2 PL1- PROTEINAS- DOSEAMENTO

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pl1- Proteínas – doseamento por espetrofotometria UV/visível
Conceitos básicos sobre ondas e cor
Frequência = 1 oscilação por segundo
Os λ (comprimentos de onde) que uma certa substância absorve são característicos da sua estrutura.
Cada substância tem um espetro de absorção característico, podendo, desta forma, ser identificada.
Lei de Lambert-Beer 
A quantidade de radiação absorvida pode ser calculada de diferentes formas: 
▪ Transmitância T = I/I0 T(%) 
 = 100 x T 
▪ Absorvância A = log10 I0 /I A 
 = log10 1/T
Leis da Absorção
1. A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução que ela atravessa
Ex: Absorvância: 20g/l > 10g/l
 2. A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através das amostras
Ex: Tem maior absorvância 3cm > 1cm
Limite de linearidade
A concentração tem um limite de saturação.
Com o aumento da concentração a linearidade deixa de ser constante.
O limite de linearidade é 2 mg/ml.
Uma amostra desconhecida só e lida até 2 mg/ml e 0.40 de absorvância.
A absorvância é o dobro da concentração, mas só até o limite de linearidade.
Albumina 
Concentração no plasma: 45 g/L 
Representa ≈ 60% das proteínas plasmáticas 
Principais funções:
· Manutenção da pressão osmótica do plasma 
· Transporte de: 
▪ Hormonas esteroides 
▪ Ácidos gordos livres 
▪ Bilirrubina 
▪ Fármacos 
▪ Iões (Ca2+ e Cu2+)
Método de Bradford 
Técnica para a determinação de proteínas totais que utiliza o corante Coomassie brilliant blue G-250.
A interação entre o corante de Coomassie com a proteína, causa uma visível mudança de coloração inicialmente castanho para tons de azul, de acordo com a concentração da proteína. 
Solução com concentração nula ou baixa em proteínas- cor castanha.
Solução com concentração crescente de proteínas- coloração mais azulada.
Este método tem sido utilizado para a determinação de proteínas totais em diversos meios: plasma sanguíneo, saliva humana, produtos alimentares, leite humano, etc. 
Vantagens: 
Simples; rápido; económico; 
Alta sensibilidade na deteção; 
Poucas etapas; 
Não requer aquecimento; 
Possui grande estabilidade colorimétrica.
Procedimento experimental
PARTE 1: DETERMINAÇÃO DO ESPETRO DE ABSORÇÃO DO COMPLEXO ALBUMINA-BRADFORD
1. Colocar 50 µL de uma solução a 5 mg/mL de BSA (albumina) e juntar 50 µL de água destilada num tubo de ensaio. 
2. Homogeneizar bem no vórtex. 
3. Preparar outro tubo de ensaio com 100 µL de água destilada. 
4. Adicionar 0,5 mL de reagente de Bradford (azul Coomassie) a cada tubo e aguardar 5 minutos. 
5. Regular o espetrofotómetro para 400 nm. Acertar o zero com a solução de BSA de concentração 0 mg/mL – Branco. Registar a absorvância. 
6. Continuar as medições em intervalos de 15 nm até um comprimento de onda de 700 nm.
PARTE 2: CONSTRUÇÃO DE UMA CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA A PROTEÍNA BSA 
1. Pipetar para tubos de ensaio devidamente marcados: 
2. Homogeneizar os tubos no vórtex. 
3. Adicionar 0,5 mL de reagente de Bradford (azul Coomassie) e aguardar 5 minutos. 
4. Regular o espetrofotómetro para 595 nm. Calibrar com a solução de BSA de concentração 0 mg/ml – Branco. Ler a absorvância de cada solução preparada no ponto 1.
PARTE 3: DETERMINAÇÃO DA ABSORVÂNCIA DAS AMOSTRAS 
1. Pipetar, para tubos de ensaio devidamente marcados, 0,1 mL de cada amostra e adicionar 0,5 mL de reagente de Bradford. 
2. Homogeneizar e aguardar 5 minutos. 
3. Ler a absorvância de cada amostra a 595 nm. Caso os valores de absorvância sejam muito elevados, diluir as amostras
Questões pós-laboratoriais
1. Indique qual a enzima associada à primeira etapa de degradação enzimática do colesterol.
Na primeira etapa da degradação enzimática do colesterol é utilizada uma enzima, a colesterol esterase. 
2. Indique o principal motivo para a utilização desta enzima.
De entre os vários motivos para a utilização desta enzima, podemos realçar a sua ação de hidrolise sobre os ésteres de colesteril, isto é, a clivagem da ligação entre os ácidos gordos e colesterol.
3. Com base nas bulas de cada kit comercial, ambos os protocolos requerem um período de incubação.
3.1. Relacione os períodos/temperaturas de incubação com o que ocorre a nível biológico.
Nos processos a nível biológico, a temperatura corporal (aproximadamente 37ºC) é um dos parâmetros ideais para a atuação das proteínas. Considerando que não se apresentava um valor tão discrepante desta no laboratório, é possível efetuar um paralelo de similaridade entre o que ocorre a nível biológico e o experienciado na atividade prática. Além deste fator, o período de incubação experimental (ligeiramente inferior a 10 minutos) permite a decomposição do colesterol presente na amostra por ação das enzimas. Se a temperatura verificada fosse 37ºC, este processo ocorreria num intervalo de tempo menor.
4. Indique a importância do doseamento rápido de biomoléculas como o colesterol e os triglicerídeos.
O doseamento rápido de biomoléculas como o colesterol é um processo fulcral na manutenção dos níveis normais das mesmas, além de ter extrema importância na prevenção de doenças de foro cardiovascular.