27367478/> Acesso em: 16 jun. 2020. LABTES. Disponível em: <https://labtest.com.br/>. Acesso em: 18 jun. 2020. LINÍCIO, M. A. & SILVA, M. C. S. Importância da detecção das mutações no gene FLT3 e no gene NPM1 na leucemia mieloide aguda – Classificação da Organização Mundial de Saúde 2008. Rev. Bras. Hematol. 21 Hemoter. vol.32, n. 6. São Paulo, 2010. Disponível em: <https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-84842010000600012>. Acesso em: 23 jun. 2020. LUBEL, J. S. & ANGUS, P. W. Hepatitis B reactivation in patients receiving cytotoxic chemotherapy: diagnosis and management. J Gastroenterol Hepatol. 2010;25(5):864-871. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20546439/> Acesso em: 25 jun. de 2020. MADEIRA, Paula Nogueira Maia. Mielograma. 2020. Disponível em: <https://www3.hermespardini.com.br/pagina/1728/mielograma.aspx>. Acesso em: 23 jun. 2020. NASCIMENTO, J. B. Alterações metabólicas nas leucemias agudas. Aracajú/SE, ago. 2013. Disponível em: <https://ri.ufs.br/bitstream/riufs/8189/2/Juliana_Brito_Nascimento.pdf>. Acesso em: 20 jun. 2020. PINTO, W. J. Bioquímica clínica. 1 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2017. REUTER, D. C. Leucemias Mieloides Agudas: manifestações clínicas e diagnóstico laboratorial. Salvador/BA, 2014. Disponível em: <http://bibliotecaatualiza.com.br/arquivotcc/EON/EON05/REUTER- dyana.PDF>. Acesso em: 18 jun. 2020. RODAK, B. G. et al. Hematoly: Clinical Principles and Aplications. 4 ed. Elselvier Revinter, 2016. SÁEZ-ALQUEZAR, A. Marcadores sorológicos para o diagnóstico e acompanhamento das hepatites por vírus. Porto Alegre, 2014. Disponível em: <http://www.pncq.org.br/uploads/2014/workshops_aulas/Hepatites_SBAC_2014.pdf>. Acesso em: 25 jun. 2020. SANTOS, M. M. F. et al. Leucemia Mieloide, Aguda e Crônica: Diagnósticos e Possíveis Tratamentos. Revista Saúde em Foco, Edicão nº11, 2019. Disponível em: <http://portal.unisepe.com.br/unifia/wp- content/uploads/sites/10001/2019/02/022_LEUCEMIA-MIELOIDE-AGUDA-E-CR%C3%94NICA- DIAGN%C3%93STICOS-E-POSS%C3%8DVEIS-TRATAMENTOS.pdf> Acesso em: 25 jun. de 2020. SHAH, N. J., et al. A biomaterial-based vaccine eliciting durable tumour-specific responses against acute myeloid leukaemia. Nat Biomed Eng 4, 40–51 (2020). SILVA, R. D. P. et al. Acidente vascular encefálico hemorrágico em adulto jovem como apresentação inicial de leucemia mielomonocítica. Rev Bras Clin Med. São Paulo, 2011. Disponível em: <http://files.bvs.br/upload/S/1679-1010/2011/v9n2/a1824.pdf>. Acesso em: 18 jun. 2020. SILVA, E. B.; NASCIMENTO, J. A. O diagnóstico das síndromes mielodisplásicas: revisão da literatura. 2018. Disponível em: <http://www.rbac.org.br/artigos/o-diagnostico-das-sindromes-mielodisplasicas-revisao-da- literatura/>. Acesso em 27 jun. 2020. SILVA, G. C.; PILGER, D. A.; CASTRO, S. M.; WAGNER, S. C. Diagnóstico laboratorial das leucemias mielóides agudas. J Bras Patol Med Lab. v. 42. abr. 2006. Disponível em: <https://www.scielo.br/pdf/jbpml/v42n2/a04v42n2.pdf> Acesso em 26 jun. 2020. TRESSO, Milena. Métodos diagnósticos da leucemia mieloide aguda. São José do Rio Preto/SP, 2015. Disponível em: <http://www.ciencianews.com.br/arquivos/ACET/IMAGENS/biblioteca- digital/hematologia/serie_branca/leucemias_linfomas_mieloma/leucemias/24-Metodos-diagnostico-da-leucemia- mieloide-aguda.pdf>. Acesso em: 23 jun. 2020. USP. Serviço de citometria de fluxo. Departamento de imunologia. 2020. Disponível em <http://www.icb.usp.br/~imunoicb/?page_id=295> Acesso em 24 jun. 2020. VELLOSO, Elvira Deolinda Rodrigues Pereira et al. Alterações citogenéticas e moleculares em leucemia mieloide aguda: revisão e descrição de casos. Einstein (São Paulo), São Paulo, v. 9, n. 2, p. 184-189, Jun 2011. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1679- 45082011000200184&lng=en&nrm=iso>. Acesso em: 16 jun. 2020. 22 ANEXOS Anexo 1. Valores de referência do Leucograma Fonte: Adaptado e modificado de GREER et al. (2018) e RODAK et al (2016).