Imunoensaios utilizando conjugados (parte 1) - Imunologia clínica

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Identificar a presença de antígenos ou 
anticorpos, empregando moléculas marcadas com 
compostos detectáveis (conjugados). 
 Imunofluorescência: onde se conjuga moléculas 
fluorescentes; 
 Radioimunoensaio: se houve ligação emite 
radiação; 
 ELISA: utiliza conjugado antígeno-anticorpo 
conjugado com uma enzima capaz de degradar 
um substrato gerando um cromógeno. 
 Western Bloting: exame que utiliza eletroforese; 
 Imunocromatografia: famoso, teste de gravidez 
da farmácia é um exemplo. 
 
Os testes de imunofluorescência empregam 
antígeno ou anticorpo ligados covalentemente a 
fluorocromos sem perder sua reatividade específica 
com o antígeno. 
 Fluorocromos: são moléculas que absorvem luz 
em comprimento de onda baixo e elevada 
energia e emitem luz em comprimento de onda 
maior e menor energia (fluorescência). 
 Relação proteína com fluoresceína. 
 Vantagens: Sensibilidade, simples padronização 
e execução, especificidade e reprodutibilidade; 
 Desvantagens: necessidade de microscópio de 
fluorescência, subjetividade na leitura e não-
automação. 
 Os testes de imunofluorescência podem ser 
classificados de acordo com: 
 o composto marcado (antígeno ou anticorpo); 
 pelo método (competitivo ou não competitivo); 
 por serem homogêneos ou heterogêneos; 
 pela realização em fase sólida ou líquida; 
 
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA 
 A principal aplicação da imunofluorescência 
direta é na imunofenotipagem de células utilizando 
o citofluorômetro de fluxo. 
 Pesquisa de antígenos em células ou tecidos 
utilizando anticorpo específico marcado; 
 Se tiver antígeno, vai ocorrer a ligação com o 
conjugado e mesmo após a lavagem, o antígeno 
permanece – teste positivo. 
 Se não tiver antígeno, não ocorre a ligação e após 
a lavagem, nada será corado – teste negativo. 
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA 
 A imunofluorescência indireta amplifica o 
sinal e aumenta a sensibilidade do teste. Além disso, 
pode ser empregado na pesquisa de: 
 antígenos (plasmódio em hemácia) e 
 anticorpos (sífilis, toxoplasmose, rubéola, 
citomegalovírus, vírus do herpes simples, 
malária, doença de Chagas); 
 Pesquisa de anticorpos (método indireto); 
 O anticorpo presente na amostra do paciente 
reage com um antígeno específico fixado em 
uma lâmina de microscopia; 
 Após a primeira lavagem, é adicionado um 
anticorpo anti-humano (conjugado) marcado 
com substância fluorescente; 
 Após uma segunda lavagem, a observação de 
fluorescência é feita ao microscópio fluorescente 
em câmera escura. 
 Se ocorre ligação dos anticorpos e o conjugado, 
veremos a reação fluorescente; 
 Se não ocorreu ligação dos anticorpos com o 
conjugado, não veremos a reação; 
imunoensaios utilizando conjugados 
AULA 2 – PARTE 1 
introdução 
imunofluorescência 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Fluoroimunoensaio é um método de imunologia 
para diagnóstico clínico particularmente relevante 
na triagem neonatal e pré-natal e na detecção de 
proteínas, vírus, anticorpos, biomarcadores tumorais 
e resíduos de fármacos. 
 Utiliza enzimas como substratos fluorescentes; 
 Utiliza aparelhos denominados de Fluorômetro; 
 As técnicas diferem quanto ao suporte sólido e 
também à forma de aplicar o sinal; 
 Possui sensibilidade e especificada elevadas; 
 Bom método para dosagens hormonais; 
 Ex.: ELFA, FEIA 
 
É uma técnica utilizada para contar, examinar e 
classificar partículas microscópicas suspensas em 
meio líquido em fluxo. Permite a análise de vários 
parâmetros simultaneamente, sendo conhecida 
também por citometria de fluxo multiparamétrica. 
 Separação de células marcadas por 
fluorescência; 
 Ac dirigidos contra moléculas de membrana ou 
antígenos do conjunto de diferenciação (CD); 
 Cada Ac é marcado com um fluorocromos 
diferente; 
 Teste qualitativo e quantitativo; 
 
 
 
 O radioimunoensaio quantifica reações 
Anticorpo-Antígeno, permitindo medidas precisas 
em amostras desconhecidas. 
 Utilizam um reagente marcado, antígeno ou 
anticorpo, para quantificar o antígeno ou o 
anticorpo da amostra; 
 O composto desconhecido pode ser determinado 
pela medida da radioatividade emitida; 
 Um dos métodos mais sensíveis para análise 
quantitativa das reações Ac-Ag; 
 Tem como princípio: a quantidade de reagente 
marcado (Ag ou Ac) quantifica o Ag ou Ac não 
marcado na amostra; 
 Pode ser competitivo ou por excesso de reagente. 
 O radioisótopo mais utilizado é o iodo-125. 
fluoroimunoensaios 
citofluorimetria de fluxo 
radioimunoensaio (rie) 
 
 
 
  Laboratórios optam por técnicas que empregam 
reagentes de maior estabilidade devido a: 
 meia-vida dos reagentes utilizados; 
 o risco operacional; 
 a necessidade de medidas especiais e de 
elevado custo de biossegurança; 
 descarte de material. 
 Vantagens: alta sensibilidade, permite medidas 
rápidas e precisas, limiar de detecção em 
nanogramas e picrogramas. 
 Desvantagens: risco operacional (radiação), vida 
média dos reagentes e elevado custo de 
biossegurança e problemas com descarte de 
material. 
 antígeno =  radiação 
 
 
 
 
 Nesse teste, estaremos trabalhando com 
anticorpos marcados para quantificar antígenos. 
 
 
 
ensaio imunorradiométrico