Elisa 8 2, 10 2, 11 2, 12 2- Imunologia

Prévia do material em texto

Imunoensaios  
_______________________ Imunologia Veterinária _______________________ 
Conceito 
Baseia-se na reação específica entre 
antígeno e seu anticorpo específico, que 
através de algum equipamento ou 
estratégia pode ser constatado 
Imunoensaio enzimático 
 
Os conjugados são anticorpos carreados 
por enzimas 
ELISA 
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay 
Ensaio que utiliza uma enzima ligada ao 
anticorpo. 
Utiliza-se o antígeno na forma solúvel 
marcado por uma enzima ligada 
covalentemente ao anticorpo, quando o 
substrato é quebrado, há liberação de cor. 
 
 
 
 
Resultado 
Se o exame for qualitativo, ou seja, tem 
como objetivo positivar ou negativar o 
paciente para alguma infecção, então é 
necessário utilizar poços controle, um com 
soro certamente positivo e outro com soro 
certamente negativo. Além disso, 
estipula-se um valor de leitura do 
espectrofotômetro, chamado de ​Cut Off 
como valor de divisão entre positivo e 
negativo. 
Para calcular o ​Cut off​, utiliza-se a média 
das absorbâncias dos controles negativos + 
2 ou 3 desvios-padrão. 
Qual a função do desvio-padrão? Os 
valores de falso positivo e negativo são os 
que beiram essa linha de corte? 
 
Se o exame for quantitativo, como o ELISA 
de captura, é necessário a realização de 
uma curva padrão com amostra em 
concentração de analito conhecidas. 
CLIA 
Chemiluminescent Immunoassay 
Tipo de ELISA, em que é liberado luz no 
lugar da cor, normalmente mais sensível. 
 
ELISA direto 
Tem como objetivo a descoberta da 
presença ou não de antígeno. 
O conjugado (anticorpo + enzima) é ligado 
diretamente ao antígeno. 
 
O início do experimento é a sensibilização 
da placa com antígeno a 4​o​C por 16h. Em 
seguida, há uma lavagem para retirar o 
excesso não ligado. Então, são adicionadas 
proteínas não específicas (ex: BSA - 
Albumina Sérica Bovina) ​a 37 oC por 1h. 
Isso serve para ocupar os espaços entre os 
antígenos de forma a não permitir 
nenhuma ligação. Em seguida, é feita uma 
nova lavagem. Por fim, são adicionados os 
conjugados específicos para se ligarem ao 
antígeno a 37​o​C por 1h, uma nova lavagem 
e adição dos substratos, que é quebrado, 
resultando em uma cor, legível por um 
espectrofotômetro. 
 
 
ELISA indireto 
Tem como objetivo buscar anticorpos no 
soro do paciente. 
Para isso, é necessário adição de antígenos 
diferentes nas placas de ELISA, o que após 
a lavagem para remover o excesso e o 
bloqueio com proteínas inerentes, recebe o 
soro do paciente. Caso, o soro possua o 
anticorpo específico, chamado de primário, 
para algum dos antígenos da placa, há 
ligação. Então ocorre uma nova lavagem 
para remover os demais anticorpos do soro 
do paciente e adição do conjugado, que 
possui o anticorpo secundário, um 
anti-anticorpo primário industrializado, e 
uma enzima e após uma nova lavagem a 
adição do substrato. Assim, a ligação da 
enzima ao anticorpo secundário, unido ao 
anticorpo primário encaixado ao antígeno, 
quebra o substrato, liberando cor legível ao 
espectrofotômetro. Por isso, é chamado de 
ELISA indireto. 
 
Exemplo para infecção com SARS-COV 2 
 
O CONJUGADO É FORMADO POR UM 
ANTICORPO CONTRA 
IMUNOGLOBULINA HUMANA EM 
GERAL OU É CONTRA A 
IMUNOGLOBULINA HUMANA DE 
INTERESSE DA PESQUISA? 
 
ELISA de Captura 
Tem como objetivo identificar a presença 
de um analito (citocina, hormônios, 
medicamentos…) e quantificá-los. 
Primeiro, a placa é sensibilizada com 
anticorpo sensível ao analito, que após a 
lavagem e bloqueio com proteína inerte, é 
adicionado o soro do paciente, que se 
houver o analito, será ligado ao anticorpo. 
Então faz-se uma nova lavagem, e adição 
do conjugado comercial que reconhece o 
analito, formando um sanduíche. Após 
uma nova lavagem, o substrato é 
adicionado e ocorre a reação de coloração. 
ELISA de competição 
O Resultado positivo desse teste é feito 
pela ausência de cor ou luz, e o negativo, 
pela presença. 
Tem como objetivo a busca de anticorpos 
ou analitos. 
Para realização desse exame é necessário, 
sensibilizar a placa com o composto de 
interesse produzido em laboratório, 
proteínas inertes e suas lavagens. Então, 
diferentemente dos outros processos, o 
soro do paciente é introduzido e sem 
lavagem, o conjugado sensível ao composto 
de interesse (anticorpo ou analito do 
paciente) é adicionado. Por isso, haverá 
uma competição entre o composto 
industrial e o do paciente pela ligação com 
o conjugado. Por fim, há uma lavagem, 
levando o conjugado com o composto do 
paciente embora, em caso positivo, 
deixando uma ausência ou diminuição de 
cor promovida pela ligação do substrato ao 
conjugado. Porém, se não houver composto 
suficiente no soro, o conjugado liga-se ao 
substrato e não é lavado, aumentando a 
absorbância de cor. 
No ELISA de competição, quanto menor a 
absorbância, maior a quantidade do 
composto no soro do paciente.