Aula 4 - Reação em Cadeia da Polimerase

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Curso: Farmácia
Professora: Lilian Alves
https://www1.folha.uol.com.br/equilibrioesaude
/2019/08/bacterias-multirresistentes-sao-
identificadas-fora-do-ambiente-hospitalar.shtml
21 de agosto de 2019
https://www1.folha.uol.com.br/equilibrioesaude/2019/08/bacterias-multirresistentes-sao-identificadas-fora-do-ambiente-hospitalar.shtml
https://exame.abril.com.br/ciencia/risco-de-
morte-por-febre-amarela-agora-pode-ser-
identificado-mais-cedo/
27 de julho de 2019
https://pebmed.com.br/teste-rapido-
molecular-para-tuberculose-e-incorporado-
ao-sus/
28 de junho de 2019
1865
Gregor Mendel
Descobriu que as 
características são herdadas 
com base em leis específicas
1866
Ernst Hacckel
Núcleo: responsável 
pela transmissão das 
características 
hereditárias 
1953
Watson e Crick 
Determinaram a 
estrutura do DNA
Friedrich Miescher
Primeiro 
pesquisador a 
isolar o DNA
1986 Séculos XX e XXI
Vários meios de 
estudos foram 
desenvolvidos
Reação em Cadeia da Polimerase - PCR
• Histórico
Vários estudos foram desenvolvidos para conhecer e compreender a molécula de DNA:
✓ Southern blot (Edwin Southern, 1975)
✓ Sequenciamento (Frederick Sanger e Walter Gilbert, 1977)
✓ Reação em Cadeia da Polimerase-PCR (Kary Mullis, 1985)
Reação em Cadeia da Polimerase - PCR
• Histórico
✓ Obter DNA em tubo de ensaio é o primeiro passo para um universo de experimentos em
genética molecular;
✓ A PCR é considerada uma das técnicas de biologia molecular de grande importância
revolucionária.
Reação em cadeia da polimerase - PCR
✓ Kary Mullis, em 1983, era um pesquisador empregado
na Cetus Corporation (EUA) imaginou uma forma de
fazer com que a DNA polimerase iniciasse e terminasse
seu trabalho em trechos pré-determinados do DNA;
✓ Em 1993, recebeu o prémio Nobel em química pela
descoberta
✓ Identificação de polimorfismo
✓ Genotipagem
✓ Detecção de microrganismos
✓ Diagnóstico de doenças genéticas
✓ Identificação de perfis de resistência microbiana
✓ Teste de paternidade
Reação em cadeia da polimerase - PCR
• Onde esta técnica pode ser empregada?
✓ A sigla deriva do inglês: "polymerase chain
reaction", que significa “reação em cadeia da
polimerase”;
✓ Então, a base da técnica é a ação in vitro da
DNA polimerase.
✓ Consiste na amplificação enzimática de uma
sequência específica de DNA, visando a
produção de milhões de cópias dessas
sequência.
Reação em cadeia da polimerase - PCR
• Ponto de início → Oligonucleotídeo
(primer) que se hibridiza à fita
molde.
Reação em cadeia da polimerase - PCR
• DNA polimerase → Adiciona nucleotídeos
presentes na reação segundo a fita molde.
O desenvolvimento da técnica depende de:
✓ Amostra (fita molde de DNA): obtida a partir de fontes variadas
(tecido, cabelo, unha, líquidos corpóreos, microrganismos etc).
Reagentes:
✓ Primers;
✓ dNTP’s: Precursores de síntese de DNA (desoxinucleotídeos tri-
fostato, dATP, dTTP, dCTP e dGTP)
✓ DNA Polimerase
✓ MgCl2;
✓ Tampão da PCR.
Aparelho:
✓ Termociclador
Reação em cadeia da polimerase - PCR
dATP, dTTP, dCTP e dGTP
DNA polimerase
DNA molde 
Primers
Solução Tampão Termociclador
Reação em cadeia da polimerase - PCR
MgCl2
✓ Fita molde de DNA: material que se deseja amplificar
✓ Primers: pelo menos um par -> são responsáveis pela
identificação do local correto (exemplo: gene) do material a ser
amplificado
✓ dNTP’s: Precursores de síntese de DNA. Responsáveis pela
síntese de novas cópias do material a ser amplificado
✓ DNA Polimerase (Taq polimerase): sintetiza as novas cadeias de
DNA
✓ MgCl2: cofator da polimerase
✓ Tampão da PCR: necessária para a atividade da polimerase
Reação em cadeia da polimerase - PCR
• Funções de cada componente da reação:
✓ Aparelho Termociclador:alterações das temperaturas para desnaturação da molécula de DNA,
ao anelamento dos primers e ao alongamento/extensão das novas cadeias de DNA
✓ Fita molde de DNA: material que se deseja amplificar
- Complexidade do DNA (de plasmídeos a genomas completos)
- Pureza (Proteínas, lipídeos, outro DNA, reagentes extração)
- Degradação
- Inibidores (EDTA, heparina)
- Contaminação (Produtos amplificados)
- Estocá-lo por longos períodos de tempo (20 °C) por até 2 anos,
em tampão apropriado.
Reação em cadeia da polimerase - PCR
• Particularidades
Desnaturação
Rompimento das 
pontes de hidrogênio 
entre as duas cadeias 
de DNA
Anelamento Síntese
Hibridização dos 
primers às sequencias 
complementares no 
DNA
94 °C 
1-5min
30 – 65 °C 
30 - 60 seg
72 °C 
2-5 min min
Síntese de novas 
cadeias 
(DNA polimerase)
Reação em cadeia da polimerase - PCR
• Etapas da PCR
1000 bases/minuto → 25-30 ciclos → 250 milhões de cópias
Reação em cadeia da polimerase - PCR
Termociclador:
✓ Desnaturação: aumento da temperatura (91 a
95°C) para romper as pontes de hidrogênio e
permitir a abertura da dupla fita;
✓ Anelamento: ligação dos primers na região
específica que se deseja amplificar e é
caracterizada pelo abaixamento da temperatura
(55 a 62°C, diretamente relacionada com a
composição dos primers);
✓ Extensão: ativação da Taq Polimerase (72°C) e a
síntese das novas cadeias
Reação em cadeia da polimerase - PCR
Placa capaz de 
aquecer e resfriar 
Termociclador:
Reação em cadeia da polimerase - PCR
Estas alterações de temperatura ocorrem em torno de 30 a 40 vezes e são chamadas de ciclo
✓ a DNA pol era termoinstável (como a maioria das proteínas dos seres vivos) e se inativa
irreversivelmente a 94 oC;
✓ Era preciso adicionar mais DNApol no tubo a cada ciclo de extensão;
✓ Além disso, a baixa temperatura de funcionamento da DNApol de E. coli propiciava o
aparecimento de pareamentos sem sentido (errôneos) no sistema, gerando ao final
produtos de PCR inesperados.
Reação em cadeia da polimerase - PCR
Na verdade, 
a coisa não foi tão fácil assim... 
A solução foi encontrada logo:
✓ A DNA pol de E. coli foi substituída por uma DNA polimerase
de um microrganismo termo-tolerante, o Thermus
aquaticus.
✓ A enzima foi batizada de Taq polimerase e permitiu,
finalmente, que o PCR se tornasse uma ferramenta
extraordinariamente útil na genética molecular.
Reação em cadeia da polimerase - PCR
Ela é termoestável e sua temperatura ótima de funcionamento é 72oC. Com isto duas
problemas ficaram automaticamente resolvidos:
a) não havia mais necessidade de adicionar enzima no tubo a cada ciclo;
b) o DNA molde não se renaturava por completo, permitindo uma rápida desnaturação ao
se iniciar um novo ciclo.
Reação em cadeia da polimerase - PCR
• Que propriedades tem a Taq polimerase que a fazem tão útil?
Reação em cadeia da polimerase - PCR
Reação em cadeia da polimerase - PCR
• Amplificação Exponencial
Reação em cadeia da polimerase - PCR
✓ A visualização dos produtos de uma reação de PCR costuma ser feita através do uso da
eletroforese em gel;
✓ Pode-se usar um gel horizontal de agarose e visualizar as bandas por transiluminação UV,
"corando" previamente o DNA com alguma substância que se intercale entre as fitas de DNA e
nestas condições absorve o UV e fluoresce (ex.: brometo de etídio).
Reação em cadeia da polimerase - PCR
Reação em cadeia da polimerase - PCR
• PARA PRATICAR: Estime o tamanho (pb) dos produtos de PCR do gel abaixo.
Reação em cadeia da polimerase - PCR
• PARA PRATICAR:
• Suponha que você esteja trabalhando em um laboratório de ciências forenses. Você
acabou de receber uma amostra de DNA de um cabelo deixada em uma cena de
crime, juntamente com amostras de DNA de três possíveis suspeitos. Seu trabalho é
examinar um marcador genético em particular e verificar se algum dos três suspeitos
coincide com o DNA do cabelo para esse marcador.
Reação em cadeia da polimerase - PCR
• PARA PRATICAR:
• O marcador vem em dois alelos, ou versões. Um deles contém uma única repetição
(região marrom abaixo), enquanto o outro contém duas cópias da repetição. Em uma
reação PCR com primers que atuam na região de repetição, o primeiro alelo produz
um fragmento de DNA de 200 pb,enquanto o segundo produz um fragmento de DNA
de 300 pb.
Reação em cadeia da polimerase - PCR
• PARA PRATICAR:
• Você faz uma PCR nas quatro
amostras de DNA e visualiza os
resultados por eletroforese em gel. O
DNA de qual suspeito coincide com o
DNA da cena do crime?
PCR convencional 1. Etapas Pré- PCR:
Coleta da Amostra
Estabilização
Extração do Ácido Nucleico
2. PCR ou Ciclagem:
Preparo da Reação
Termociclagem
3. Pós-PCR:
Análise em Gel
Reação em cadeia da polimerase - PCR
Concentração e do produto de PCR
NANODROP 
Medição da quantidade de luz absorvida pelo produto 
em solução no comprimento de onda de 260 nm
Próxima etapa: Sequenciamento do DNA
Reação em cadeia da polimerase - PCR
lilian.alves@unifg.edu.br