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Apostila Fisiologia do Ciclo Estral em Bovinos UNIVERSIDADE FEDERAL DO OESTE DA BAHIA DISCIPLINA: FISIOPATOLOGIA DA REPRODUÇÃO TURMA: DOCENTE: ALEXANDRA SOARES RODRIGUES DATA: DISCENTE: Dinâmica folicular A dinâmica folicular constitui o controle da população de folículos presente nos ovários ao longo da vida da fêmea, estendendo-se desde a formação do conjunto inicial de folículos até a sua saída contínua e irreversível, culminando com a ovulação ou atresia folicular (BINELLI et al., 2009). Na fêmea bovina a reserva folicular ovariana é formada ainda durante a vida embrionária por meio da migração de células germinativas primordiais do saco vitelino para a gônada primitiva, onde as mesmas sofrem sucessivos ciclos mitóticos se diferenciando em oogônia (SENGER, 2003; MELLO et al., 2013). Em torno de 70 a 85 dias de gestação as oogônias iniciam as divisões meióticas estacionando-se na fase de diplóteno da prófase I, sendo denominado oócito primário. Simultaneamente estas células são circundadas por uma lâmina basal e um conjunto de células achatadas de origem mesonéfrica ou mesotelial, compondo os chamados folículos primordiais quiescentes (FAIR, 2003). Segundo Picton (2001), ainda durante a vida fetal o pool de folículos primordiais quiescentes sofre uma redução significativa por atresia e apoptose, fazendo com que as fêmeas bovinas apresentem no momento do nascimento populações foliculares que variam entre 130.000 a 250.000 folículos e diversos estudos têm demonstrado que esta variação no número de folículos pré-antrais é uma característica intríseca e individual do animal (BINELLI et al., 2009; SANTOS et al., 2013). A limitada reserva folicular ovariana é constantemente ativada durante toda a vida reprodutiva da fêmea (TANG et al., 2012). A ativação de folículos primordiais é desencadeada por um conjunto de fatores parácrinos e autócrinos e se caracteriza por proliferação e mudança na morfologia das células da camada granulosa, passando de achatada a cuboide, tendo-se início a formação da zona pelúcida e das células da teca interna com consequente evolução para estágio de folículo primário (SCARAMUZZI et al., 2011). O desenvolvimento dos folículos secundários caracteriza-se pelo aumento do número de camadas das células da granulosa, apresentando em torno de duas ou mais camadas, associado ao término da formação da zona pelúcida e da camada de células da teca interna (FORTUNE, 2003). Na transição para o estágio terciário ocorre intensa proliferação e diferenciação de células da granulosa, células da teca interna, externa, lâmina basal e zona pelúcida, assim, inicia-se a produção de líquido folicular por meio da diferenciação esteroidogênica associada à completa formação das células da teca que constitui uma camada densamente vascularizada promovendo suprimento de fatores endócrinos aos folículos (PICTON, 2001; AERTS e BOLS, 2010a). Com a produção do líquido folicular ocorre uma separação entre as camadas das células da granulosa em dois tipos morfológicos e funcionalmente distintos, as células do cumulus que estabelecem um íntimo contato com oócito por meio de junções comunicantes essenciais para transporte bidirecional de moléculas necessárias para crescimento e controle do desenvolvimento folicular e oócitário; e as células murais que ficam em contato com a lâmina basal, formando um epitélio estratificado que compõe a parede do folículo e tem papel esteroidogênico (GILCHRIST et al., 2004). Estudos realizados por Buratini (2006) indicam que as junções comunicantes são formadas nos primeiros estágios de crescimento pré-antral e sofrem retração durante a foliculogênese antral em decorrência a ação das gonadotrofinas. Os fatores intra e extraovarianos que afetam o desenvolvimento folicular pré-antral ainda não foram totalmente elucidados. Alguns achados têm demonstrado que o crescimento de folículos ocorre predominantemente na interface cortico-medular do ovário, a qual representa uma região altamente irrigada supondo que hormônios, mediadores e nutrientes podem influenciar no processo inicial de desenvolvimento folicular (AERTS e BOLLS, 2010a). Neste contexto, as gonadotrofinas apresentam um papel apenas permissivo, sendo toda a cascata de crescimento folicular pré-antral coordenada por interações entre fatores de crescimento produzidos pelas células da granulosa e/ ou oócito, dentre os quais se destaca o fator de crescimento das células tronco e seu receptor Kit ligante (C-Kit), o fator de crescimento fibroblástico (FGF), o fator de crescimento epidérmico (EGF), peptídeo intestinal vasoativo (VIP) e alguns membros da família dos fatores de crescimento transformantes β (TGF-β) destacando-se o fator de crescimento e iniciação 9 (GDF-9) e a proteína morfogênica óssea 15 (BMP15), além do hormônio anti-mulleriano (AMH), ativinas e inibinas (ESPINOZA-VILLAVICENCIO et al., 2007; MELLO et al., 2013; TANG et al., 2012). Webb et al. (2004) desenvolveram uma série de estudos com folículos pré-antrais de bovinos, demonstrando que nos estágios finais de crescimento essas estruturas apresentavam receptores para gonadotrofina, assim como a expressão de enzimas esteroidogênicas do tipo citocromo P450. Desta forma, ficou comprovado que a síntese de estradiol inicia-se nas fases finais da foliculogênese pré-antral e caracteriza-se por ações coordenadas do Hormônio Luteinizante (LH) e do Hormônio Folículo Estimulante (FSH) em seus receptores nas células da teca e da granulosa, respectivamente. Esta interação leva à ativação de uma cascata enzimática, iniciando com um estímulo a enzima citocromo P450 clivadora da cadeia lateral de colesterol (P450scc), responsável pela conversão do colesterol em pregnenolona e subsequente ação da citocromo P450 hidroxilase (P450c17), promovendo a síntese de androsterona a partir de pregnenolona nas células da teca. Posteriormente, nas células da granulosa, a enzima citocromo P450 aromatase é ativada, levando a produção de estradiol 17-β a partir de androsterona (BAO e GARVERICK, 1998). Nesta fase, um conjunto de fatores de crescimento semelhante a insulina exerce um efeito sinérgico à ação das gonadotrofinas por meio de um sistema denominado fator de crescimento semelhante à insulina (IGF). Este sistema é composto por dois ligantes IGF-I e IGF-II, seus respectivos receptores; seis proteínas ligadoras de IGF (IGFBP-1, 2, 3, 4, 5 e 6), além de proteases das IGFBP. O mecanismo de ação do sistema IGF é complexo e envolve interações dos fatores de crescimento com receptores e IGFBP que previnem a ligação do IGF com o receptor, além da ação das proteases da IGFBP que neutralizam a atividade das proteínas ligadoras de IGF e liberam o IGF bioativo. Em bovinos acredita-se que IGF I e II têm papel importante na esteroidogênese, formação da cavidade antral e sobrevivência folicular, sendo sua biodisponibilidade regulada pela interação entre todos componentes do sistema IGF (WEBB et al., 2007; SILVA et al., 2009; LUZ et al., 2015). A transição folículo pré-antral para antral ocorre a partir do aparecimento de inúmeras cavidades repletas de fluído folicular entre as células da granulosa que se coalescem em uma única cavidade folicular denominada antro (AERTS e BOLS, 2010b). O desenvolvimento folicular antral em bovinos se caracteriza por duas fases distintas. Primeiramente, há um crescimento “lento” com duração de aproximadamente 30 dias, que se inicia com a aquisição do antro até o estágio de pequenos folículos antrais. A segunda fase, de crescimento “rápido”, pode durar até dez dias e é descrita como ondas de desenvolvimento foliculares e compõem os ciclos reprodutivos em bovinos (OLIVEIRA et al., 2011). Em média, duas a três ondasde desenvolvimento folicular constitui cada ciclo estral, podendo ocorrer em menor frequência ciclos com uma ou quatro ondas. O número de ondas em cada ciclo estral é uma característica de alta repetibilidade individual e acredita-se estar relacionado com a categoria animal (TAYLOR e RAJAMAHENDRAN, 1991; AERTS e BOLS, 2010b), com uma maior frequência de ciclos de três ondas para novilha e duas ondas para vaca (BORGES et al., 2001; ALVES et al., 2002). Alves et al. (2002), ao comparar o número de ondas de crescimento folicular entre vacas lactantes da raça Holandesa e mestiças, evidenciaram maior ocorrência de duas ondas de desenvolvimento folicular, não havendo efeito do grupamento genético para esta característica. Adicionalmente a estes estudos, Endo et al. (2012) demonstraram não haver diferença no número de ondas foliculares que compõe o ciclo estral entre vacas Holandesas lactantes e não lactantes, com predomínio de duas ondas em ambas as classes. Já Borges et al. (2001), em um trabalho semelhante, porém com novilhas mestiças, demonstraram a predominância de três ondas de desenvolvimento folicular. O ciclo estral bovino tem uma duração média de 21 dias com uma variabilidade de 17 a 24 dias (SENGER, 2003; FORDE et al., 2011). Diversos autores têm demonstrado que existe uma influência entre número de ondas foliculares e a extensão do ciclo, com ciclos de duas e três ondas apresentando extensão em média de 21 e 23 dias, respectivamente. Estes autores demonstraram ainda que cada onda de desenvolvimento folicular tem duração de cerca de nove a dez dias. Desta forma, no ciclo estral de duas ondas, a primeira e segunda onda ocorreram, respectivamente, nos dias zero e dez. Enquanto no ciclo estral de três ondas a primeira, segunda e terceira ocorreram nos dias zero, nove e 16, simultaneamente (SIROIS e FORTUNE, 1988; GINTHER et al., 1989; BORGES et al., 2001; BORGES et al., 2004). As ondas de desenvolvimento folicular não são característica exclusiva de animais que atingiram a puberdade, mas ocorrem em animais em anestro, pré-puberes e gestantes. Cada onda de desenvolvimento folicular é caracterizada pela ocorrência de cinco eventos: emergência, seleção, divergência, dominância e atresia folicular (WEBB et al., 2004). A emergência folicular é uma fase de crescimento comum de um conjunto de folículos com 2 a 5mm de diâmetro, sob ação das gonadotrofinas particularmente pelo incremento das concentrações de FSH (RENSIS e PETERS, 1999). Adams et al. (1992), em experimentos mensurando as concentrações de FSH e sua relação com a emergência da onda folicular, determinaram que ocorre elevação transitória dos níveis plasmáticos desse hormônio acompanhado da emergência de um pool de folículos que crescem durante 2 a 3 dias, alcançando diâmetro em torno 4 a 8,5mm. Durante muitos anos, acreditou-se que a emergência era marcada pelo crescimento do número constante de 23 a 25 folículos antrais (ADAMS et al., 1992; GINTHER et al., 1996). No entanto, com a evolução do emprego da ultrassonografia na avaliação da dinâmica folicular ovariana verificou-se que os zebuínos apresentavam uma superioridade numérica de folículo recrutados por onda, com o crescimento em média de 49 a 64 folículos (SARTORI et al., 2010), enquanto estudos iniciais em mestiços demonstraram valores intermediários, com a emergência de cerca de 29,6 folículos por onda (CARVALHO et al., 2008a). Esta característica intrínseca tem sido justificada pelo fato dos indivíduos Bos taurus indicus e seus mestiços apresentarem maiores níveis circulantes de IGF-I e insulina livres, os quais aumentam a sensibilidade das células da granulosa ao FSH, favorecendo assim o recrutamento folicular (ALVAREZ et al., 2000; SARTORI e BARROS, 2011). Nos últimos anos houve crescente interesse no estudo do número de folículos antrais presentes no momento do recrutamento em fêmeas Bos taurus taurus, Bos taurus indicus e mestiços. Assim, diversos pesquisadores têm demonstrado que o número de folículos antrais presente no momento da emergência é uma característica que apresenta alta variabilidade individual (IRELAND et al., 2007; JIMENEZ-KRASSEL et al., 2009; SILVA-SANTOS et al., 2014a; SILVA-SANTOS et al., 2014b e RODRIGUES et al., 2015). Estes novos conceitos se iniciaram com os trabalhos de Burns et al. (2005) em vacas Bos taurus taurus, os quais verificaram uma grande variação no número de folículos entre oito a 54 por animal, apresentando uma alta repetibilidade individual. De forma semelhante, Silva-Santos et al. (2014b) mensuraram esta característica em fêmeas Bos taurus indicus e mestiços de corte em clima tropical e confirmaram a existência de animais com alta e baixa população folicular antral constituída, respectivamente, por nove e 47 folículos. Estes autores demonstraram também ser um padrão que se repete a cada onda folicular, no entanto, a maioria destes estudos abordaram esta característica em bovinos mestiços de corte, havendo uma escassez de estudos em relação a bovinos mestiços leiteiros. Após a fase de crescimento folicular comum, ocorre diferença nas taxas de crescimento entre os folículos, evento denominando divergência folicular (GINTHER et al 1996). A divergência no crescimento folicular está associada à redução nas concentrações de FSH, por meio de um mecanismo de feedback que ocorre entre os folículos e o eixo hipotalâmico- hipofisário-gonadal. O aumento das concentrações de FSH na emergência promove um incremento na ação das enzimas esteroidogênicas, levando uma maior concentração de estradiol. Em associação, o estradiol e a inibina fazem retroalimentação negativa na hipófise anterior, ocasionando redução dos níveis de FSH (WILTBANK et al., 2002; FORDE et al., 2011). Estudos demonstraram que durante a fase de crescimento comum, a ação de todos os folículos contribui para a redução nas concentrações de FSH. Entretanto, a partir da divergência o maior folículo é o principal responsável pelo declínio das concentrações circulantes de FSH e exige níveis reduzidos deste hormônio para o seu contínuo crescimento (GINTHER et al., 2000). Assim, ocorre a seleção de um único folículo denominado dominante que consegue continuar a se desenvolver em um ambiente com baixos níveis de FSH. O folículo dominante expressa receptores para LH nas células da granulosa por meio de um evento chamado mudança na dependência de gonadotrofina (XU et al., 1995). Trabalhos recentes, avaliando a expressão de RNA mensageiro para receptores de LH nas células da granulosa de fêmeas zebuínas antes e após a divergência folicular, comprovaram que a expressão de receptores de LH nas células da granulosa dos futuros folículos dominantes ocorre como uma consequência do processo de seleção (NOGUEIRA et al., 2007; BARROS et al., 2009). Sartori et al. (2001), trabalhando com fêmeas Holandesas, verificaram que apenas após a seleção, os folículos apresentam responsividade à aplicação exógena de LH, demonstrando in vivo que a mudança na dependência de gonadotrofinas é essencial para a continuidade do crescimento folicular e aquisição de capacidade ovulatória. Posteriormente, foi também comprovada uma associação positiva entre a quantidade de receptores LH nas células da granulosa e a capacidade ovulatória do folículo dominante em bovinos (SIMÕES, 2009). A seleção folicular determina aumento no nível de estradiol no folículo dominante em consequência a maior expressão da enzima aromatase nas células da granulosa deste folículo. Este mecanismo é extremamente complexo e não se encontra totalmente elucidado, mas sabe- se que envolve a participação de hormônios gonadotróficos e gonadais, assim como, a ação de inúmeros fatores de crescimento pertencentes à superfamília TGFβ e IGF, estes últimos vêm sendo apontados como essenciais para manutenção da saúde e do crescimento folicular (ADAMS et al., 2008; FORDEet al., 2011; GINTHER et al., 2003). De acordo com Ginther et al. (1996) e Sartori et al. (2001), no momento do desvio folicular, fêmeas taurinas leiteiras apresentam folículo dominante com diâmetro de 8,5 e 9,1mm e folículo subordinado com diâmetro de 7,2 e 7,9mm, respectivamente. Entretanto, em estudos semelhantes, porém utilizando a subespécie zebuína, os autores verificaram a ocorrência da divergência folicular quando o diâmetro do folículo dominante encontrou-se em torno de 6,20 e 6,10mm e do folículo subordinado apresentou cerca de 5,90 e 5,40mm, respectivamente (SARTORELLI et al., 2005). Em experimento com animais da raça Holandesa, Sartori et al. (2004) verificaram que a categoria animal influencia o tamanho do folículo dominante no momento do divergência folicular, com vacas lactantes apresentando folículo dominante de 9,8mm, significativamente, superior aqueles presente nas novilhas de em média 8,3mm. Complementando estes achados, Bastos et al. (2010) demonstram que vacas não lactantes apresentam folículo dominante, no momento do desvio, com diâmetros de 8,9mm, se assemelhando aqueles apresentados pelas novilhas. Estas diferenças entre diâmetro do folículo dominante e subordinado em indivíduos Bos taurus taurus e Bos taurus indicus podem ser atribuídas a diferentes taxas de crescimento dos folículos entre as subespécies (SARTORI e BARROS, 2011). Carvalho et al. (2008a) evidenciaram que animais zebuínos apresentam índices de crescimento folicular de 0,9mm/dia, significativamente inferior aqueles apresentados por animais europeus e seus mestiços que foram de 1,1 e 1,2mm/dia, respectivamente. Em concordância com estes achados, Borges et al. (2001) verificaram taxas de crescimento do folículo ovulatório em fêmeas mestiças 1,0 a 1,4mm/dia, se assemelhando-se as taxas apresentadas pelas fêmeas taurinas. Em espécies monovulatórias, após a divergência e a seleção, ocorre contínuo crescimento do folículo dominante até atingir seu diâmetro máximo em uma fase denominada dominância, enquanto o folículo subordinado e os demais remanescentes sofrem atresia (GINTHER et a., 1996). Neste período, o folículo dominante continuará produzindo altos níveis de estradiol e inibina, que exercem retroalimentação negativa sobre a liberação de FSH na hipófise anterior, impedindo o crescimento dos demais folículos subordinados e o surgimento de uma nova onda folicular (DISKIN et al., 2003). Durante a dominância o folículo atinge altos índices de crescimento e alcança seu diâmetro máximo (GINTHER et al., 1996). Ginther et al. (1989), trabalhando com dinâmica folicular em vacas Holandesas, demonstraram diâmetro máximo do folículo dominante de 16,5mm, divergindo daquele reportado por Viana et al. (2000) que em estudos com animais da raça Gir, observaram folículos dominantes com diâmetro máximo de 12,4mm. Em experimentos semelhantes, porém avaliando esta características entre distintos grupamentos genéticos, Carvalho et al. (2008a) confirmaram que fêmeas zebuínas apresentavam folículo dominante com dimensão de 9,5mm, estatisticamente, inferior aqueles apresentados por animais taurinos e mestiços de 11,00 e 12,00mm, respectivamente. Estes resultados têm sugerido que fêmeas Bos taurus taurus x Bos taurus indicus apresentam características foliculares de tamanho semelhante aquelas apresentadas por animais Bos taurus taurus (ALVES et al., 2002). Estudos têm relatado que vacas leiteiras lactantes apresentam o desenvolvimento de maiores folículos que novilhas e animais não lactantes e esta característica tem impactado negativamente os índices de fertilidade dos animais lactantes (SARTORI et al., 2004). Estes achados podem ser explicados pelo fato destes animais apresentarem um metabolismo de esteróides aumentado e, apesar dos maiores diâmetros foliculares, as concentrações circulantes de estradiol são reduzidas em relação a vacas não lactantes e novilhas. Consequentemente, os indivíduos neste estágio fisiológico têm apresentado um período prologado de dominância que entre outros fatores pode afetar a qualidade do oócito ovulado. Contudo, o mecanismo exato pelo qual o período prolongado de crescimento folicular tem afetado a fertilidade das fêmeas leiteiras lactantes, ainda apresenta muitos resultados controversos e não foi totalmente elucidado (SARTORI et al., 2004; ENDO et al., 2012). Ao final do período de dominância, o incremento da concentração periférica de estradiol exerce efeito positivo sobre o hipotálamo e a hipófise, aumentando a frequência de pulsos de liberação de Hormônio Liberador de Gonadotrofina (GnRH) e LH, respectivamente. Porém, os níveis de progesterona irão modular a frequência de liberação de GnRH e LH. Na presença de um corpo lúteo (CL) funcional, o padrão de liberação dos pulsos de LH alcançará um perfil com baixa frequência e alta amplitude levando à atresia do folículo dominante. Desta forma, apenas quando os níveis circulantes de progesterona estiverem baixos, os pulsos de liberação do LH ocorrerão em uma alta frequência e baixa amplitude, promovendo profundas mudanças no folículo dominante, fazendo com que o mesmo atinja o estágio pré- ovulatório, produzindo estradiol suficiente para induzir o estro, um pico de LH e posterior ovulação (RENSIS e PETERS, 1999; WILTBANK et al., 2002; ADAMS et al., 2008). Os altos níveis de estradiol produzidos pelo folículo pré-ovulatório desencadeiam uma série de alterações caracterizadas por descarga de muco vaginal translúcido, vulva edemaciada, mugidos frequentes, intensa movimentação, lordose, aumento na frequência de micção, comportamento homossexual, finalmente o animal fica sexualmente receptivo a monta e a ocorrência da cópula, caracterizando um estágio do ciclo estral denominado estro (BARUSELLI et al., 2007). O folículo pré-ovulatório alcança o diâmetro máximo e o limiar nível de estradiol, o qual estimula o pico pré-ovulatório de LH e a ocorrência da ovulação em cerca 24 a 32 horas após (SARTORI e BARROS, 2011). Em bovinos, o pico pré-ovulatório de LH estimula a síntese de ácido hialurônico com a expansão das células do cumulus, leva o folículo a produzir prostaglandinas e histamina que são essenciais para aumentar o fluxo sanguíneo, promover sua ruptura e liberação dos oócitos, além de preparar as células da granulosa e da teca para o processo de luteinização (AERTS e BOLS, 2010b). As subespécies zebuínas e taurinas apresentam particularidades em relação à duração e incidência do comportamento de estro (SARTORI e BARROS, 2011). Ávila Pires et al. (2003), usando um aparelho de radiotelemetria para identificação do estro em zebuínos da raça Gir, observaram duração do estro em média de 12 horas, semelhante aos resultados encontrados por Mizuta (2003) para vacas Nelore e mestiços, demonstrando uma média de duração do estro (12,90h) e (12,40h) sendo 3,40h mais curto do que os verificados em fêmeas da raça Angus (16,30h). Em associação a estes achados os autores constataram também que 30% dos animais avaliados iniciaram e finalizaram o estro no período noturno. Além do grupamento genético, outros fatores como idade, condições ambientais e produção de leite podem afetar a expressão de estro em bovinos (BARUSELI et al., 2007). Wiltbank et al. (2006) demonstraram que vacas Holandesas (Bos taurus taurus) de alta produção (acima de 40kg de leite) também apresentam estro de curta duração, verificando relação negativa entre a produção de leite e o período de incidência do estro. Desta forma, algumas fêmeas mestiças com altos níveis de produção, assim como, vacas Holandesas podem apresentar estas alterações (FORDE et al., 2011). Estas peculiaridades fisiológicas, associadas aos altos índices de anestro pós-parto, constituem as principais dificuldades dos programas de inseminação artificial (IA) convencional que nos últimos anos, foram superados com a evolução dos protocolospara sincronização do estro e da ovulação permitindo a Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF) (BÓ et al., 2003). Dinâmica luteal A dinâmica luteal constitui de variações cíclicas e regulares nas características estruturais e funcionais do CL. Este evento foi identificado devido a flutuação na concentração circulante de progesterona que ocorre ao longo do ciclo estral, estando relacionada ao crescimento, a manutenção e a regressão luteal (BORGES et al., 2003). O CL é uma estrutura predominante entre o dia 4 e 17 do ciclo estral. Estudos a respeito do desenvolvimento luteal em vacas da raça Gir, detectaram por ultrassonografia o CL pela primeira vez por volta do dia dois a três dias após a ovulação (VIANA et al., 2000). Contudo, alguns autores avaliando esta característica em fêmeas Holandesas, identificaram esta estrutura 12 horas após a ruptura do folículo ovulatório, determinando que em fêmeas com estruturas luteais de maiores diâmetros, há a possibilidade de identificação precoce do CL (KASTELIC et al., 1990). No ciclo reprodutivo bovino a dinâmica luteal pode ser dividida em duas fases distintas denominadas luteogênese e luteólise (SENGER, 2003). Luteogênese O CL é uma glândula transitória que se origina rapidamente dois a três dias após a ovulação, a partir da luteinização das células remanescentes do folículo, acompanhada por uma intensa angiogênese e vascularização (MIYAMOTO et al., 2009; FORDE et al., 2011). Esta estrutura sintetiza como principal produto a progesterona, porém secreta em menores quantidades outras substâncias como relaxina, ocitocina e prostaglandinas (SENGER, 2003). Uma nova interface ao estudo da dinâmica luteal foi aberta com o advento da ultrassonografia, que associado com avaliações histológicas permitiram o acesso às características morfológicas dos CLs e melhor entendimento do processo de formação luteal (BORGES et al., 2003; PAREJA et al., 2010). Os principais eventos que marcam a luteogênese constituem a migração, a diferenciação e a proliferação celular (MARTIN e FERREIRA, 2009). Com a ovulação, o espaço previamente ocupado pelo folículo é invadido por células endoteliais, pericitos, fibroblastos e células do sistema imune que deixam a corrente sanguínea em direção ao tecido luteal em formação, caracterizando a fase de migração (DAVIS et al., 2003). Ao alcançarem este local, ocorre uma reorganização das células foliculares remanescentes e as migratórias, originando uma massa de células incialmente denominada de corpo hemorrágico que posteriormente se diferenciam para compor a estrutura histológica do CL (BERTAN et al., 2006). A diferenciação é um mecanismo iniciado no momento do pico pré-ovulatório de LH com a luteinização das células foliculares da teca e da granulosa, as quais se convertem, respectivamente, em pequenas e grandes células luteais, apresentando uma mudança no perfil esteroidogênico tendo como produto final a secreção de progesterona (WILTBANK et al., 2002; BERTAN et al., 2006). De acordo com estudos de Bao e Garverick (1998), a diferenciação das células luteais em estruturas capazes de produzir progesterona ocorre em consequência de um significativo aumento na expressão de proteínas transportadoras de colesterol para o interior da membrana mitocondrial e de enzimas esteroidogênicas necessárias para conversão de colesterol em progesterona, destacando-se a citocromo P450scc. O processo de luteinização exercido pelo LH continua durante toda a formação do CL (BERTAN et al., 2006). Quintal-franco et al. (1999) avaliaram a dinâmica luteal de fêmeas bovinas mestiças e demonstraram que os animais com baixos níveis de LH na luteogênese apresentaram CL menores e reduzida produção de progesterona. Concluindo que o LH desempenha um importante papel para desenvolvimento de uma massa luteal saudável morfológica e funcionalmente. Após formação da massa luteal inicial, ocorre uma intensa proliferação celular, levando ao crescimento linear do CL até atingir sua máxima dimensão e funcionalidade. Durante este período, as grandes células luteais se hipertrofiam, passando por profundo incremento de tamanho, enquanto as pequenas células luteais, fibroblastos e células endoteliais sofrem sucessivas multiplicações numéricas (SCHAMS e BERISHA, 2004). Este intenso crescimento luteal é semelhante a uma proliferação de massa tumoral e ao longo de 11 dias, permite o CL sair de um peso de 0,2g para aproximadamente de 4g (FIELDS e FIELDS, 1996). Na maioria das espécies domésticas, inclusive em bovinos, o CL é uma massa heterogênea formada por duas populações distintas de células: as pequenas células luteais derivadas das células da teca e as grandes células luteais derivadas das células da granulosa. As pequenas células luteais apresentam um diâmetro de até 20µm e, sob estímulo do LH produzem baixas concentrações de progesterona. As grandes células luteais medem de 20 a 50µm, produzem altas quantidades de progesterona e não são responsivas ao LH (NISWENDER et al., 2000). O corpo lúteo completamente formado possui um percentual de 5% a 95% de células luteínicas maiores e menores, respectivamente. As células maiores ocupam 40% do volume total e são responsáveis por 85% da progesterona produzida. O volume total é completado por 28% de células menores, 6% de fibroblastos, 14% de células endoteliais e macrófagos, 2% de outros tipos de células e 10% de espaço intercelular (FIELDS e FIELDS, 1996; SALLES e ARAÚJO, 2010; TREVISOL et al., 2015). Células não esteroidogênicas também desempenham papel crucial para o funcionamento do CL. Os fibroblastos representam o componente estrutural do tecido produzindo colágeno, glicosaminoglicanos e citocinas. As células endoteliais formam uma rede vascular extensa que fica justaposta às células luteais, suprindo-as de nutrientes e oxigênio, além de secretar diversos fatores luteotróficos e luteolíticos. Já os macrófagos são importantes na atividade fagocítica e participação na resposta imune que parece estar envolvida na regressão do CL (MIYAMOTO et al., 2009). Os fatores responsáveis pelo controle da luteogênese e capacidade para produção de progesterona envolvem interações entre fatores endócrinos como o hormônio de crescimento (GH), o LH, prostaglandinas E2 e I2 e os fatores de crescimento angiogênicos como o fator de crescimento fibroblástico (FGF), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e angiopoetina, além do sistema IGF (DAVIS et al., 2003; LANSBERGEN, 2014). Em ruminantes domésticos, o LH e o GH são os dois principais hormônios luteotróficos que dão suporte ao desenvolvimento e funcionamento do CL. O controle da esteroidogênese varia nos dois tipos celulares que compõe o CL. As pequenas células luteínicas contêm mais receptores para LH e são seis vezes mais responsivas a esse hormônio quando comparado às grandes células luteínicas, porém as grandes células secretam mais progesterona por célula, na ausência de estímulo de LH (GIOMETTI et al., 2009). O mecanismo pelo qual o LH induz a secreção de progesterona nas pequenas células luteais envolve a formação de AMP cíclico e a ativação do sistema da proteína quinase A, promovendo a fosforilação das enzimas envolvidas na esteroidogênese que transportam o colesterol para o citoplasma e o interior da membrana mitocondrial, onde ocorre a clivagem da cadeia lateral de colesterol, produzindo assim a pregnenolona, que em seguida é convertida em progesterona (SCHAMS e BERISHA, 2004). O Hormônio de crescimento também é considerado um regulador endócrino da produção de progesterona no CL, uma vez que as grandes células luteais são portadoras de receptores para GH, que estimulam uma elevada produção de progesterona (SCHAMS e BERISHA, 2004; BERISHA e SCHAMS, 2005). Segundo Niswender (2002) o GH ao se ligar a seu receptor estimula as proteínas quinases que aumentam aexpressão gênica das proteínas de transporte do colesterol para o interior da membrana mitocondrial e da enzima citocromo P450scc, sugerindo que a capacidade de síntese de progesterona mais elevada nas grandes células luteínicas pode estar associada a um aumento na eficiência de proteínas transportadoras de colesterol, proporcionando uma maior ação das enzimas esteroidogênicas. A presença de junções celulares do tipo GAP permite a comunicação entre as pequenas e grandes células luteínicas, proporcionando a transferência direta de moléculas mensageiras entre as células vizinhas que acabam estimulando a esteroidogênese nas grandes células luteais (PATE, 1994). O mecanismo pelo qual as grandes células luteais secretam progesterona ainda não se encontra completamente estabelecido e demonstra algumas controvérsias na literatura (PUGLIESI, 2012). O fluxo sanguíneo ovariano está altamente correlacionado com secreção de progesterona, uma vez que o sistema vascular serve como rota para entrega de substâncias nutritivas, substratos para produção de hormônios e hormônio estimuladores e reguladores (SCHAMS e BERISHA, 2004). Assim, uma complexa inter-relação entre os fatores angiogênicos FGF e VEGF e substâncias vasoativas é essencial para o desenvolvimento e manutenção da densa rede de capilares neoformados, além de contribuir de maneira parácrina e autócrina para a produção de progesterona. O VEGF parece estar mais relacionado à secreção de progesterona, enquanto o FGF induz à migração, diferenciação e proliferação celular, bem como à maturação e estabilização dos vasos sanguíneos (WEBB et al., 2002; MIYAMOTO et al., 2009). O CL maduro entra em um período estacionário de desenvolvimento que se inicia quando a massa luteal alcança seu diâmetro máximo, sendo caracterizada pela manutenção das dimensões luteais e pela elevada secreção de progesterona durante o diestro (VIANA et al., 2000; COUTINHO et al., 2007). Mann (2009) sugeriu que mesmo após o CL atingir seu diâmetro máximo, continua a ocorrer alterações nos níveis séricos de progesterona, indicando que a maturidade estrutural é alcançada anteriormente à maturidade endócrina. Deste modo, até o CL atingir a fase estacionária, existe uma relação positiva entre aumento do diâmetro do CL e os níveis séricos de progesterona, no entanto, a partir da maturidade, o tamanho não reflete a capacidade esteroidogênica desta estrutura, sendo influenciada por uma interação entre diversos fatores endócrinos, parácrinos e autócrinos (VASCONCELOS et al., 2001; ROBINSON et al., 2005; MANN et al., 2009). As características luteais podem variar ainda de acordo com o grupamento genético e o estágio fisiológico da fêmea (SARTORI et al., 2004; CARVALHO et al., 2008a; BASTOS et al., 2010) Trabalhos desenvolvidos por Ginther et al. (1989) e Sartori et al. (2004), mensurando características luteais em vacas Holandesas, verificaram um diâmetro máximo do CL de, respectivamente, 25 e 27,4mm, visualmente superior aos valores de 18,9mm relatados por Rhodes et al. (1995) para fêmeas zebuínas. Carvalho et al. (2008a), ao compararem o diâmetro do CL na fase estacionária entre distintos grupamentos genéticos criados em condições tropicais, observaram diâmetros de 18,4mm em Bos taurus taurus, significativamente superior aquele apresentado pelos animais Bos taurus indicus de 15,3mm, enquanto os indivíduos Bos taurus taurus x Bos taurus indicus demonstraram valores intermediários de 17,7mm, não diferindo das demais subespécies. Seguindo esta linha de pesquisa, Bastos et al. (2010) compararam a concentração de progesterona entre fêmeas zebuínas e taurinas e verificaram que, apesar das fêmeas zebuínas apresentarem corpos lúteos de menor dimensão, estes animais demonstraram concentração sérica de progesterona de 4,64±0,40ng/mL, sendo mais elevada que os valores de 4,06±0,18ng/mL encontrados nas fêmeas taurinas. Os autores sugeriram que tal evento ocorre em decorrência das altas taxas metabólicas apresentadas pelas fêmeas taurinas em relação aos animais zebuínos. O estágio fisiológico da fêmea pode também ser um fator que afeta a relação entre tamanho do CL e produção de progesterona (SARTORI et al., 2010). Sartori et al. (2004) compararam a relação entre o diâmetro do CL e a produção de progesterona entre fêmeas Holandesas lactantes e não lactantes e demonstraram que as fêmeas lactantes apresentam, no período estacionário, tecido luteal com maior volume em relação aos animais não lactantes (novilhas púberes), porém, a concentração plasmática de progesterona é significativamente inferior. As discrepâncias entre o tamanho desta estrutura do ovário e concentração sérica de esteroides podem afetar os potenciais fisiológicos, comprometendo os índices de fertilidade das vacas lactantes (SARTORI et al., 2010). A progesterona produzida pelo CL promove profundas alterações no útero, na glândula mamária e no hipotálamo. No útero este hormônio cria um ambiente adequado para o estabelecimento da gestação por meio de um estímulo à secreção das glândulas endometriais que podem dar suporte ao desenvolvimento do concepto e tem ação inibitória sobre a contração miometrial, preparando o útero para implantação e manutenção da gestação. Além de promover o crescimento dos alvéolos das glândulas mamárias preparando as mesmas para o início da lactação (SENGER, 2003; TREVISOL et al., 2013). Um mecanismo de feedback negativo hipotalâmico-hipofisário-gonadal exercido pela progesterona é fundamental para o controle endócrino da reprodução. A concentração de progesterona aumentada, reduz a frequência de pulsos de GnRH, levando a um padrão de secreção de LH de alta amplitude e baixa frequência. Desta forma, animais no período luteal, submetidas a elevada concentração de progesterona, não apresentam formação de folículo ovulatório, pico pré-ovulatório de LH e nem comportamento de estro. Apenas após perda da funcionalidade do CL a fêmea conseguirá ter um aporte hormonal suficiente para desencadear estes mecanismos (BERTAN et al., 2006; FORDE et al., 2011). Luteólise A lise ou regressão do CL determina a redução da secreção de progesterona, sendo um mecanismo evolutivo que permite a fêmea bovina, na ausência de concepção, ter um novo ciclo reprodutivo. Este evento envolve uma complexa interação entre neurohipófise, útero e ovários (OKUDA et al., 2002; PUGLIESI, 2012). Inúmeros mecanismos anatômicos, endócrinos e moleculares, determinam o fim da funcionalidade e da estrutura física do CL. Mudanças bruscas na capacidade de esteroidogênese, vascularização e remodelamento acabam levando a substituição da glândula por tecido conjuntivo (AULETTA e FLINT, 1988). Sendo assim, a luteólise acontece em duas etapas: a redução dos níveis de progesterona, considerada luteólise funcional, e a involução do tecido luteínico, descrita como luteólise estrutural (GIOMETTI et al., 2009). Segundo Assey et al. (1993), existe uma forte associação entre a luteólise funcional e estrutural. Estes autores observaram durante a luteólise induzida que a medida que acontecia a redução ultrassonográfica do tamanho do CL, ocorria uma significativa redução no nível de progesterona. Corroborando com estes estudos, Sartori et al. (2004) demonstraram que após o início da luteólise a concentração circulante de progesterona declinou rapidamente, atingindo níveis inferior a 10% daqueles pré-luteolíticas, dois dias após, enquanto o volume luteal reduziu até aproximadamente 30% do volume original, em três dias. A espontânea regressão luteal é induzida por uma elevação da pulsatilidade da prostaglandina F2α (PGF2α) no final do diestro, entre o dia 16 e 19 do ciclo estral (TREVISOL, 2011). Neste período a capacidade de esteroidogênese encontra-se extremamente aumentada devido à presença de um folículo pré-ovulatório com alto potencial de secreção de estradiol, quetem sido apontado como um dos desencadeadores da cascata luteolítica (ARAUJO et al., 2009). O estradiol promove liberação de ocitocina pela neurohipófise e estimula a formação de receptores para ocitocina no endométrio, subsequentemente ocorre à ligação da ocitocina hipofisária a seus receptores, induzindo a liberação de uma pequena quantidade de PGF2α uterina, a qual age no CL, promovendo a liberação de ocitocina luteal que, por sua vez, estimula síntese de mais PGF2α endometrial. A ativação deste mecanismo de retroalimentação positiva entre a ocitocina luteal e PGF2α uterina, é essencial durante toda a luteólise funcional (GIOMETTI et al., 2009; MIYAMOTO e SHIRASUNA, 2009). O papel do estradiol na função luteolítica foi demonstrado em fêmeas Bos taurus taurus, quando ficou comprovada que a aspiração diária de todos os folículos presentes nos ovários prevenia o desenvolvimento de folículos dominantes, promovia uma redução das concentrações plasmáticas de estradiol, havendo um retardo da luteólise (ARAUJO et al., 2009). Contudo, experimentos semelhantes em animais Bos taurus indicus e seus mestiços identificaram resultados contraditórios, demonstrando peculiaridades do efeito da concentração de estradiol sobre o mecanismo luteolítico que precisam ser elucidadas em indivíduos destas subespécies (BURATINI et al., 2000; BISINOTTO et al., 2012). A progesterona também é um importante regulador endócrino da produção de PGF2α, atuando por mecanismos distintos, por um lado promove um acúmulo de substratos uterinos para síntese de PGF2α, ao mesmo tempo em que exerce uma ação inibitória, bloqueando a expressão de genes para receptores endometriais de ocitocina e consequentemente a síntese de PGF2α. Desta forma, apenas no final da fase luteal, quando se terá uma menor interação entre a progesterona e seus receptores, é que se inicia a expressão dos receptores de ocitocina no útero e a cascata luteolítica poderá ser desencadeada (GIOMETTI et al., 2009). A ligação entre a ocitocina a seus receptores ativa a fosfolipase C e a liberação de inositol fosfato (IP) e diacilglicerol (DAG), fazendo com que ocorra uma mobilização intracelular de Ca+2, acompanhada pelo aumento da secreção de ácido araquidônico (TREVISOL et al., 2013). No endométrio o ácido araquidônico é metabolizado em uma variedade de produtos como a PGF2α. O primeiro passo para biossíntese da PGF2α ocorre por meio da ativação da cicloxigenase 2 (COX2) que converte ácido araquidônico em prostaglandina G2 (PGG2), uma molécula altamente instável, rapidamente metabolizada em prostaglandina H2 (PGH2) pela peroxidase, finalmente, sob ação da prostaglandina sintetase a PGF2α é produzida a partir da PGH2. Estudos têm demonstrado que o aumento dos níveis de estradiol é também responsável por uma maior atividade da COX2 (OKUDA et al., 2002). A PGF2α sintetizada pelas células endometriais chega ao CL dos ruminantes por meio de um transporte em contracorrente que ocorre entre a veia uterina e a artéria ovariana. Este mecanismo é proporcionado pela anatomia vascular, onde a artéria ovariana fica enovelada à superfície da veia uterina, facilitando o transporte de substâncias da veia uterina para a artéria ovariana. Esta arquitetura vascular permite a PGF2α chegar diretamente no ovário, sem entrar na circulação sistêmica e passar pelos pulmões, onde em ruminantes, aproximadamente 95% da PGF2α produzida é enzimaticamente metabolizada a componentes inativos (AULETTA e FLINT, 1988; GINTHER et al., 2009; DUONG et al., 2012). A luteólise é desencadeada pelo aumento da pulsatilidade de PGF2α que se inicia na fase pré-luteolítica e se estende até a fase pós-luteolítica. Na fase luteolítica ocorre em média 2,3 pulsos de secreção que elevam a concentração plasmática do Metabólito da prostaglandina (PGFM) para concentrações mais altas do que as esboçadas no período pré e pós-luteolítico. Um grande aumento na amplitude do primeiro pulso de PGFM promove uma elevação das concentrações deste metabólito, alcançando em torno de 568pg/mL. Este momento tem sido associado com uma súbita elevação por duas horas do fluxo sanguíneo ovariano e das concentrações de progesterona, que anteriormente se encontrava em declínio. Em seguida, estas caraterísticas voltam a reduzir progressivamente até a progesterona alcançar valores menores que 1ng/mL, em média 30 horas após o início da detecção de PGFM. Durante o período de declínio continuam acontecendo pulsos de PGFM, contudo a amplitude dos mesmos diminui progressivamente (GINTHER et al., 2007; GINTHER et al., 2010; GINTHER et al., 2011). Segundo Miyamoto e Shirasuna (2009) a PGF2α estimula a síntese enzimática de óxido nítrico, levando a uma vasodilatação luteal e consequente aumento do fluxo sanguíneo na periferia do CL. O aumento na concentração do hormônio luteolítico promove um estímulo à síntese de endotelina I e angiotensina II que inibe enzimas esteroidogênicas responsáveis pela produção de progesterona nas células luteais, ocorrendo um decréscimo nos níveis de progesterona. Concomitantemente, fatores luteolíticos são transmitidos via junções oclusivas entre as células luteais e as células endoteliais. Após a redução dos níveis de progesterona, a endotelina I, a angiotensina II e outras moléculas vasoativas promovem uma severa vasoconstricção luteal, seguida de apoptose celular e completa regressão do CL. Os receptores para PGF2α estão localizados nas grandes células luteais e a afinidade entre estes e o hormônio é mais elevada entre os dias 13 e 20 do ciclo estral. A ação da PGF2α sob a esteroidogênese ocorre via inibição das proteínas transportadoras de colesterol, reduzindo a captação e o transporte desta molécula para o citoplasma e para a mitocôndria das células luteais, além de possivelmente, aumentar a expressão e a ativação das proteínas envolvidas nos processos de apoptose (WAITE et al., 2005; BERTAN et al., 2006). Em complementação a estes estudos, alguns pesquisadores têm demonstrado que a inibição da expressão das enzimas esteroidogênicas e a indução da apoptose luteal ocorre mediante o desencadeamento da cascata de sinalização que envolve também citocinas como o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNFα), Interferon gama (IFN-γ) e espécies reativadas de oxigênio (ROS) (TREVISOL et al., 2013) A partir dos estudos iniciais desenvolvidos por Pharriss e Wyngarden (1969), as PGF2α e seus análogos sintéticos têm sido largamente usados para indução da lise do CL em bovinos. A luteólise induzida tem como conceito clássico a redução dos níveis de progesterona para índices abaixo de 1ng/mL, cerca de 24 a 72 horas após o tratamento (TREVISOL et al., 2015). A aplicação exógena de drogas luteolíticas é eficiente apenas a partir do sexto dia do ciclo estral, devido ao fato do CL inicial não ser capaz em acionar toda a cascata luteolítica, apesar de ter sido comprovado que as grandes células luteais já demonstram receptores para PGF2α nesta fase. Assim, desenvolveu-se uma série de protocolos de sincronização em que a aplicação de uma única dose de 500µg de cloprostenol ou 12,5mg de dinoprost trometamina no momento apropriado do ciclo se mostraram eficientes em induzir uma luteólise completa (PURSLEY et al., 1995; WILTBANK et al., 2014). Estudos recentes têm demonstrado que uma única aplicação de doses subluteais do fármaco promove uma luteólise parcial que é caracterizada por redução dos níveis de progesterona e decréscimo do volume luteal nas primeiras 24 horas após o tratamento, seguido de um retorno destas características 48 horas após para valores similares aos observados antes do tratamento (TREVISOL et al., 2015). Meira et al. (2006) também identificaram que uma redução das doses convencionais dos análogos da PGF2α pode resultar em uma luteólise incompleta. A alguns pesquisadores têm demonstrado uma variabilidade nas taxas de regressão doCL em bovinos após tratamentos com PGF2α e seus análogos. Santos et al. (2010) e Ribeiro et al. (2012), em experimentos com IATF em vacas leiteiras, comprovaram que, respectivamente, apenas 59,1% e 61,7% dos animais alcançaram a luteólise quando tratados com uma dose de 500µg de cloprostenol ou 25mg de dinoprost em relação a 95,7% e 96,7% dos animais tratados com duas doses destes análogos. Sugerindo que o uso de uma única dose de PGF2α promove uma inadequada taxa luteolítica. Assim, uma nova frente de pesquisa tem surgido para evitar a ocorrência de uma luteólise incompleta em protocolos de IATF em bovinos e estabelecer novas estratégias para minimizar os gargalos desta biotecnologia (BINELLI et al., 2014a).
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