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Cópia gratuita - venda proibida © 2015 Todos os direitos desta edição são reservados à Sociedade Brasileira de Genética. Comissão Editorial Sociedade Brasileira De Genética Editor Élgion Lúcio Silva Loreto Universidade Federal de Santa Maria Comissão Editorial Carlos Frederico Martins Menck Universidade de São Paulo Louis Bernard Klaczko Universidade Estadual de Campinas Marcio de Castro Silva-Filho Universidade de São Paulo Maria Cátira Bortolini Universidade Federal do Rio Grande do Sul Marcelo dos Santos Guerra Filho Universidade Federal de Pernambuco Pedro Manoel Galetti Junior Universidade Federal de São Carlos Capa, projeto gráfi co, diagramação e normalização Rua Cap. Adelmio Norberto da Silva, 736 14025-670 - Ribeirão Preto - SP 16 3621-8540 | 16 3621-3552 Introdução ao mundo dos microRNAs / Tiago Campos Pereira (Organizador). – Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética, 2015. 342 p. : il. ISBN 978-85-89265-21-8 1. miRNA, RISC, Dicer, Drosha, silenciamento gênico, RNAi, genética. Cópia gratuita - venda proibida Uma introdução ao mundo dos microRNAs No século passado observamos grandes avanços ligados à biologia molecular. Da descoberta da estrutura do DNA aos finos mecanismos de regulação gênica, muitos foram os achados. Os microRNAs foram inicialmente descritos na década de 90 e desde 2000 se fala em seus papéis como reguladores biológicos. Pesquisas têm demonstrado a participação destas moléculas em doenças diversas - dentre elas, o câncer. A progressão das pesquisas científicas e clínicas está diretamente ligada ao avanço tecnológico. Por isso é tão importante a busca por soluções inovadoras, que possam diminuir o tempo e os custos na obtenção dos dados. Nós, da GeneSeq, sabemos que cientistas bem amparados podem ir mais longe! Por isso, temos auxiliado diversos pesquisadores em projetos envolvendo sequenciamento em larga escala e bioinformática, com soluções em genômica, transcriptoma e regulação epigenética. Também atuamos nas áreas de Oncologia e Reprodução Humana, com testes e painéis abrangentes, que atendem às demandas dos profissionais de saúde. E para oferecer serviços com excelência, procuramos por parceiros que fossem referência no assunto. Assim nos tornamos representantes da BGI International. Com bases espalhadas ao redor do mundo, esse grande centro tem história e fez parte do Projeto de Sequenciamento do Genoma Humano. A expertise acumulada ao longo dos anos se reflete na estrutura única da BGI: além de instalações modernas e bem equipadas, esse centro tem um corpo científico de peso e importantes certificações internacionais. Isso significa que todos os procedimentos passam por controles de qualidade bem estabelecidos. Por isso, os ensaios são exatos e precisos, o que garante a confiabilidade dos dados. E nós, da GeneSeq, ficamos felizes por oferecer essa opção segura aos profissionais brasileiros. Queremos, assim, participar desse novo e empolgante momento da biologia molecular, facilitando a vida dos pesquisadores e trazendo soluções a um custo acessível. É por acreditar na ciência que decidimos nos lançar nesta empreitada. Pela mesma razão, apoiamos este livro, que traz informações relevantes aos pesquisadores da área, de uma forma descomplicada e clara. Esperamos contribuir também com as suas pesquisas. Desejamos a todos uma boa leitura! Saiba mais. Visite nosso site: www.geneseq.com.br Você também pode nos contatar via email: contato@geneseq.com.br Dando sequência à vida. Cópia gratuita - venda proibida Cópia gratuita - venda proibida µg: micrograma (10-6 grama). 3’ UTR (3’ Untranslated Region): região 3’ não traduzida. 5’ RACE (Rapid Amplification of cDNA End): amplificação rápida do DNA complementar (referente à) extremidade 5’ (do RNA mensageiro). 5’ UTR (5’ Untranslated Region): região 5’ não traduzida. aa: aminoácido. AGO: argonauta. AM: aprendizagem de máquina. AMFE (Adjusted Minimum Free Energy): menor energia mínima livre ajustada. amiR (artificial microRNA): microRNA artificial. CAP: 7 metilguanosina trifosfato. ceRNA (competing endogenous RNA): RNA endógeno competidor. circRNA (circular RNA): RNA circular. CLASH (Cross-linking, Ligation and Sequencing of Hybrids): ligação cruzada (mediada por luz ultravioleta seguida por) ligação (convencional) e sequenciamento de híbridos. cmiRNA (canonical miRNA): microRNA canônico. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats): repetições palindrômicas pequenas regularmente espaçadas e agrupadas. D-bodies (Dicing bodies): corpúsculos (nucleares) de processamento. DCL (dicer-like): semelhante à enzima dicer. DIG: digoxigenina. diRNA (double-strand break interacting RNA): RNA de interação com DNA apresentando quebra de dupla fita. dsRBD (double-stranded RNA Binding Domain): domínio de ligação a RNA de dupla fita. dsRBP (double-stranded RNA Binding Protein): proteína de ligação a RNA de dupla fita. dsRNA (double-stranded RNA): RNA de dupla fita. e.g. (do Latin, exempli gratia): por exemplo. g: aceleração da gravidade (9,8 metros por segundo ao quadrado) g: grama GMUCT (Genome-wide Mapping of Uncapped and Cleaved Transcripts): mapeamento em escala genômica de transcritos clivados e sem CAP. Lista de abreviaturas, acrônimos, siglas e símbolos Cópia gratuita - venda proibida h: hora(s) HITS-CLIP (High-Throughput Sequencing of RNA isolated by Cross-linking Immunoprecipitation): sequenciamento em larga escala de RNAs isolados por ligação cruzada (mediada por luz ultravioleta) e imunoprecipitação (da proteína argonauta). i.e.: (do Latin, id est): isto é. iCLIP (individual-nucleotide resolution Cross-Linking Immunoprecipitation): resolução em nível nucleotídico (obtida após) ligação cruzada (mediada por luz ultravioleta) e imunoprecipitação (da proteína argonauta). isomiRs: isômeros de microRNAs. KO (Knock Out): nocaute. lmiRNA (long miRNA): microRNA longo (~24 nucleotídeos). LNA (Locked Nucleic Acid): ácido nucleico “fechado”. lncRNA (long noncoding RNA): RNA longo e não codificador (de proteínas). M: molar MBS (MicroRNA Binding Site): sítio de ligação ao miRNA. MFE (Minimum Free Energy): energia livre mínima. MFEI (Minimum Free Energy Index): índice de energia livre mínima. miPEP (microRNA-encoded peptide): peptídeo codificado por (um transcrito primário de) microRNA. miR BS (microRNA Binding Site): o mesmo que MBS. miRISC (microRNA-Induced Silencing Complex): complexo de silenciamento induzido pelo miRNA maduro. miRNA*: microRNA estrela. miRtron: fusão dos termos miRNA e íntron. mm: milímetro(s) moRNAs (miRNA offsets): miRNAs “deslocados”. MRE (MicroRNA Response Element; MicroRNA Recognition Element): o mesmo que MBS. ncRNA (non-coding RNA): RNA não codificador (de proteínas). NGS (Next Generation Sequencing): sequenciamento de última geração. nt: nucleotídeo(s). oligo-dT: oligômero de desoxitimidina monofostato. oncomiR: fusão dos termos oncology e miRNA. ORF (Open Reading Frame): fase aberta de leitura. PAR-CLIP (Photoactivatable-Ribonucleoside-enhanced Cross-linking Immuno precipitation): ligação cruzada (mediada por luz ultravioleta) aprimorada pelo uso de ribonucleosídeos fotoativáveis (seguida por) imunoprecipitação (da proteína argonauta). PARE (Parallel Analysis of RNA Ends): análise em paralelo de extremidades de RNA. pb: par(es) de bases P-bodies (Processing Bodies): corpos (citoplasmáticos) de processamento. Cópia gratuita - venda proibida pg: picograma (10-12 grama) piRNA (PIWI-interacting RNA): RNA de interação com a proteína PIWI. Poli-A: polímero de adenosina monofosfato. pre-miRNA (precursor microRNA): microRNA precursor. pri-miRNA (primary microRNA): microRNA primário. qiRNA(QDE-2 interacting RNA): RNA de interação com a proteína QDE-2. qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction): reação em cadeia e quantitativa da (DNA) polimerase. RdRP (RNA-dependent RNA Polymerase): RNA polimerase dependente de RNA. RIP-Chip (Ribonucleoprotein Immunoprecipitation-microarray): imunoprecipitação de ribonucleoproteínas (contendo a proteína argonauta, seguida de análise por) microarranjos. RISC (RNA-Induced Silencing Complex): complexo de silenciamento induzido por RNA. RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing complex): complexo de silenciamento transcricional induzido por RNA. RLC (RISC-Loading Complex): complexo de carregamento do RISC. RT (Reverse Transcription): transcrição reversa. RT-PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction): transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da (DNA) polimerase. RT-qPCR (Reverse Transcription – quantitative Polymerase Chain Reaction): transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da (DNA) polimerase, de natureza quantitativa. scanRNA (scanning RNA): RNA de varredura. siRISC (small interfering RNA-Induced Silencing Complex): complexo de silenciamento induzido pelo pequeno RNA de interferência. siRNA (small interfering RNA): pequeno RNA de interferência. smRNA (small RNA): pequeno RNA. SNP (Single Nucleotide Polymorphism): polimorfismo de um único nucleotídeo. stRNA (small temporal RNA): pequeno RNA (de controle) temporal. SVM (Suport Vector Machine): máquina de vetores de suporte. TAP-Tar (Tandem Affinity Purification of miRNA Target mRNAs): purificação por afinidade, e em tandem, de mRNAs alvos de miRNAs. tasiRNA (trans-acting small interfering RNA): pequeno RNA de interferência de ação em trans. TE (Transposable Element): elemento transponível. TGS (Transcriptional Gene Silencing): silenciamento gênico transcricional. tRFs (transfer RNA-derived Fragments): fragmentos derivados de RNA transportador. tRNA (transfer RNA): RNA transportador. ΔΔCt: (Delta Delta Cycle threshold): diferença da diferença do ciclo de limiar. Cópia gratuita - venda proibida Cópia gratuita - venda proibida Prefácio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 Capítulo 1. Histórico dos microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23 Dr.a Ernna Herida Domingues de Oliveira, Dr.a Daniela Zimbardi, Tiago Jorge Alves de Souza, Gustavo Borges, Gabriel José de Carli e Prof. Dr. Tiago Campos Pereira 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24 1 .1 C. elegans – um modelo de pesquisa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24 1 .2 O controle do desenvolvimento larval de C. elegans . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24 2 . lin-4: o primeiro microRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24 3 . O primeiro breakthrough: lin-4 é caracterizado como um pequeno RNA regulatório . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26 3 .1 lin-4 controla outros alvos: lin-28 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27 3 .2 Mecanismo de ação de lin-4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28 4 . O segundo breakthrough: outro miRNA é identificado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28 5 . O terceiro breakthrough: miRNAs são evolutivamente conservados . . . . . . . . . . . .28 6 . O quarto breakthrough: microRNAs são abundantes na natureza . . . . . . . . . . . . . .30 7 . O trio de artigos seminais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 7 .1 Artigo 1: Abundância de miRNAs em C. elegans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 7 .2 Artigos 2 e 3: miRNAs em diversas espécies e seus padrões de expressão .31 Sumário Cópia gratuita - venda proibida Capítulo 2. Origem e Evolução de MicroRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33 Prof. Dr. Danillo Pinhal, Pedro Gabriel Nachtigall, Arthur Casulli de Oliveira, Luiz Augusto Bovolenta, Marcos Edgar Herkenhoff 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34 2 . Origem e expansão do repertório de miRNAs nos organismos . . . . . . . . . . . . . . . . .34 3 . Organização genômica de miRNAs em animais e plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39 3 .1 MiRNAs intergênicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39 3 .2 MiRNAs intrônicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 3 .3 MiRNAs exônicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41 3 .4 Clusters de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41 3 .5 A importância da organização genômica em análises filogenéticas . . . . . .43 4 . O genoma como substrato para a gênese de novos miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44 4 .1 Duplicação gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44 4 .2 Duplicação genômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46 4 .3 De novo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47 4 .4 Íntrons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48 4 .5 Pseudogenes, snoRNAs e tRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49 4 .6 Elementos transponíveis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50 4 .7 Transcritos antissenso de miRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51 5 . Mecanismos de diversificação dos transcritos de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52 5 .1 Alteração da região seed e isomiRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53 5 .2 Edição de miRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54 5 .3 Alteração de braço de leitura de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55 5 .4 Mudança de hairpin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .55 6 . Considerações finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56 Capítulo 3. Regulação da abundância de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65 Ighor L.G. Arantes, Prof.a Dr.a Maité F.S. Vaslin, Carolina Alves Pereira Corrêa, Prof. Dr. Tiago Campos Pereira e Prof. Dr. Régis L. Corrêa 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66 2 . Seção A – Biogênese e sua regulação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66 Cópia gratuita - venda proibida 2 .1 A transcrição de microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66 2 .1 .1 Regulação da transcrição . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68 2 .2 Processamento do pri-miRNA em pre-miRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70 2 .2 .1 Regulação do processamento por DROSHA . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71 2 .3 Exportação para o citoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72 2 .4 Processamento do pre-miRNA no citoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72 2 .4 .1 Regulação do processamento por DICER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72 2 .5 Processamento de miRNAs em plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73 2 .6 Modificações pós-transcricionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75 2 .6 .1 Regulação através da cauda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75 2 .6 .2 Edição de RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75 2 .6 .3 Metilação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76 2 .7 Formação do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) . . . . . .76 2 .7 .1 Regulação das proteínas AGO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .77 2 .7 .2 Regras para a seleção da fita guia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78 2 .8 Vias não canônicas de biogênese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78 3 . Seção B – Degradação e sua regulação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80 3 .1 Degradação de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80 4 . Considerações finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81 Capítulo 4. Nomenclatura de microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .89 Prof. Dr. Francis de Morais Franco Nunes 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .90 2 . A biogênese dos miRNAs e sua relação com a nomenclatura . . . . . . . . . . . . . . . . . .90 3 . A nomenclatura e os bancos de dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91 4 . Convenções . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .92 5 . Submissão de sequências para os bancos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .92 6 . Conceitos de “família de microRNAs” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .93 Cópia gratuita - venda proibida Capítulo 5. Mecanismos de ação de microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .95 Prof. Dr. Tiago Campos Pereira, Cristiane de Santis Alves, Geraldo Felipe Ferreira e Silva, Fausto Andrés Ortiz-Morea e Prof. Dr. Fábio Tebaldi Silveira Nogueira 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .96 2 . A maquinaria de silenciamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .96 3 . Mecanismos de ação de microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .96 3 .1 Visão geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .96 3 .2 Processos de inibição da tradução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .97 3 .2 .1 Competição pelo 5’ CAP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .97 3 .2 .2 Inibição da montagem dos ribossomos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .98 3 .2 .3 Deadenilação seguida pelo bloqueio da iniciação da tradução . . .98 3 .2 .4 Dissociação prematura de ribossomos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .99 3 .2 .5 Redução da velocidade de elongação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .99 3 .2 .6 Proteólise durante a fase de elongação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .99 3 .3 Desestabilização do RNA-alvo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 3 .3 .1 Clivagem do transcrito-alvo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 3 .3 .2 Deadenilação seguida de remoção do 5’ CAP . . . . . . . . . . . . . . . . .100 3 .4 Silenciamento transcricional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 3 .4 .1 Metilação do DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 3 .4 .2 Modificações da cromatina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .101 3 .5 Promoção da transcrição . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .102 3 .6 Aumento da eficiência de tradução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .102 4 . Concentração espacial da maquinaria de silenciamento gênico . . . . . . . . . . . . . . .103 4 .1 Corpúsculos de processamento de RNA (P-bodies) . . . . . . . . . . . . . . . . . . .103 4 .2 Retículo endoplasmático . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .103 5 . Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .104 Cópia gratuita - venda proibida Capítulo 6. MicroRNAs virais e miRNAs celulares contra vírus . . . . . . . . . .107 Prof. Dr. Ivan de Godoy Maia, Dr. Douglas Silva Domingues, Dr.a Helena Sanches Marcon 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .108 2 . MicroRNAs codificados pelos vírus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .108 3 . O papel dos miRNAs modulando a interação vírus-hospedeiro . . . . . . . . . . . . . . .111 3 .1 A influência na longevidade das células infectadas . . . . . . . . . . . . . . . . . .112 3 .2 A modulação da resposta imune do hospedeiro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .113 3 .3 A regulação da expressão viral e do hospedeiro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .113 4 . MicroRNAs celulares em resposta a vírus em animais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .114 5 . MicroRNAs celulares em resposta a vírus em vegetais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .115 6 . Conclusões e perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .116 Capítulo 7. MicroRNAs e desenvolvimento vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .119 Eder Marques da Silva, Edna Gicela Ortiz Morea, Carlos Hernán Barrera Rojas, Prof. Dr. Fábio Tebaldi Silveira Nogueira 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .120 2 . MicroRNAs e a transição de fase juvenil para fase adulta em vegetais . . . . . . . . .122 3 . MicroRNAs e desenvolvimento foliar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .123 4 . Papel dos microRNAs na iniciação e desenvolvimento de órgãos reprodutivos . .128 4 .1 MiR172 atuando na regulação de genes de identidade floral . . . . . . . . . .129 4 .2 A via miR159/GAMYB-like é funcional ao longo do desenvolvimento das anteras e também atua no tempo de florescimento . . . . . . . . . . . . . . . . . .130 4 .3 Interação entre vias reguladas por microRNAs durante o desenvolvimento floral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .131 5 . MicroRNAs e desenvolvimento de frutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .131 6 . MicroRNAs e seus efeitos na formação e desenvolvimento do sistema radicular 133 6 .1 MicroRNAs e seus efeitos na formação da raiz principal . . . . . . . . . . . . . .134 6 .2 MicroRNAs e seus efeitos funcionais na formação e desenvolvimento de raízes laterais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .135 6 .3 Correlação dos microRNAs com fatores ambientais no desenvolvimento do sistema radicular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .137 7 . Outros aspectos relacionados ao desenvolvimento vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . .138 8 . Desafios e perspectivas das pesquisas relacionadas aos microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .139 Cópia gratuita - venda proibida Capítulo 8. MicroRNAs em insetos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .147 Felipe Martelli, Natália Helena Hernandes, Dr.a Camilla Valente Pires1, Prof.a Dr.a Zilá Luz Paulino Simões, Prof. Dr. Francis Morais Franco Nunes 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .148 2 . Ativação do genoma zigótico e embriogênese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .151 3 . Regulação do desenvolvimento e da metamorfose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .152 4 . Regulação do crescimento celular e corporal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .153 5 . Regulação de apoptose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .153 6 . Manutenção e diferenciação de células da linhagem germinativa . . . . . . . . . . . . .154 7 . Regulação do desenvolvimento do sistema nervoso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .155 8 . Regulação do tempo de vida e envelhecimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .155 9 . Regulação do sistema imune . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .156 10 . Regulação da relação inseto vetor-parasita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .157 11 . Efeito sobre variações fenotípicas populacionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .157 12 . Regulação do dimorfismo sexual e comportamento reprodutivo . . . . . . . . . . . . . .158 13 . Regulação do comportamento social . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .158 14 . MicroRNAs na alimentação larval e na determinação de castas . . . . . . . . . . . . . . .159 15 . Considerações finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .160 Capítulo 9. miRNAs na fisiologia humana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .165 Dr. Cesar Seigi Fuziwara, Prof.a Dr.a Carolina Beltrame Del Debbio e Prof.a Dr.a Edna Teruko Kimura 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .166 2 . MiRNAs na fisiologia humana – visão geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .167 3 . Tecido Muscular Cardíaco e Esquelético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .169 3 .1 Coração . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .169 3 .1 .1 Remodelamento cardíaco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .170 3 .2 Músculo esquelético . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .170 4 . Cérebro: Desenvolvimento e plasticidade sináptica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .171 5 . Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .173 Cópia gratuita - venda proibida Capítulo 10. Implicações patológicas da desregulação de microRNAs . . .177 Dr.a Danyella B. Dogini, Dr. André S. Vieira, Simoni H. Avansini, Alexandre H. Berenguer de Matos, Prof.a Dr.a Iscia Lopes-Cendes ......... 177 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .178 2 . MicroRNAs nas doenças neurológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .179 2 .1 As epilepsias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .179 2 .2 A doença de Alzheimer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .180 2 .3 A doença de Huntington . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .181 3 . MicroRNAs e os transtornos psiquiátricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .182 3 .1 A Esquizofrenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .182 3 .2 O Transtorno Afetivo Bipolar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .183 3 .3 O Autismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .183 4 . MicroRNAs nas doenças cardiovasculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .184 5 . MicroRNAs e as doenças autoimunes ou inflamatórias crônicas . . . . . . . . . . . . . .185 5 .1 O Lúpus Eritematoso Sistêmico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .185 5 .2 A Artrite Reumatoide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .186 5 .3 As doenças inflamatórias intestinais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .186 6 . Considerações finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .186 Capítulo 11. Uso de miRNAs no diagnóstico, prognóstico e terapêutica .191 Dr. Júlio Cesar Cetrulo Lorenzi e Dr.a Dalila Lucíola Zanette 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .192 2 . Diagnóstico e prognóstico baseados em miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .192 2 .1 Neoplasias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .192 2 .2 Neoplasias hematológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .193 2 .2 .1 Leucemia Linfocítica Crônica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .193 2 .2 .2 Mieloma Múltiplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .194 2 .2 .3 Leucemias pediátricas agudas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .194 2 .2 .4 Linfomas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .195 2 .3 Tumores sólidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .195 2 .3 .1 Câncer de próstata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .195 2 .3 .2 Câncer colorretal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .196 Cópia gratuita - venda proibida 2 .3 .3 Câncer de pulmão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .197 2 .3 .4 Câncer de mama . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .198 2 .3 .5 Câncer gástrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .198 2 .3 .6 Câncer cervical . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .199 2 .4 miRNAs como biomarcadores em outras doenças . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200 2 .4 .1 Diabetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200 2 .4 .2 Doenças neurológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200 2 .4 .3 Epilepsia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200 2 .4 .4 Esclerose Múltipla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200 2 .4 .5 Doença de Alzheimer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .201 3 . Aplicações terapêuticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .201 3 .1 Terapêutica baseada na inibição miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .201 3 .2 Terapêutica baseada na reposição de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .202 3 .3 Perspectivas para o uso terapêutico dos miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .203 Capítulo 12. Análise molecular de microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .211 Dr.a Ana Paula Körbes e Dr.a Flávia Cristina de Paula Freitas 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .212 2 . Técnicas para clonagem de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .212 2 .1 Métodos de isolamento e purificação de pequenos RNAs . . . . . . . . . . . . .213 2 .2 Métodos de quantificação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .216 2 .3 Estratégias de clonagem de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .216 3 . Técnicas para análise de expressão gênica . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .220 3 .1 Northern blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .220 3 .2 Hibridização in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .222 3 .3 RT-qPCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .222 3 .4 Normalização e análise dos dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .225 3 .5 Microarranjos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .226 3 .6 Normalização e análise dos dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .228 3 .7 Sequenciamento em larga escala . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .228 3 .8 Análise dos dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .230 3 .9 Quantificação das moléculas primárias e precursoras dos miRNAs . . . . .231 4 . Bancos de dados para análises de identificação dos miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . .231 Cópia gratuita - venda proibida Capítulo 13. Abordagens computacionais e moleculares para identificação de alvos de microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .237 Prof. Dr. Régis Lopes Corrêa, Kelly Costa de Almeida, Thiago Sardou Charret, Dr. Júlio Cesar Cetrulo Lorenzi, Prof. Dr. Tiago Campos Pereira e Prof. Dr. Vinícius D’Avila Bitencourt Pascoal 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .238 2 . Métodos in silico para predição de alvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .238 3 . Métodos moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .241 3 .1 Baseados na superexpressão de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .241 3 .1 .1 Seguida por análise via northern blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .241 3 .1 .2 Acompanhada por ensaios de bioluminescência . . . . . . . . . . . . . .241 3 .1 .2 .1 Controles negativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .243 3 .1 .2 .2 Controle de normalização . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .243 3 .1 .2 .3 Limitações . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .243 3 .1 .3 Seguida por análise com microarranjos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .244 3 .1 .4 Seguida por sequenciamento em larga escala e proteômica . . . .244 3 .2 Baseados na inibição da atividade de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .245 3 .3 Detecção do sítio de clivagem por 5’ RACE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .245 3 .4 Detecção experimental de alvos de miRNAs em escala genômica . . . . . .247 3 .4 .1 PARE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .247 3 .4 .2 GMUCT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .249 3 .5 Imunoprecipitação de proteínas Argonauta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .249 3 .5 .1 RIP-Chip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .250 3 .5 .2 TAP-Tar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .250 3 .5 .3 HITS-CLIP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .251 3 .5 .4 PAR-CLIP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .251 3 .5 .5 iCLIP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .251 3 .5 .6 CLASH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .252 4 . Considerações finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .252 Cópia gratuita - venda proibida Capítulo 14. Estratégias para depleção de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .255 Prof.a Dr.a Cláudia Vianna Maurer-Morelli e Prof. Dr. Vinícius D’Ávila Bitencourt Pascoal 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .256 2 . Oligonucleotídeos antissenso - antimiRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .256 2 .1 Vantagens e limitações dos antimiRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .258 3 . Esponjas artificiais de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .258 3 .1 Vantagens e limitações das esponjas artificiais de miRNAs . . . . . . . . . . . .260 4 . Modificações em genes de microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .260 4 .1 Knockouts gerados por métodos tradicionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .262 4 .2 Knockouts condicionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .262 4 .3 Vantagens e limitações dos knockouts gerados por métodos tradicionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .263 4 .4 Knockouts gerados por CRISPR/Cas9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .263 4 .5 Exemplos de aplicação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .264 4 .6 Vantagens e limitações do CRISPR/Cas9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .265 5 . Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .266 Capítulo 15. MiRNAs artificiais, miméticos e superexpressão de miRNAs endógenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .269 Dr.a Franceli Rodrigues Kulcheski, Dr.a Daniela Zimbardi e Prof. Dr. Tiago Campos Pereira 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .270 2 . Superexpressão de microRNAs endógenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .270 3 . MicroRNAs artificiais (amiRNAs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .270 3 .1 Vantagens sobre outras técnicas de silenciamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . .271 3 .2 Parâmetros para projetar amiRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .273 3 .3 Construção de amiRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .276 3 .4 Aplicações no estudo de função gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .276 3 .5 Uso no melhoramento genético de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .278 4 . miRNAs miméticos (miRNA mimics; mimetic miRNAs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .280 Cópia gratuita - venda proibida 4 .1 Aspectos gerais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .280 4 .2 Aplicações . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .281 4 .3 miRNAs miméticos funcionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .281 5 . Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .282 Capítulo 16. Predição computacional de microRNAs em genomas . . . . . . .287 Fábio Ribeiro Cerqueira, Yuri Bento Marques, Thales Francisco Mota Carvalho, José Cleydson Ferreira da Silva, Marcos Fernando Basso, Guilherme Loss de Morais e Joseane Biso de Carvalho 1 . Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .288 2 . Bancos de dados de microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .289 3 . Métodos para predição computacional de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .293 3 .1 Métodos comparativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .293 3 .2 Métodos não comparativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .297 3 .3 Métodos baseados em dados de sequenciamento de nova geração . . . . .305 4 . Considerações finais e perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .315 Capítulo 17. Novas fronteiras em miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .321 Dr.a Amanda Freire de Assis, Beatriz Alves Guerra, Emilio Tarcitano, Dr.a Ernna Hérida Domingues de Oliveira, Prof. Dr. Marcelo A. Mori, Silas Pinto da Silva e Prof. Dr. Tiago Campos Pereira 1 . Seção 1 - RNAs endógenos competidores: esponjas naturais de miRNAs Dr.a Amanda Freire de Assis e Dr.a Ernna Hérida Domingues de Oliveira 1 .1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .322 1 .2 Considerações moleculares para as interações entre ceRNAs . . . . . . . . . .323 1 .3 Identificação de ceRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .323 1 .4 RNAs circulares: uma nova e curiosa classe de ceRNAs . . . . . . . . . . . . . . .324 Cópia gratuita - venda proibida 2 . Seção 2 - miRNAs circulantes Prof. Dr. Marcelo A. Mori, Emilio Tarcitano, Silas Pinto da Silva e Beatriz Alves Guerra 2 .1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .326 2 .2 miRNAs circulantes em humanos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .326 2 .3 Transporte intertecidual de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .327 2 .4 Presença de miRNAs em fluidos corporais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .329 2 .5 Papel biológico de miRNAs circulantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .331 2 .6 Perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .332 3 . Seção 3 - miPEPs: peptídeos codificados por pri-miRNAs Prof. Dr. Tiago Campos Pereira 3 .1 miPEPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .333 3 .2 Perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .334 Índice remissivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .339 Cópia gratuita - venda proibida Prefácio 21 Prefácio Tiago Campos Pereira É impressionante pensar que, até alguns anos atrás, pequenos RNAs eram vistos simplesmente como resultado da degradação de outros transcritos celulares, isto é, lixo molecular. Na passagem do milênio, uma reviravolta tomou o mundo da ciência: os microRNAs são, na verdade, como ouro em pó no solo – uma abundante riqueza ignorada pelo tamanho reduzido, antes confundida com sujeira na vastidão do citoplasma. Ninguém poderia imaginar que moléculas tão pequenas pudessem ser capazes de tão grandes façanhas dentro da célula: ligar e desligar milhares de genes de forma orquestrada, regulando virtualmente todos os processos da vida. A história dos microRNAs se confunde muito com a dos siRNAs. Inicialmente, essas duas classes de moléculas eram facilmente distinguíveis. Mas, em pouco tempo, notou-se que um mesmo conjunto de enzimas e de proteínas estava envolvido com a biogênese e com a ação delas (Dicer, Dicer-like, Drosha, RISC, entre outras), sugerindo que miRNAs e siRNAs eram muito próximos. Com o passar dos anos, o acúmulo de dados na literatura evidenciou algo ainda mais dramático: existe um continuum de pequenos RNAs (qiRNA, diRNA, siRNA, piRNA, miRNA, tasiRNA etc.) que interagem com um continuum de proteínas relativamente semelhantes (membros da família Argonauta, PIWI e outros), gerando um continuum de efeitos: silenciamento gênico transcricional, inibição da tradução, clivagem do RNA-alvo, ativação da transcrição, intensificação da tradução, deleção de sequências genômicas, entre outros. Vinte e dois anos após os primeirospapers descrevendo miRNAs, encontramo-nos ainda desvendando a real contribuição desses pequenos RNAs para a célula. Este livro foi planejado objetivando apresentar o vasto tema dos miRNAs de maneira clara, didática, abrangente e atualizada, para que fosse acessível a graduandos e a docentes. Os primeiros cinco capítulos abordam aspectos elementares: o histórico das descobertas dos miRNAs, a evolução dos genes de miRNAs, a biogênese e degradação, as regras de nomenclatura e os mecanismos moleculares de ação. Os quatro capítulos seguintes (6 a 9) discorrem sobre miRNAs na regulação de uma imensa variedade de processos biológicos em vírus, plantas, animais e seres humanos. Os dois capítulos posteriores (10 e 11) discutem sobre os efeitos patológicos da desregulação desses miRNAs, assim como o potencial uso dessas moléculas no diagnóstico, prognóstico e terapia. Os outros cinco capítulos (12 a 16) abordam um imensa gama de técnicas e de ferramentas moleculares e computacionais que permitem o estudo dos miRNAs e de seus genes-alvo. Por fim, o último capítulo (17) apresenta recentes descobertas no mundo dos pequenos RNAs. Esta obra é o segundo volume de uma série chamada “Introdução a ...”, por mim organizada, que objetiva apresentar de maneira clara as técnicas e os tópicos recentes da genética e da biologia molecular aos alunos e aos pesquisadores brasileiros. O primeiro volume – Introdução à técnica de Interferência por RNA - RNAi (de 2013, com 170 páginas) – Cópia gratuita - venda proibida Introdução ao mundo dos microRNAs22 tem sido um grande sucesso, com disponibilidade na livraria virtual da Sociedade Brasileira de Genética. Visando produzir uma obra ainda melhor, um grande esforço foi aplicado neste segundo volume ao longo de dois anos, para que ele fosse ainda mais abrangente (17 capítulos), mais didático (57 figuras), com diferentes pontos de vista (59 colaboradores), buscando proporcionar ao leitor um texto estruturalmente organizado, simples, moderno e de fácil leitura. Registro aqui meus agradecimentos a todos que auxiliaram direta e indiretamente na produção desta obra (autores, colaboradores, revisores e editores) e às agências de fomento CNPq, CAPES, FAPESP e Fundações de Amparo à Pesquisa dos Estados de todos os autores, por fornecerem todo o arcabouço necessário para a elaboração deste livro. Em especial, agradeço a Deus por me conceder a vida, por me dar a chance de estudar a vida, por me fazer feliz nesta vida e por me conceder a vida eterna. “Fazendo Ele soar a sua voz, logo há rumor de águas no céu, e faz subir os vapores das extremidades da terra; faz os relâmpagos para a chuva, e dos seus tesouros faz sair o vento” (Jeremias 10:13). Cópia gratuita - venda proibida Histórico dos microRNAs 23 Capítulo 1 Histórico dos microRNAs Dr.a Ernna Herida Domingues de Oliveira1, Dr.a Daniela Zimbardi2, Tiago Jorge Alves de Souza1,3, Gustavo Borges4, Gabriel José de Carli3 e Prof. Dr. Tiago Campos Pereira3 1 Depto. de Genética, FMRP – USP, Ribeirão Preto – SP 2 Depto. de Genética, IBB – UNESP, Botucatu – SP 3 Depto. de Biologia, FFCLRP – USP, Ribeirão Preto – SP 4 Hemocentro, FMRP – USP, Ribeirão Preto – SP Estruturação do capítulo 1. Introdução 1.1 C. elegans – um modelo de pesquisa 1.2 O controle do desenvolvimento larval de C. elegans 2. lin-4: o primeiro microRNA 3. O primeiro breakthrough: lin-4 é caracterizado como um pequeno RNA regulatório 3.1 lin-4 controla outros alvos: lin-28 3.2 Mecanismo de ação de lin-4 4. O segundo breakthrough: outro miRNA é identificado 5. O terceiro breakthrough: miRNAs são evolutivamente conservados 6. O quarto breakthrough: microRNAs são abundantes na natureza 7. O trio de artigos seminais 7.1 Artigo 1: Abundância de miRNAs em C. elegans 7.2 Artigos 2 e 3: miRNAs em diversas espécies e seus padrões de expressão Cópia gratuita - venda proibida Introdução ao mundo dos microRNAs24 1. Introdução 1.1 C. elegans – um modelo de pesquisa A pesquisa científica se utiliza de diversas espécies como modelos biológicos, tais como: Mus musculus (camundongo), Rattus norvegicus (rato), Escherichia coli (bactéria), S. cerevisae (levedura), Arabidopsis thaliana (planta), Drosophila melanogaster (mosca), Danio rerio (peixe paulistinha – zebrafish), Xenopus laevis (sapo), entre muitas outras. Uma espécie bem menos conhecida no Brasil mas intensamente utilizada no mundo inteiro é o Caenorhabditis elegans – um nematódeo hermafrodita de vida livre (i.e., não parasita), de aproximadamente 1 mm de comprimento que vive no solo. Curiosamente, indivíduos adultos possuem exatamente 959 células, 302 das quais são neurônios (Wormbook, 2006 e 2010). Essa espécie atraía pouco interesse científico até 1960, quando o pesquisador Sidney Brenner percebeu seu enorme potencial para a biologia celular e do desenvolvimento, introduzindo-a como uma nova espécie-modelo. C. elegans possui um ciclo de vida curto (~72 horas de ovo até a fase adulta, passando por quatro estágios larvais – L1 a L4), seu cultivo em laboratório é simples e de baixo custo, tornando-o um modelo muito interessante (figura 1). Estudos sobre a regulação genética do desenvolvimento e sobre a morte celular programada nessa espécie renderam o prêmio Nobel a Sidney Brenner (junto a outros pesquisadores), em 2002. Outros dois prêmios Nobel tiveram C. elegans como modelo: 2006 (Interferência por RNA) e 2008 (estudos com a proteína GFP). Nessa mesma espécie, os microRNAs foram originalmente descobertos durante estudos focados na biologia do desenvolvimento (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993). 1.2 O controle do desenvolvimento larval de C. elegans O desenvolvimento larval nesse nematódeo é regulado por uma via que envolve genes heterocrônicos essenciais no controle temporal de uma sequência de eventos celulares que ocorrem no período pós-embrionário, acarretando na formação de seus quatro estágios larvais (Ambros e Horvitz, 1984; Ambros e Horvitz, 1987; Ambros, 1989). Mutações nos genes heterocrônicos podem causar um desenvolvimento precoce, em que programas de desenvolvimento tardio são expressos no início do estágio larval; ou atraso no desenvolvimento, em que programas de desenvolvimento precoce são reiterados em estágios tardios (figura 2) (Chalfie et al., 1981; Ambros e Horvitz, 1984). 2. lin-4: o primeiro microRNA Indivíduos adultos com mutações no gene heterocrônico lin-4 não apresentam algumas das estruturas típicas dessa fase do desenvolvimento (como cutícula adulta e vulva), além de não conseguirem ovipor (Chalfie et al., 1981; Ambros e Horvitz, 1987). Adicionalmente, diferentes experimentos sugeriam que lin-4 regulava negativamente outro gene heterocrônico, o lin-14. A proteína LIN-14 é normalmente abundante durante o estágio larval jovem e escassa no estágio larval tardio (Ruvkun e Giusto, 1989). Curiosamente, o aumento temporal da atividade do gene lin-4 refletia na redução dos níveis da proteína LIN-14, evidenciando que Cópia gratuita - venda proibida Histórico dos microRNAs 25 o programa genético de transição entre fases larvais dependia criticamente de lin-4, que atuaria reduzindo a atividade de lin-14 (figura 3) (Feinbaum e Ambros, 1999). Uma vez que os níveis dos transcritos de lin-14 mantinham-se constantes durante todo o desenvolvimento, a queda nos níveis da proteína LIN-14 possivelmente seria devida a um controle pós-transcricional (Wightman et al., 1993). Adicionalmente, o mapeamento da região 3’ UTR do mRNA de mutantes lin-14 com ganho de função (Wightman et al., 1991) e experimentos de fusão gênica (Wightman et al., 1993) definiram que essa região era um elemento necessário para que ocorresse a regulação negativa. Figura 1. O ciclo de vida de Caenorhabditis elegans. Tempo médio de desenvolvimento da espécie a 22 °C. L1-L4: estágioslarvais de 1 a 4. Figura 2. Genes heterocrônicos. Mutações em genes heterocrônicos podem causar um desenvolvimento precoce (e.g., larva de idade referente a L2 mas com aspecto de L3) ou atraso no desenvolvimento (e.g., larva de idade referente a L2 com aspecto de L1). Nota: Por convenção, os genes (e os alelos mutantes) foram indicados em letras minúsculas e em itálico ( lin-14). A proteína correspondente, em letras maiúsculas (LIN-14); o transcrito, em letras minúsculas ( lin-14). Cópia gratuita - venda proibida Introdução ao mundo dos microRNAs26 3. O primeiro breakthrough: lin-4 é caracterizado como um pequeno RNA regulatório Baseado nessas evidências, dois grupos de pesquisa investigaram os mecanismos moleculares precisos pelos quais lin-4 regulava os níveis de expressão da proteína LIN- 14 (Wightman et al., 1993; Lee et al., 1993). Os dados experimentais revelaram que lin-4 localizava-se dentro de um íntron de um gene com função desconhecida. Homólogos desse gene foram encontrados em outras três espécies de Caenorhabditis: C. briggsae, C. remanei e C. vulgaris, indicando que eles poderiam codificar produtos gênicos funcionalmente semelhantes. Além disso, análises de northern blot revelaram a existência de dois transcritos de lin-4 de aproximadamente 22 e 61 nucleotídeos (nt). Outros experimentos envolvendo mutações sítio-dirigidas em possíveis quadros abertos de leitura (Open Reading Frames – ORFs) de lin-4 demonstraram que a atividade do gene não foi afetada, sugerindo fortemente que ele não codificava uma proteína. Adicionalmente, comparações das sequências nucleotídicas revelaram que os transcritos de lin-4 eram complementares a um determinado sítio repetido sete vezes na 3’ UTR de lin-14 (figura 4). A importância dessa complementaridade para a função de lin-4 foi reforçada por diversas observações. Primeiro, a região 3’ UTR de lin-14 que era complementar a lin-4 encontrava-se conservada entre espécies de C. elegans e C. briggsae, sugerindo que a função de lin-4 também seria conservada entre essas espécies. Adicionalmente, mutações na sequência de lin-4 que é complementar a lin-14 alteravam ou desestabilizavam a hibridação entre esses RNAs. Por fim, regiões complementares a lin-4 eram justamente as regiões deletadas no mutante lin-14 com ganho de função, o que acarretou um desenvolvimento larval atrasado em C. elegans (Wightman et al., 1991). Essas evidências apoiaram fortemente a hipótese de que o pequeno RNA lin-4 inibia temporariamente a tradução de lin-14 entre os estágios larvais L1 e L2, através da interação antissenso com determinadas sequências da região 3’ UTR de lin-14. Até então se tinha conhecimento de alguns exemplos de mecanismos naturais de regulação antissenso que afetavam a estabilidade do RNA (Kimelman e Kirschner, 1989; Hildebrandt e Nellen, 1992; revisto em Simons, 1988; revisto em Eguchi et al., 1991). Porém, Figura 3. Lin-4 regula negativamente lin-14. O aumento dos níveis do RNA lin-4 está associado à redução dos níveis da proteína LIN-14. Uma vez que a abundância do RNA lin-14 não se altera, postulava-se que lin-4 modularia negativamente LIN-14 no nível pós-transcricional. Cópia gratuita - venda proibida Histórico dos microRNAs 27 as evidências indicavam que lin-4 provavelmente não controlava a estabilidade do mRNA de lin-14, uma vez que os níveis do transcrito de lin-14 continuavam relativamente constantes durante todo o desenvolvimento do verme e não eram consideravelmente alterados em mutantes de lin-4. Dessa forma, foi sugerido que lin-4 poderia se ligar ao mRNA de lin-14 no citoplasma e inibir a tradução pela interação direta com componentes da maquinaria de tradução. Dados prévios já haviam evidenciado mecanismos naturais afetando a tradução através da interação de um RNA antissenso com a região 5’ UTR de mRNAs, aparentemente interferindo na ligação de ribossomos (Liao et al., 1987; Simons, 1988; Kittle et al., 1989). Por outro lado, os autores consideraram o fato de que se lin-4 não inibisse a tradução diretamente, sua interação com a região 3’ UTR de lin-14 representaria um novo tipo de mecanismo de controle da tradução. Por fim, os autores sugeriram que o RNA de lin-4 poderia agir em conjunto com proteínas, uma vez que as sequências de lin-4 e lin-14 não eram totalmente complementares, havendo a formação de bolhas fora das regiões de hibridação, que poderiam ser sítios de ligação dessas proteínas. Publicados na mesma edição de dezembro de 1993 da revista Cell, esses dois artigos tiveram uma grande importância histórica, uma vez que demonstraram pela primeira vez um processo de regulação pós-transcricional mediado por um pequeno RNA antissenso através da hibridação com a região 3’ UTR do gene-alvo. 3.1 lin-4 controla outros alvos: lin-28 Outro gene heterocrônico crítico para o desenvolvimento normal de C. elegans é o lin-28, que controla a sucessão de L2 para L3. A caracterização molecular desse gene demonstrou que ele codifica uma proteína citoplasmática com domínios de ligação a RNA e apresenta uma alta identidade de sequência com genes de duas outras espécies, C. remanei e C. vulgaris. Adicionalmente, a expressão desse gene se distribui por várias populações celulares e apresenta níveis proteicos elevados no estágio embrionário final e L1, sendo gradualmente reduzidos nos estágios larvais subsequentes. Esse fato sugeria a existência Figura 4. Interação entre lin-4 e lin-14. A. O pequeno RNA de lin-4 (∼21 nt) possui complementaridade parcial com sete sítios na 3’ UTR do mRNA de lin-14. Essas interações senso-antissenso seriam a base do mecanismo molecular pelo qual lin-4 regularia negativamente lin-14. B. Complementaridade parcial entre o RNA lin-4 e os sítios em lin-14. Cópia gratuita - venda proibida Introdução ao mundo dos microRNAs28 de uma regulação pós-transcricional uma vez que, assim como o lin-14, o mRNA de lin-28 foi detectado em todos os estágios do desenvolvimento larval. Nesse contexto, uma descoberta importante foi reportada em 1997, com identificação de uma sequência de 15 nt na região 3’ UTR de lin-28 que também é complementar ao RNA de lin-4, sugerindo que a expressão do lin-28 seria regulada por esse RNA (Moss et al., 1997). Esse dado foi corroborado pela observação de que mutantes com ausência da atividade de lin-4 apresentam expressão proteica elevada de lin-28 nos estágios larvais finais e nos vermes adultos. Somando-se a isso, vermes contendo uma versão mutante de lin-28 (com deleção da sequência de 15 nt) apresentaram um fenótipo retardado dominante característico de L2 e atraso ou inibição do desenvolvimento para os estágios subsequentes. 3.2 Mecanismo de ação de lin-4 Em seguida, Olsen e Ambros (1999) procuraram detalhar ainda mais a associação entre lin-4 e lin-14 ao avaliar o comprimento da cauda poli-A do mRNA de lin-14 entre os estágios L1/L2. Eles verificaram que a associação do lin-4 com a extremidade 3’ UTR desse gene não promovia a desestabilização do mRNA por deadenilação. A avaliação do perfil polissomal por ensaio de sedimentação pelo gradiente de sacarose não identificou alteração no recrutamento do mRNA de lin-14 ou na montagem da maquinaria de tradução funcional ou, ainda, no deslocamento do mRNA para regiões subcelulares ausentes dessa maquinaria entre os estágios larvais L1 e L2. Da mesma forma, a presença do RNA de lin-4 foi identificada na fração ativa composta de polirribossomos somente em L2. Em conjunto, esses dados sugeriram que outro mecanismo traducional posterior à etapa de iniciação estaria envolvido na repressão de LIN-14 por lin-4. A repressão traducional promovida por pequenos RNAs regulatórios poderia ocorrer pós-iniciação, pela atuação nos mecanismos envolvidos na elongação, terminação ou mesmo na liberação da proteínafuncional. Mais do que uma ação isolada, os resultados obtidos nesse estudo sugeriam que uma combinação de efeitos inibitórios pela atuação em mais de uma etapa da tradução ou, ainda, por um aumento na taxa de degradação da proteína recém-sintetizada poderiam ser os responsáveis pela repressão exercida por lin-4. 4. O segundo breakthrough: outro miRNA é identificado Sete anos após a descoberta do primeiro pequeno RNA antissenso regulador lin-4, um grupo liderado por Gary Ruvkun da Universidade Harvard publicava na Nature a existência de um segundo RNA regulador em C. elegans: o let-7 (Reinhart et al., 2000). Inicialmente, esse trabalho descreveu a base molecular do padrão temporal de atividade do gene lin-41, que possuía sítios complementares na porção 3’ UTR ao RNA de let-7, demostrando que essa região era responsável pela diminuição da expressão da proteína LIN-41 durante a passagem do estágio L4 para adulto. 5. O terceiro breakthrough: miRNAs são evolutivamente conservados A descoberta desse segundo pequeno RNA regulador sugeria que talvez esses RNAs fizessem parte de um fenômeno evolutivamente antigo e importante no processo de regulação Cópia gratuita - venda proibida Histórico dos microRNAs 29 da expressão gênica. Assim, o mesmo grupo de Harvard buscou identificar homólogos desses genes, os quais eles denominaram stRNAs (small temporal RNAs), encontrando-os em vertebrados, hemicordados, ascídias, artrópodes, anelídeos, moluscos e no homem (Pasquinelli et al., 2000). Inicialmente, essa busca foi possível através da comparação de sequências do RNA let-7 entre C. elegans, D. melanogaster e o homem. Os resultados revelaram que havia um alinhamento perfeito de sequências entre C. elegans e D. melanogaster, e parcial com diversas regiões no genoma humano. Adicionalmente, a estrutura secundária do tipo stem-loop (semelhantes a um grampo de cabelo) predita para o precursor do transcrito de let-7 em C. elegans (Lee et al., 1993) também era conservada para os precursores de D. melanogaster e humanos (figura 5). De acordo com os autores, esses precursores seriam eficientemente processados (por uma enzima, até então desconhecida) nos pequenos RNAs maduros detectados nessas espécies. Diversos outros aspectos da natureza dessas moléculas eram preservados: (i) o perfil de expressão temporal, (ii) os sítios complementares na porção 3’ UTR e (iii) o tamanho do RNA (∼21 nt). Por fim, os autores notaram similaridades entre os stRNAs e os siRNAs (small interfering RNAs) (Hamilton e Baulcombe, 1999), tais como o tamanho (21-25 nt) e o fato de ambos estarem envolvidos em fenômenos de regulação gênica pós-transcricional, sugerindo um laço evolutivo mais profundo entre os dois. Todas essas novas descobertas reluziam como um novo mundo à frente, mediado por pequenos RNAs regulatórios até então elusivos para a ciência. Figura 5. Conservação da estrutura secundária dos stRNAs (e miRNAs). O transcrito precursor do let-7 (com ∼70 nt) apresenta uma estrutura secundária no formato de um grampo de cabelo (hairpin, também denominada stem-loop ou foldback). Essa estrutura também foi predita para homólogos desse stRNA em outras espécies. Era proposto que esses precursores seriam processados por uma enzima então desconhecida (dicer) nos pequenos RNA maduros (∼21 nt). Cópia gratuita - venda proibida Introdução ao mundo dos microRNAs30 6. O quarto breakthrough: microRNAs são abundantes na natureza Até o ano 2000, a comunidade científica tinha conhecimento da existência de apenas dois stRNAs (lin-4 e let-7) controlando os padrões temporais de desenvolvimento dos diferentes estágios em C. elegans (Lee et al., 1993; Wightman et al. 1993; Moss et al., 1997; Reinhart et al., 2000). Em outubro de 2001, um trio de artigos seminais, sequencialmente publicados na mesma edição da Science, abalaria a comunidade científica. Eles reportavam que os stRNAs faziam parte de uma classe muito maior de moléculas, agora denominadas microRNAs, bem mais abundantes do que se imaginava anteriormente (Lau et al., 2001; Lee e Ambros, 2001; Lagos-Quintana et al., 2001). 7. O trio de artigos seminais 7.1 Artigo 1: Abundância de miRNAs em C. elegans A partir dos conhecimentos acerca da estrutura e função de lin-4 e let-7, Lau e colaboradores (2001) desenvolveram um trabalho a procura de RNAs, em C. elegans, que se assemelhassem com stRNAs/siRNAs e que, adicionalmente, pudessem desempenhar um papel mais abrangente na regulação gênica desse organismo modelo. Naquele mesmo ano três outros trabalhos haviam evidenciado que a biogênese dessas duas classes de pequenos RNAs demandava a atividade de uma endoribonuclease chamada dicer (Bernstein et al., 2001). Dessa forma, foram isolados os RNAs endógenos de C. elegans que apresentavam características semelhantes aos produtos resultantes da clivagem pela dicer, por meio de três critérios: (i) comprimento de ∼22 nucleotídeos; (ii) nucleotídeo monofosfato na extremidade 5’; (iii) grupo hidroxila na extremidade 3’. Os 330 fragmentos que obedeceram a esses critérios foram identificados e clonados. Desses, 300 possuíam o potencial de se combinar com sequências genômicas formando estruturas em grampos (stem-loop) semelhantes às que provavelmente eram necessárias para o processamento dos stRNAs. Esses 300 clones correspondiam a 54 sequências únicas (lin-4, let-7 e outros RNAs). O grupo de Lau verificou que, apesar de os microRNAs lin-4 e let-7 estarem localizados no braço 5’ da estrutura em forma de alça, apenas um quarto dos miRNAs analisados estavam localizados nesse braço. Isso implicou que os produtos estáveis resultantes do processamento por dicer poderiam residir em ambos os braços do precursor. Os autores estudaram também a função dos microRNAs encontrados, para verificar se algum deles atuava como um stRNA. Dentre os microRNAs que apresentaram padrão diferencial durante o desenvolvimento, destacou-se o miR-84, pois possuía sequência 77% idêntica ao let-7, sendo considerado como indistinguível desse stRNA. Dessa forma, eles especularam que o miR-84 provavelmente seria um stRNA que trabalhava em conjunto com o microRNA let-7 no controle da transição larva/adulto. Tal ideia foi fundamentada pela identificação de sítios plausíveis de ligação para o miR-84 na região 3’ UTR de determinados genes heterocrônicos. Cópia gratuita - venda proibida Histórico dos microRNAs 31 Com os dados obtidos, verificou-se grande semelhança entre os microRNAs de C. elegans analisados nesse trabalho e os microRNAs da espécie C. briggsae, sendo que mais de 40% dos microRNAs dessas espécies aparentemente eram idênticos. Os microRNAs de C. elegans também demonstraram possuir homologias discerníveis em organismos evolutivamente distantes. O let-7, por exemplo, possui homólogos discerníveis em espécies como drosófila e humanos. Ao menos sete outros genes de microRNAs (mir-1, mir-2, mir-34, mir-60, mir-72, mir-79 e mir-84) aparentavam ser conservados em drosófila, sendo que a maioria desses também em humanos. Portanto, os dados indicaram que em culturas de C. elegans saudáveis e em crescimento, a regulação por microRNAs executava um papel biológico natural e que genes de RNAs pequenos como lin-4 e let-7 eram mais abundantes nessa espécie modelo do que se pensava previamente. Em face aos dados obtidos, os autores levantaram a hipótese de que os novos microRNAs descritos, juntamente com os RNAs lin-4 e let-7, constituíam uma importante e abundante classe de riboreguladores. A diversidade dos padrões de expressão dos genes desses microRNAs demonstrou que eles provavelmente agiriam em uma variedade de vias regulatórias muito além do controle do desenvolvimento. 7.2 Artigos 2 e 3: miRNAs em diversas espécies e seus padrões de expressão Com o mesmo intuito de identificar novos microRNAs em organismos
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