Aula 3 - Análise dos ácidos nucleicos

Prévia do material em texto

Curso: Farmácia
Professora: Lilian Alves
Análise dos ácidos nucléicos
https://www.dw.com/pt-br/as-novas-
tecnologias-de-an%C3%A1lise-de-dna-
em-cenas-de-crime/av-50008012
14/08/2019
Análise dos ácidos nucléicos
Folha de Boa Vista, 
04/09/2019
https://folhabv.com.br/noticia/CIDADES/
Capital/Detentos-de-RR-terao-perfil-
genetico-incluido-em-Banco-de-
Dados/57007
https://folhabv.com.br/noticia/CIDADES/Capital/Detentos-de-RR-terao-perfil-genetico-incluido-em-Banco-de-Dados/57007
Análise dos ácidos nucléicos
G1 Pará, 
12/08/2019
https://g1.globo.com/pa/para/noticia/2
019/08/12/iml-conclui-identificacao-
por-dna-de-20-vitimas-carbonizadas-no-
massacre-de-altamira-no-pa.ghtml
Análise dos ácidos nucléicos
Revista Galileu, 
14/08/2019
https://revistagalileu.globo.com/Ciencia
/Saude/noticia/2019/08/como-
medicina-genetica-promete-
revolucionar-saude.html
Técnicas de extração de DNA
Biologia molecular: área da biotecnologia que surgiu a partir da dedução da estrutura 
tridimensional da molécula de ácido desoxirribonucléico (DNA) e envolve diversos princípios e 
técnicas que permitem analisar o material genético dos organismos
Áreas de aplicação para estudo do material genético celular
Análise dos ácidos nucleicos
DNA
• Acesso a informação genética do
indivíduo;
• Identificação do indivíduo;
• Confirmação da presença de um
gene de interesse.
RNA
• Acesso direto as mensagens codificantes;
• Abundância relativa pode ajudar a entender processos
celulares;
• Comparação entre amostras diferentes (diversos tecidos ou
estágios de um ciclo de vida) permitem identificar genes
críticos para determinados processos
Áreas de aplicação para estudo do material genético celular
Análise dos ácidos nucleicos
Localização do DNA nas células
Célula bacteriana (procariótica)
Localização do DNA nas células
Célula vegetal (eucariótica)
Localização do DNA nas células
Célula animal (eucariótica)
Por que extrair o DNA de uma célula?
• O que queremos estudar nesse DNA?
• O que fundamentalmente diferencia o 
DNA de um indivíduo (de uma mesma 
espécie) para outro?
“O cromossomo da Escherichia coli contém 
cerca de 4 x 106 pares de bases que 
codificam cerca de 3.300 proteínas 
diferentes. Os seres humanos apresentam 
ao redor de três bilhões de pares de bases 
que codificam de 50 a 100 milhares de 
genes.”
Por que extrair o DNA de uma célula?
Para a realização das análises moleculares com eficiência é necessária a separação dos ácidos 
nucleicos do restante dos constituintes das células, utilizando técnicas de extração de DNA ou RNA
Existem vários protocolos de extração de DNA e RNA descritos na literatura, e a escolha do mais
adequado deve levar em consideração:
- A molécula desejada (DNA e/ou RNA);
- O tipo de amostra;
- O grau de pureza;
- O rendimento desejado;
- A disponibilidade de recursos para a sua realização.
Conhecimento a respeito das características dos organismos envolvidos é essencial para 
escolha do protocolo!
DÚVIDAS?
Preparação das amostras
1) Obtenção do material:
- Punção de vasos sanguíneos, biópsia, esfregaços, cultivo microbiano, fragmentação de
tecidos etc.
- Larvas, insetos, folhas etc.
Preparação das amostras
1) Obtenção do material:
- Acondicionamento das amostras: essencial para a sua preservação até o momento da
extração. O DNA apresenta estabilidade maior, enquanto o RNA é rapidamente
degradado após a coleta;
- Alternativas de acondicionamento: congelamento ou uso de reagentes
• Aliquotar amostras;
• Manusear usando luvas
Preparação das amostras
2) Separação das células:
AMOSTRAS LÍQUIDAS: CENTRIFUGAÇÃO
Separação de células nucleadas, no precipitado, ou de partículas virais, no sobrenadante
AMOSTRAS + SOLUÇÃO DE TAMPÃO OU LISE
Preparação das amostras
2) Separação das células:
AMOSTRAS SÓLIDAS: Quebra de estruturas rígidas
• PICOTAGEM ou MACERAÇÃO
AMOSTRAS + SOLUÇÃO DE TAMPÃO OU LISE
Controle Crescimento
Planta Filtração
+ 
Lavagem
+ 
Congelamento
Preparação das amostras
3) Lise celular:
SOLUÇÃO TAMPÃO OU DE LISE
Composição:
1. Detergentes: atuam sobre os lipídeos. Ex: SDS, tween-20, triton-X-100, CTAB
2. TRIS (Tris-hidroximetil aminometano): mantem o pH estável (+ ou – 8,0)
3. EDTA (Ácido etileno diamino tetra-acético): agente quelante
4. NaCl: rompendo ligações iônicas das cadeias peptídicas, auxiliando na desnaturação das
proteínas e adicionalmente promove a aglomeração das moléculas de DNA
5. Proteinase K*: digestão de proteínas, o que auxilia na lise das células e na separação dos
constituintes celulares
Preparação das amostras
4) Separação dos constituintes celulares:
Ác. Nucléicos e 
const. celulares
DNA
RESTO
CELULAR
ou
Causam desnaturação proteica
(clorofórmio ou fenol)
Transferir para 
um novo tubo
Preparação das amostras
5) Precipitação do DNA:
Ou isopropanol, soluções 
acetatos de amônio ou 
sódio
DNA
Preparação das amostras
6) Lavagem e re-suspensão do DNA:
• Geralmente a lavagem do DNA é realizada com etanol 70% para a 
remoção dos sais, detergentes e de outras impurezas;
• Após a secagem por evaporação, o DNA é solubilizado 
preferencialmente em solução tampão TE 10:1(Tris-HCl e EDTA).
Preparação das amostras
Todas as etapas citadas podem ser realizadas utilizando kits de extração
DÚVIDAS?
Preparação das amostras
Preparação das amostras
5
3
2
1
4
Concentração e qualidade do DNA
ESPECTOFOTÔMETRO
• O volume das cubetas de espectrofotômetros é maior que o obtido nas extrações;
• Logo, é necessário diluir as amostras de DNA 100 ou 200 vezes para a realização da medição, o que
deve ser levado em consideração no cálculo da concentração;
• Para calcular a concentração: o valor de absorbância (A) de 1,0 corresponde 
a uma concentração de 50 µg de DNA (fita dupla) por mililitro (mL)
Concentração e qualidade do DNA
Cálculo da pureza
Os cálculos da concentração e da pureza do DNA nas amostras são realizados utilizando as
seguintes fórmulas:
Valores entre 1,7 e 1,9 indicam pureza adequada das 
extrações de DNA, enquanto valores abaixo de 1,7 ou acima 
de 1,9 podem significar a presença de proteínas ou outros 
contaminantes (como o RNA).
Concentração e qualidade do DNA
CONSIDERE PARA ESSES CÁLCULOS F.D.=100
Concentração e qualidade do DNA
AMOSTRA 1:
CONCENTRAÇÃO DO DNA = 0,038 X 100 X 50
CONCENTRAÇÃO DO DNA = 190 ng/μL
PUREZA DO DNA: 0,038/0,034
PUREZA DO DNA = 1,1
Concentração e qualidade do DNA
AMOSTRA 2:
CONCENTRAÇÃO DO DNA = 0,065 X 100 X 50
CONCENTRAÇÃO DO DNA = 325 ng/μL
PUREZA DO DNA: 0,065/0,035
PUREZA DO DNA = 1,86
Concentração e qualidade do DNA
NANODROP 
Medição da quantidade de luz absorvida pelo DNA em 
solução no comprimento de onda de 260 nm
Concentração e qualidade do DNA
NANODROP 
• Utiliza apenas 1 µL de amostra;
• Quanto maior for a absorção de luz no comprimento de onda 
de 260 nm, maior a concentração de DNA na solução. 
DÚVIDAS?
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
• Forma de separar e visualizar fragmentos de macromoléculas como DNA, RNA e proteínas
com diferentes pesos moleculares, por aplicação de corrente elétrica.
DNA: Molécula com carga 
negativa (grupamento 
fosfato)
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
Princípios:
• Moléculas de DNA quando submetidas a um campo elétrico, em pH neutro, são atraídas para o
polo positivo (ânodo) e repelidas pelo polo negativo (cátodo);
• Quando a migração do DNA é realizada em uma matriz que apresenta resistência a migração das
moléculas, fragmentos menores podem mover-se através da matriz com maior facilidade que os
fragmentos grandes;
• Quanto menor o tamanho da molécula de DNA, ou seja, a quantidade de nucleotídeos, mais
rápido será o seu deslocamento e, portanto, maior será a distância percorrida. Moléculas de
mesmo tamanho migram a mesma distância e se concentram em uma determinada região
chamada de banda, independentemente da sequência de seus nucleotídeos.
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
Materialescolhido para ser a matriz: Depende da resistência necessária para a separação eficiente
dos fragmentos
1) Agarose:
- Tamanho de poros que permite a separação de
fragmentos de 200 pb a 50kb, desde que ajuste a
concentração do gel;
- Gel de baixa concentração (0,5% ou menos): Pequena
resistência;
- Fragmentos de tamanho maior podem ser separados
eficientemente;
- Para separação de fragmentos de tamanho menor:
aumentar a concentração de agarose no gel (2% ou mais)
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
1) Agarose
• Pesar a quantidade de agarose e
diluir em TBE (Tris, ácido Bórico
e EDTA)
• Solubilizar ao calor
• Esperar esfriar
• Verter na cuba
• Fazer os poços para aplicar a
amostra
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
1) Agarose
• Aplicar a amostra (com tampão
de amostra)
• Esperar decantar
• Colocar o gel na cuba (ou aplicar
diretamente com o gel na cuba)
• Acrescentar TBE na cuba
• Conectar à fonte
• Esperar a eluição
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
1) Agarose
ELETROFORESE 
HORIZONTAL 
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
1) Agarose
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
Material escolhido para ser a matriz: Depende da resistência
necessária para a separação eficiente dos fragmentos
2) Poliacrilamida(SDS-PAGE)
- Acrilamida + bis-acrilamida
- Separação de fragmentos muito pequenos (até 1000 pb);
- Quando deseja-se separar as proteínas somente por
tamanho e carga;
- O SDS é um detergente aniônico forte, que se liga aos
resíduos positivamente carregados das proteínas,
conferindo às mesmas uma carga final negativa e
ocasionando a desnaturação.
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
2) Poliacrilamida
ELETROFORESE 
VERTICAL 
• O DNA após a separação em gel de agarose, pose ser corado com um corante
fluorescente, o brometo de etídio e ser visualizado sob luz ultravioleta.
• Moléculas de brometo de etídio intercalam-se entre os nucleotídeos do DNA,
permitindo a observação dos fragmentos presentes no gel.
• Outros corantes intercalantes de DNA:
- Sybr safe
- Sybr green
- Blue Green
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
Visualização das bandas:
Transiluminador (Luz UV)
Aplicações da eletroforese em gel de agarose
• Verificar a qualidade de DNA genômico
• Estimar a concentração de DNA
• Separação de fragmentos de DNA obtidos após a digestão com enzimas de restrição
• Purificar plasmídeos
• Verificar os produtos de amplificação por PCR, entre outras
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
Concentração e qualidade do DNA
ELETROFORESE 
• Estimar a concentração de DNA: uso de marcadores de peso molecular conhecido
DÚVIDAS?
lilian.alves@unifg.edu.br