Epidemiologia molecular de cepas de rinovirus humano (HRV) detectadas na cidade de Belém-Pará, Brasil, 2015

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INSTITUTO EVANDRO CHAGAS 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM VIROLOGIA 
 
 
 
 
 
MAURO VICTOR BRABO VERGUEIRO 
 
 
 
 
 
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE CEPAS DE RINOVÍRUS 
HUMANO (HRV) DETECTADAS NA CIDADE DE BELÉM, PARÁ, 
BRASIL, 2015 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANANINDEUA 
2017
 
 
 
MAURO VICTOR BRABO VERGUEIRO 
 
 
 
 
 
 
 
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE CEPAS DE RINOVÍRUS 
HUMANO (HRV) DETECTADAS NA CIDADE DE BELÉM, PARÁ, 
BRASIL, 2015 
 
 
 
Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-
graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas, 
como requisito final para obtenção do título de mestre em 
Virologia. 
 
Orientador: Dr. Wyller Alencar de Mello 
Coorientadora: Profª. Dra. Rita Catarina Medeiros Sousa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANANINDEUA 
2017 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Biblioteca do Instituto Evandro Chagas 
 
 
 
 
 
Vergueiro, Mauro Victor Brabo. 
 Epidemiologia molecular de cepas de rinovírus humano (HRV) detectadas 
na cidade de Belém, Pará, Brasil, 2015. / Mauro Victor Brabo Vergueiro. – 
Ananindeua, 2017. 
 49 f.: il.; 30 cm 
 
 Orientador: Dr. Willer Alencar de Mello 
 Coorientadora: Dra. Rita Catarina Medeiros de Sousa 
 Dissertação (Mestrado em Virologia) – Instituto Evandro Chagas, Programa 
de Pós-Graduação em Virologia, 2017. 
 
 1. Rinovírus Humano. 2. Caracterização. 3. Pluviosidade. I. Mello, Willer 
Alencar de, orient. II. Sousa, Rita Catarina Medeiros de, coorient. III. Instituto 
Evandro Chagas. IV. Título. 
 
 CDD: 616.2 
 
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) 
 
MAURO VICTOR BRABO VERGUEIRO 
 
 
 
 
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE CEPAS DE RINOVÍRUS 
HUMANO (HRV) DETECTADAS NA CIDADE DE BELÉM, PARÁ, 
BRASIL, 2015 
 
 
 
Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-
graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas, 
como requisito final para obtenção do título de mestre em 
Virologia. 
 
 
 
Aprovado em: 05/09/2017 
 
 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
Dr. Hugo Reis Resque 
Instituto Evandro Chagas 
 
 
Drª Yvone Benchimol Gabbay 
Instituto Evandro Chagas 
 
 
Drª Jacqueline Cortinhas Monteiro 
Universidade Federal do Pará 
 
 
SUPLENTE 
 
Drª Elizabeth Salbé Travassos da Rosa 
Instituto Evandro Chagas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A Deus, meus pais, meu companheiro, meus familiares e amigos. 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
A Deus, que de alguma maneira sempre acaba me ajudando ou me guiando nas decisões da 
vida; 
 
Meu Orientador, Dr. Wyller, por aceitar me instruir na realização desse trabalho; 
 
Minha Coorientadora, Dra. Rita, que sempre com muita gentileza e acessibilidade contribuiu 
com o desenvolvimento de todo esse processo acadêmico; 
 
À Milla, por tudo que me ensinou ao longo desses anos, por toda a amizade e conhecimento 
compartilhados; 
 
Ao Pacheco que deu início aos tramites para que os nossos trabalhos pudessem ser realizados; 
 
A Stéphany, minha eterna parceira de graduação, mestrado e umas das pessoas mais 
inteligentes e esforçadas que conheço; 
 
Meus amigos do laboratório de Vírus Respiratórios: Luana, Jessy, Érica, Edna, Patrícia, 
Marielly, Rayssa, Wander, Vinicius e Amanda. 
 
Minha Mãe, por ser minha base, por ter feito de tudo pra que eu pudesse ter oportunidades e 
que soubesse escolher coisas boas, ser uma pessoa digna e com bom senso; 
 
Meu Pai, que mesmo ausente em muitos momentos me ensinou muito sobre caráter e amor; 
 
Minha Avó Maura, por ser meu maior amor na vida, me ensina diariamente que conhecimento 
não tem fim, idade ou origem; 
 
Minha Avó Yara, que mesmo com pouco contato, me ensinou que precisamos amar à todos; 
 
Meu Avô Zé, que sempre teve orgulho das minhas escolhas e tinha sempre um bom conselho 
pra dar; 
 
Meus tios e tias, que sempre me incentivaram e diziam coisas muito encorajadoras; 
 
Meus primos, eu os amo e obrigado por todos os momentos; 
 
Meus amigos, por me aguentarem falar sobre vírus em todas as vezes que nos reuníamos; 
 
E ao Rodrigo, meu parceiro, companheiro, cúmplice e abrigo. Que por inúmeras vezes nunca 
me deixou desistir e sempre acreditou que as coisas tendem a se encaixar, que fé é a base de 
tudo. Obrigado por estar comigo nessa jornada, e por ser essa pessoa maravilhosa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“A ciência conhece um único comando: contribuir com a ciência” 
(Bertold Brecht)
 
RESUMO 
 
O Rinovírus, outrora tido apenas como agente causador de infecções brandas ou 
autolimitadas, como o resfriado comum, hoje é o mais comum entre os agentes virais 
associados à infecção respiratória aguda (IRA). Investigações conduzidas em anos recentes, 
em diferentes regiões do mundo reforçam a importância do rinovírus no cenário da saúde 
pública, principalmente a partir do advento das ferramentas moleculares de diagnóstico, 
evidenciando o importante papel do rinovírus no desencadeamento de crises asmáticas, bem 
como a associação dos HRV em infecções do trato respiratório inferior tais como 
bronquiolites, com impacto considerável em pacientes menores de cinco anos de idade. O 
diagnóstico clínico da infecção por Rinovírus humano é dificultado pela similaridade dos 
sintomas apresentados em todas as infecções respiratórias. Desta forma, torna-se necessária a 
realização do diagnóstico laboratorial para confirmar a infecção por este agente infeccioso. O 
presente estudo possui como objetivo descrever a ocorrência dos tipos de Rinovírus humano 
isolados em amostras de pacientes atendidos com queixas sugestivas de infecção respiratória 
aguda na cidade de Belém, Pará, Brasil, no ano de 2015. A população de estudo compreendeu 
274 indivíduos com queixas sugestivas de infecção respiratória aguda (IRA), atendidos no 
período de janeiro a dezembro de 2015. A prevalência da infecção por HRV foi de 15,6% 
(43/274), sendo mais frequente na faixa etária entre 0 a 5 anos Das 274 amostras clínicas de 
pacientes, 43 (15,6%) mostraram-se positivas para o HRV, sendo os pacientes situados na 
faixa de zero a cinco anos os mais acometidos com 14 (26,9%). Das 43 amostras positivas na 
rRT-PCR foi possível realizar a caracterização por sequenciamento em 21 delas. A análise 
evidenciou a circulação das três espécies de HRV na população investigada. Sendo 14 
(66,7%) HRV-A, 1 (4,8%) HRV-B e 6 (28,5%) HRV-C. Quanto a distribuição mensal dos 
casos positivos de HRV durante o ano de 2015, nota-se que 95% da incidência dos casos se 
concentrou no primeiro semestre do ano. O Rinovírus humano apresentou-se como um 
importante agente de doença respiratória na população investigada, sendo a faixa etária de 
zero a cinco anos de idade foi a mais acometida entre os casos de infecção respiratória 
associada ao HRV. O pico de atividade do HRV na cidade de Belém, Pará, ocorreu 
principalmente nos primeiros seis meses, período este reconhecido por apresentar altos 
índices pluviométricos na região amazônica e observou-se também a co-circulação das 
espécies de HRV, com leve predomínio da espécie HRV-A. 
 
Palavras-chave: Rinovírus Humano; caracterização; pluviosidade. 
 
 
ABSTRACT 
 
Human rhinovirus (HRV) is the most common viral agent associated with acute respiratory 
infection (ARI), primarily causing infections in the upper respiratory tract, being recognized 
as pathogen causing the common cold in the world. Investigations conducted in recent years, 
mainly since the advent of molecular diagnostic tools, have demonstrated the important role 
of rhinovirus in the onset of asthma attacks, as well as the association of HRV in lower 
respiratory tract infections such as bronchiolitis, with a considerable impact in patients under 
five years of age. The clinicaldiagnosis of human rhinovirus infection is hampered by the 
similarity of the symptoms presented in all respiratory infections. In this way, it is necessary 
to perform the laboratory diagnosis to confirm the infection by this infectious agent. The 
present study aims to verify the frequency of isolated human rhinovirus types in samples from 
patients treated with complaints suggestive of acute respiratory infection in the city of Belém, 
Pará, Brazil, in the year 2015. The study population comprised 274 individuals of both sexes 
in different age groups, with complaints suggestive of acute respiratory infection (ARI). From 
January to December 2015, of the 274 clinical samples of patients, 43 (15.6%) of these 
patients were positive for HRV, patients in the zero to five age group were the most affected 
with 14 (32.5%) positive samples. Of the 43 positive samples in the rRT-PCR it was possible 
to perform the characterization by sequencing in 21 of them. The analysis showed the 
circulation of the three species of HRV in the researched population. Being 14 (32.5%) HRV-
A, 1 (2.3%) HRV-B and 6 (13.9%) HRV-C. As for the monthly distribution of positive cases 
of HRV during the year 2015, it is noted that 95% of the incidence of cases was concentrated 
in the first half of the year. Human rhinovirus showed as an important agent of respiratory 
disease in the investigated population, being the age group from zero to five years of age was 
the most affected among cases of respiratory infection associated with HRV. The peak of 
HRV circulation in the city of Belém, Pará, occurred mainly in the first six months, that 
period is recognized as having high rainfall indexes in the Amazon region and also observed 
the co-circulation of the HRV species, with a slight predominance of the species HRV-A. 
 
Keywords: Human rhinovirus; Characterization; Rainfall. 
 
 SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 10 
2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 12 
2.1 HISTÓRICO ....................................................................................................................... 12 
2.2 TAXONOMIA E REPLICAÇÃO VIRAL ......................................................................... 13 
2.2.1 Estrutura e Organização Genômica ............................................................................ 13 
2.2.2 Replicação Viral ............................................................................................................. 15 
2.2.3 Diversidade antigênica e genética do HRV ................................................................. 17 
2.3 PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS ............................................................ 19 
2.4 EPIDEMIOLOGIA ............................................................................................................. 20 
2.5 DIAGNÓSTICO ................................................................................................................. 22 
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 24 
3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 24 
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 24 
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 25 
4.1 ASPECTOS ÉTICOS E DE BIOSSEGURANÇA ............................................................. 25 
4.2 TIPO DE ESTUDO ............................................................................................................ 25 
4.3 POPULAÇÃO DE ESTUDO ............................................................................................. 25 
4.5 COLETA DAS AMOSTRAS ............................................................................................. 25 
4.6 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS .......................................................................... 26 
4.6.1 Caracterização Genética ............................................................................................... 26 
4.6.2 Extração do RNA viral (RNAv) ................................................................................... 26 
4.6.3 Reação em Cadeia mediada pela Polimerase Precedida de Transcriptase Reversa 
em Tempo Real (rRT-PCR) para detecção de HRV ........................................................... 27 
4.6.4 Reação em Cadeia mediada pela Polimerase precedida de transcrição reversa (RT-
PCR) para amplificação parcial da região NCR e dos genes VP4/VP2 ............................. 27 
4.6.5 Eletroforese em gel de agarose ..................................................................................... 28 
4.6.6 Purificação e quantificação do produto da RT-PCR ................................................. 28 
4.6.7 Reação de sequenciamento ........................................................................................... 29 
4.6.8 Precipitação do produto da reação de sequenciamento ............................................. 29 
4.6.9 Eletroforese em sequenciador automático .................................................................. 29 
4.6.10 Análise da sequência de nucleotídeos e inferências filogenéticas ............................ 30 
5 RESULTADOS .................................................................................................................... 31 
 
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 36 
7 CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 39 
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 40 
ANEXO A – DOCUMENTO DE APROVAÇÃO DO CEP ................................................... 49 
 
10 
 
 
1 INTRODUÇÃO 
As infecções do trato respiratório são consideradas umas das principais causas de 
morbidade e mortalidade, especialmente em crianças menores de cinco anos de idade, 
apresentam considerável impacto econômico em virtude do elevado número de consultas 
médicas, absenteísmo laboral e escolar ocasionado por este agravo mundialmente (JACOBS 
et al., 2013; MACKAY, 2008). 
O Rinovírus humano (HRV) é o mais comum entre os agentes virais associados à 
infecção respiratória aguda (IRA), causando principalmente infecções no trato respiratório 
superior, sendo reconhecido como o principal patógeno causador do resfriado comum em todo 
o mundo (JACOBS et al., 2013). 
Investigações conduzidas em anos recentes, principalmente a partir do advento das 
ferramentas moleculares de diagnóstico, têm evidenciado o importante papel dos rinovírus no 
desencadeamento de crises asmáticas, bem como a associação dos HRV em infecções do trato 
respiratório inferior tais como bronquiolites, com impacto considerável em pacientes menores 
de cinco anos de idade e indivíduos imunocomprometidos (JACOBS et al., 2013; 
MCERLEAN et al., 2007). 
O desenvolvimento de métodos moleculares de diagnóstico tem proporcionado a 
realização de estudos sobre a diversidade do HRV, permitindo assim a caracterização das 
diferentes cepas virais que circulam em todo o mundo. Tais investigações vêm ampliando o 
conhecimento sobre este vírus, possibilitando a descrição de novas espécies e 
sorotipos/genótipos de HRV (KAIDA et al., 2011; LAU et al., 2007; MCINTYRE et al., 
2013; MILLER et al., 2009; SAVOLAINEN et al., 2002). 
O HRV é amplamente distribuído na população humana e pode ser detectado em todo 
o mundo, entretanto, a circulação ocorrepredominantemente no inverno em diversos países. 
No Brasil, estudos conduzidos na região sudeste também mostram uma maior frequência do 
rinovírus nos meses mais frios do ano (julho a setembro) (BELLEI et al., 2008; LOUIE et al., 
2005; WATANABE et al., 2010). 
No Brasil, especialmente na região norte, poucas informações estão disponíveis sobre 
este agente e sua circulação na população. Assim sendo, merece ser incentivada a realização 
11 
 
 
de estudos que avaliem a associação dos HRV aos quadros de infecção respiratória, e ainda 
sobre a diversidade genética das cepas circulantes. 
Tais investigações podem vir a gerar informações relevantes, que poderão auxiliar no 
desenvolvimento de estratégias de prevenção e controle destas infecções, auxiliando também 
no melhor manejo clínico dos pacientes acometidos por doença respiratória. 
12 
 
 
2 REVISÃO DE LITERATURA 
2.1 HISTÓRICO 
Em meados do século passado, foram conduzidos estudos experimentais com a 
indução de infecção respiratória em voluntários, mediante a inoculação intranasal de 
secreções nasais filtradas de pacientes com resfriado comum. Esta investigação revelou que a 
doença seria possivelmente ocasionada por agentes filtráveis (vírus) que eram facilmente 
disseminados (ANDREWES, 1965; DOWLING et al., 1957; JACKSON et al., 1958; 
JACKSON et al., 1959). Muitas das secreções nasais, utilizadas neste estudo, revelaram 
posteriormente a presença de rinovírus. 
O HRV foi descrito pela primeira vez em 1956 concomitantemente em dois 
laboratórios distintos quando se tentava determinar a etiologia do resfriado comum. Os 
pesquisadores Pelon e Price inocularam secreções nasofaríngeas de pessoas com resfriado 
comum em cultura de tecido renal de macacos Rhesus, realizando assim, a primeira detecção 
viral de HRV. As cepas virais isoladas por Pelon e Price foram denominadas GL2060 e JH, 
respectivamente (PELON et al., 1957; PRICE, 1956). 
Estudos posteriores demonstraram proteção cruzada entre as cepas GL2060 e JH, 
assim sendo, foram consideradas como pertencentes de um único sorotipo. Estas 
investigações revelaram ainda que as respectivas estirpes apresentavam características 
semelhantes aos enterovírus, sendo desta forma, classificadas inicialmente como Echovírus 28 
(JACKSON et al., 1960; PELON, 1961). Após análise das propriedades antigênicas das 
citadas cepas, elas foram reclassificadas como Rinovírus1A (TYRRELL; PARSONS, 1960). 
O nome Rinovírus foi inicialmente sugerido por Andrews, entretanto a descrição do 
grupo foi proposta por Tyrrell e Chanock em 1963 (TYRRELL; CHANOCK, 1963). Em 1967 
foram atribuídos números 1A até 55 para os tipos conhecidos de HRV (KAPIKIAN et al., 
1967). Em 1971, foram adicionados os tipos 56 até 89 (KAPIKIAN et al., 1971) e 
posteriormente foram inseridos os tipos 90 até 100 (HAMPARIAN et al., 1987). 
Apesar desses vírus terem sido descobertos na década de 50 (PRICE, 1956), sua 
melhor caracterização clínica e molecular e, consequentemente, uma avaliação mais detalhada 
de seu impacto epidemiológico, só foi possível mais de trinta anos depois, com o advento de 
13 
 
 
técnicas moleculares mais avançadas (GAMA, HUGHES et al., 1988; GAMA, HORSNELL 
et al., 1989). 
Alguns autores tentam classificar os rinovírus através de outras características, como o 
receptor utilizado para a entrada na célula, ou a sensibilidade a compostos antivirais. No 
entanto a classificação não é completa por essas outras estratégias. Baseando-se no tipo de 
receptor utilizado, os HRVs podem ser divididos em 3 grupos: o grupo denominado major 
que compreende cerca de 90% dos sorotipos de HRV, que se ligam à molécula de adesão 
intracelular 1 (ICAM-1), um receptor de superfície celular das imunoglobulinas , o grupo 
denominado minor (cerca de 10% dos sorotipos) ligam-se aos receptores das lipoproteínas de 
baixa densidade LDLR, e existem também o sorotipo HRV 87, que não faz parte dessa 
classificação, pois utiliza uma sialoproteína como receptor (SAVOLAINEN et al., 2002). 
Outra classificação mais recente, através de análises moleculares descreve as três 
espécies distintas: HRV-A, HRV-B e HRV-C, apenas no final do ano de 2006 que a espécie 
de HRV C foi descrita como pertencendo a uma nova espécie de HRV que não havia sido 
classificada até o momento. Essa nova espécie inicialmente recebeu diferentes denominações 
como: HRV-A2, HRVNY, HRVQPM e HRVX. Somente após a análise do genoma completo 
que foi comprovada a nova espécie de HRV, que foi então denominada de HRV-C 
(LAMSON et al., 2006, LAU et al., 2007; XIANG et al., 2008, MILLER et al., 2009). 
Hoje são mais de 150 sorotipos de HRV são descritos, limitando o desenvolvimento de 
uma vacina, uma vez que a infecção prévia não confere imunidade cruzada aos demais 
sorotipos. (SAVOLAINEN et al., 2002; MCINTYRE et al., 2013). 
2.2 TAXONOMIA E REPLICAÇÃO VIRAL 
2.2.1 Estrutura e Organização Genômica 
O Rinovírus humano pertence à ordem Picornavirales, família Picornaviridae, gênero 
Enterovirus e estão divididos em três espécies, HRV-A, HRV-B e HRV-C. A partícula viral 
mede de 25-30 nanômetros (nm) de diâmetro, apresentando simetria icosaédrica. O capsídeo é 
formado por 60 cópias de cada uma das quatro proteínas estruturais (VP1, VP2, VP3 e VP4) e 
envolve o material genético, que é composto por uma fita simples de RNA de polaridade 
positiva não segmentado (+ssRNA), com aproximadamente 7,200 pares de bases (pb) o qual 
14 
 
 
possui uma única região de leitura aberta (Open Reading Frame - ORF) (PALMENBERG et 
al., 2009) (Figura 1). 
 
Figura 1 – Representação esquemática da partícula viral e as proteínas que 
formam o seu capsídeo 
 
Fonte: Adaptada de Picornaviridae.com. 
 
Os genomas dos membros da família Picornaviridae estão organizados em quatro 
diferentes regiões, logo, o genoma do HRV está distribuído da seguinte forma: uma longa 
região 5’ não traduzida (5'-UTR), uma região de leitura aberta (ORF), uma região curta 3’ 
UTR e uma cauda poli A, ainda, na extremidade 3’ (CORDEY et al., 2008). 
A região 5'-UTR contém dois elementos altamente conservados, o cloverleaf (trevo 
terminal) 5' e o sitio interno de entrada ribossomal (IRES) que possibilitam a formação de 
uma ribonucleoproteína que implica na tradução viral para que haja a replicação. A cauda poli 
A é importante na tradução, auxiliando na taxa da síntese protéica (CORDEY et al., 2008; 
LEWIS-ROGERS et al., 2009). 
O RNA viral é constituído por 11 genes traduzidos inicialmente em uma única 
poliproteína, essa poliproteína é subdividida em três regiões precursoras: P1, P2 e P3, que 
codificam as proteínas estruturais e não estruturais do vírus. A região P1 codifica as quatro 
proteínas estruturais VP1, VP2, VP3 e VP4 que compõem o capsídeo icosaédrico do vírus 
(Figura 2) (CORDEY et al., 2008; PALMENBERG; RATHE; LIGGETT, 2010). 
As proteínas virais VP1, VP2 e VP3 possuem uma extremidade chamada C-terminal, 
sendo responsável pelas interações antigênicas, além de que a VP1 contém o maior número de 
epítopos que servem como receptores de superfície para a ligação celular. Já a proteína VP4 
está localizada de forma mais interna no capsídeo interagindo diretamente com RNA 
15 
 
 
genômico, auxiliando a entrada do mesmo no citoplasma da célula hospedeira e serve para 
ancorar o RNA ao capsídeo (CORDEY et al., 2008a; KELLY; BUSSE, 2008; LEWIS-
ROGERS; BENDALL; CRANDALL, 2009). 
A região P2 do genoma viral codifica as proteínas virais não estruturais 2A, 2B, 2C. A 
protease viral 2A é responsável pela clivagem que separa a proteína estrutural VP1 que 
compõe o capsídeo (pertencente à região P1) do restante do genoma, dando origem a protease 
2Apro. Esta protease atua na clivagem do fator de iniciação eucariótico (eIF4G), sendo crucial 
na replicação do RNA. E a proteína 2B atua como protease na clivagem da poliproteína viral 
(LEDFORD et al., 2004; CORDEY et al., 2010). 
Na regiãoP3 são codificadas as proteínas não estruturais 3A, 3B, 3C e 3D. A protease 
3Cpro é responsável por quase todos os eventos de processamento proteolítico do precursor 
de poliproteína viral, e ainda interage com a região 5’ UTR facilitando a ligação 3Dpol (RNA 
polimerase RNA dependente) para a replicação. A proteína 3B ou VPg atua como um 
iniciador para 3Dpol. A proteína não estrutural 3C é eficiente na mediação nos efeitos no 
transporte nuclear da célula hospedeira (LEWIS-ROGERS; BENDALL; CRANDALL, 2009; 
GHILDYAL et al., 2009; CORDEY et al., 2010). 
Figura 2 – Representação esquemática do genoma viral 
 
Fonte: Adaptado de Picornaviridae.com 
 
2.2.2 Replicação Viral 
O processo de replicação do HRV se inicia com a adsorção do vírus à célula 
hospedeira promovendo a ligação com o receptor de superfície celular, sendo que 90% dos 
sorotipos de HRV, denominados grupo major, ligam-se à proteína ICAM-I (molécula de 
adesão intracelular-I) que é expressa em diversos tecidos, sendo mais abundante no epitélio 
16 
 
 
nasal. Como o HRV está intimamente relacionado com a exacerbação da asma, estudos 
mostram que pacientes com esse quadro possuem um elevado número do receptor ICAM-1, o 
que tornaria mais suscetível à infecção por HRV e o desencadeamento do processo 
inflamatório, induzindo assim na exacerbação asmática. O grupo minor, que corresponde aos 
outros 10% ligam-se aos receptores de proteínas de baixa densidade (LDLR). Há achados de 
HRV que também utilizam outros receptores, como o sorotipo HRV 87, que utiliza uma 
sialoproteína como receptor. (DUECHLER et al., 1993; SAVOLAINEN et al., 2002, 
YAMAYA et al., 2016). 
Após a ligação do HRV aos receptores celulares, as partículas virais são endocitadas, 
em seguida o genoma é liberado no citoplasma da célula hospedeira, onde ocorre todo o 
processo de replicação do HRV. A liberação do genoma viral no citoplasma ocorre pela 
expansão da estrutura do capsídeo, engatilhada tanto pela interação do ICAM-I quanto pela 
acidificação endossomal (FUCHS et al., 2010; LEWIS-ROGER et al., 2009). 
A partir da cadeia positiva de RNA é traduzida uma poliproteína e em seguida é 
clivada dando origem as proteínas virais. Ainda utilizando a cadeia positiva de RNA como 
molde é formada uma molécula de RNA com uma sequência de nucleotídeos 
complementares. A síntese desta cadeia complementar negativa é promovida pela proteína 
VPg e inicia-se a partir da zona terminal 3’. A cadeia complementar é usada como molde na 
síntese de um grande número de cópias do genoma viral que são acondicionadas em novas 
partículas virais. A proteína 3D
POL 
é uma RNA polimerase dependente de RNA sendo 
responsável pela replicação do RNA genômico viral. Por fim, o vírion é montado e liberado 
da célula hospedeira (Figura 3) (BERTINO, 2002; BOCHKOV et al., 2010). 
 
Figura 3 – Esquema representativo do processo de replicação dos rinovírus 
 
 
 
Fonte: Adaptado de Jacobs et al., 2013. 
17 
 
 
2.2.3 Diversidade antigênica e genética do HRV 
 Inicialmente o HRV foi classificado em duas espécies, HRV-A e -B, com base em 
análises filogenética. Os espécimes clínicos nos anos 60 e 70 levaram a caracterização de 
aproximadamente 100 diferentes tipos de HRV (PALMENBERG et al., 2010). O 
sequenciamento parcial de regiões codificadoras do capsídeo viral, regiões não codificantes e 
um número limitado de genomas completos levou a uma divisão das 99 cepas originais em 
duas espécies: HRV-A (contendo 74 sorotipos) e HRV-B (contendo 25 sorotipos) (LAMSON 
et al., 2006). 
O desenvolvimento de técnicas moleculares altamente sensíveis para a identificação 
do HRV em espécimes clínicos levou à identificação e de uma nova espécie, HRV-C, pelo 
Comitê Internacional de Taxonomia Viral em 2009. As cepas de HRV-C têm uma 
organização genômica semelhante à do HRV-A e HRV-B, contudo não crescem na cultura 
celular padrão, como por exemplo HeLa e Vero, o que suporta sua classificação como uma 
espécie nova (ARRUDA et al., 1996; LAMSON et al., 2006; LAU et al., 2007). 
Assim, com base nas características antigênicas e genéticas, hoje já são descritos mais 
de 150 sorotipos de HRV. A análise das sequências de nucleotídeos, principalmente das 
regiões codificadoras das proteínas VP1 e VP2/VP4, permitiu agrupar os sorotipos entre as 
três espécies, sendo que atualmente 80 sorotipos compõem a espécie HRV-A, 32 pertencem à 
espécie HRV-B e 55 a espécie HRV-C (MCINTYRE et al., 2013) (Figura 4). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
 
Figura 4 – Árvore filogenética mostrando a relação entre os sorotipos de HRV conhecidos 
 
Fonte: Adaptado de Gern, 2010; Palmenberg et al., 2010. 
 
A diversidade genética dos HRV é atribuída a uma elevada taxa de mutação devido à 
baixa fidelidade da RNA polimerase dependente de RNA que não tem atividade de correção 
de leitura. Nos picornavírus a taxa de erros mediada pela RNA polimerase está estimada entre 
10
-3
 e 10
-4 
erros/ nucleotídeos/ ciclo de replicação. A recombinação genética também tem sido 
relatada como um dos fatores que contribui para a variabilidade genética das espécies de 
Rinovírus. É provável que a recombinação ocorra por co-infecção, ou devido sucessivas 
infecções por cepas de diferentes espécies de HRV (DRAKE; HOLLAND, 1999; GERN, 
2010; MCINTYRE et al., 2013; PALMENBERG et al., 2010) 
 
 
 
19 
 
 
2. 3 PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS 
Os HRV são transmitidos para os indivíduos suscetíveis através do contato direto ou 
por meio de partículas virais suspensas em aerossóis, provocadas pelo espirro e a fala. A sua 
porta de entrada é o trato respiratório, pela mucosa nasal que atua como primeiro sítio de 
inoculação do vírus, mas a conjuntiva também pode servir como entrada para as partículas 
virais, porém em menor grau. O principal receptor de HRV é o ICAM – I (intercellular 
adhesion molecule 1) que se encontra em quantidades elevadas localizado na nasofaringe 
posterior (BELLA; ROSSMANN, 1999; GREVE et al., 1989; WINTHER, 2011). 
O HRV causa principalmente infecção no trato respiratório superior, reconhecido 
como o resfriado comum. A infecção cursa com congestão nasal, coriza intensa, dor de 
garganta, tosse e rouquidão, sendo que o indivíduo pode apresentar febre variável e, com 
menor frequência, mal-estar, mialgia e cefaleia. A doença pode durar até sete dias, com os 
sintomas persistindo até 12 a 14 dias. Os HRV atuam ainda como os agentes mais prevalentes 
na exacerbação de doença pulmonar obstrutiva crônica e asmas em crianças, bem como a 
ocorrência de fibrose cística (DIMOPOULOS et al., 2012; GERN, 2010). 
O HRV promove a infecção através da nasofaringe, propaga-se por células do epitélio 
respiratório superior que consequentemente são destruídas por necrose celular e descamação. 
Sua replicação ocorre de forma localizada, sendo que a temperatura ótima para sua 
proliferação varia entre 33 e 35ºC. (WINTHER, 2011). 
Os sintomas da virose geralmente surgem em 1 a 2 dias após a infecção, com um pico 
de incidência 2 a 4 dias após a inoculação. As manifestações clínicas da doença estão 
associadas à liberação de produtos celulares virais e a uma resposta imunológica à lesão 
produzida. Ocorrem hiperemia e transudação de proteínas no soro e nas secreções nasais, com 
o aumento concomitante de albumina e neutrófilos (LESSLER et al., 2009). 
As células infectadas liberam bradicinina e interleucinas (IL) 1, 6 e 8 que são 
mediadores da inflamação. As concentrações de IL-8 em secreções estão proporcionalmente 
correlacionadas com a gravidade dos sintomas do resfriado. Os mediadores inflamatórios tais 
como cininas e prostaglandinas, podem causar vasodilatação, aumento da permeabilidade 
vascular, e a secreção das glândulas exócrinas. Estes, juntamente com o estímulo do nervo 
terminal parassimpático local, levam aos sintomas de resfriado (DOYLE et al., 2010). 
 
20 
 
 
2. 4 EPIDEMIOLOGIA 
Os HRV sãoos mais frequentes agentes etiológicos de infecção respiratória aguda 
(IRA) em todo mundo, contribuindo anualmente para 25-50% dos casos de doenças 
respiratórias (BELLEI et al., 2008; WATANABE et al., 2010). Estes vírus são amplamente 
distribuídos, afetando tanto crianças quanto adultos, imunocomprometidos ou não. Muitos 
estudos vêm apontando os HRV como agentes tão frequentemente detectados em crianças 
quanto o Orthopneumovirus Humano (HRSV), e estudos recentes sugerem que o HRV pode 
se propagar para o trato respiratório inferior, numa disseminação célula a célula, e esse pode 
ser um fator importante no desencadeamento da obstrução das vias aéreas, tosse e chiado, que 
podem evoluir para bronqueolites e pneumonia (LUCHSINGER et al., 2014; MOSSER et al., 
2005; SUN et al., 2016). 
Estudos realizados no Reino Unido, França, Japão e Austrália evidenciam uma alta 
frequência do HRV em casos de infecção respiratória, sendo as crianças menores de cinco anos 
de idade as mais acometidas, com até 80% dos casos (ARAKAWA et al., 2012; HENQUELL 
et al., 2012; MACKAY et al., 2013; WISDOM et al., 2009). 
No Continente Americano, estudos realizados nos EUA e Argentina, também 
corroboram essa alta incidência do rinovírus e maior infectividade em crianças (MARCONE 
et al., 2014; MARTIN et al., 2015). No Brasil, investigações sobre a ocorrência de HRV, 
também têm demonstrado a importância deste patógeno na indução de quadros de infecção 
respiratória (BELLEI et al., 2008; SOUZA et al., 2003; WATANABE et al., 2010). 
Neste contexto, em um estudo realizado com 271 amostras coletadas de 138 crianças 
menores de dois anos de idade, frequentadoras de uma creche em Salvador (Bahia), o HRV foi 
detectado em 48,3% das 116 amostras positivas para algum dos vírus respiratórios 
investigados (SOUZA et al., 2003). Em investigações conduzidas com crianças em Curitiba o 
HRV foi o agente mais frequentemente detectado contribuindo com 117 (39.9%) amostras 
positivas entre as 293 analisadas, sendo que 34% das crianças positivas para HRV 
apresentavam asma e bronquite como comorbidades (GIAMBERARDIN et al., 2016). 
Assim como na população infantil, a importância em saúde pública das infecções por 
rinovírus vem sendo avaliada em adultos e idosos também. Nesse contexto, estudos realizados 
em anos recentes vêm demonstrando a associação do HRV aos quadros de infecção 
respiratória aguda grave também em adultos. Investigação conduzida por Jain et al. (2015) em 
21 
 
 
crianças, relata que o HRV foi o patógeno mais detectado em pacientes hospitalizados com 
quadro clínico de pneumonia em Chicago, nos Estados Unidos. Em um estudo realizado no 
Chile, com 135 pacientes, apresentou 32 casos positivos para HRV, sendo que destes mais de 
90% foram detectados em idosos acima dos 60 anos (FICA et al., 2015). No Brasil, em 2008, 
investigação realizada por Bellei et al., com adultos que apresentavam IRA e/ou doença 
semelhante à gripe, atendidos na cidade de São Paulo entre 2001 a 2003, demonstrou que dos 
240 indivíduos de um total de 420 (57,1%), com pelo menos um agente viral detectado, o HRV 
foi o mais frequente com 95 amostras positivas (39,6%). 
Em relação ao padrão de circulação, o rinovírus geralmente ocorre durante todos os 
meses do ano sem um pico de detecção muito marcado, contudo em algumas regiões do mundo 
já foi demonstrada a associação da elevação do número de casos no inverno ou com maior 
índice pluviométrico, tanto em países de clima temperados quanto em tropicais (ARAKAWA 
et al., 2012; BOIVIN et al., 2002, BRIESE et al., 2008; MILANOI et al, 2016). 
No Brasil a maioria dos dados sobre circulação de HRV é proveniente de investigações 
conduzidas na Região Sudeste, onde o pico de infecção tem padrão semelhante à do vírus 
influenza, coincidindo com os meses mais frios do ano (BELLEI et al., 2008; GARDINASSI 
et al., 2012). 
Ainda no que se refere ao padrão de circulação, as diferentes espécies de HRV 
costumam circular de forma concomitante, com uma delas podendo se apresentar de forma 
predominante. Estudos realizados ao redor do mundo têm demonstrado que geralmente, as 
infecções pelos HRV da espécie A são mais prevalentes, entretanto as três espécies podem 
apresentar padrões de frequências similares (ARAKAWA et al., 2012; DALENO et al., 2013; 
MARCONE et al., 2014; MILANOI et al., 2016; PIRALLA et al., 2009; TRAN et al., 2016; 
WATANABE et al., 2010). 
Em um estudo conduzido no Reino Unido, no qual foram analisadas 456 amostras de 
indivíduos de ambos os gêneros e diferentes faixas etárias, das 104 positivas para HRV 
(22,8%) a espécie de HRV-A foi a mais frequente com 65 amostras positivas, seguida pela 
espécie HRV-C e HRV-B, com 31 e 8 amostras positivas respectivamente, sendo 60% em 
crianças na faixa etária de 1 a 2 anos de idade (WISDOM et al., 2009). 
No Japão, 501 amostras foram coletadas de pacientes com infecção respiratória aguda 
entre janeiro e dezembro de 2010, em 92 (18,3%) amostras, foi possível detectar o HRV, sendo 
22 
 
 
as espécies A e C as mais frequentes e encontradas durante todos os períodos do estudo, com 
alguns casos esporádicos do HRV-B (ARAKAWA et al., 2012). 
Nos Estados Unidos, uma investigação realizada apenas com menores de 1 ano de 
idade, em 110 crianças foi observada a positividade para HRV, sendo que a média de idade 
dos infectados era de aproximadamente 3 meses. Neste estudo a espécie de HRV-C se 
sobressaiu em relação as espécie A e B (HASEGAWA et al., 2015). 
Na América do Sul, investigação de vírus respiratórios em crianças argentinas, na qual 
252 (40,6%) amostras foram identificadas como positivas para HRV, de um total de 620, a 
espécie de HRV-A apresentou maior frequência, seguida por HRV-C e HRV-B (MARCONE 
et al., 2014). 
Em um estudo brasileiro realizado no estado de São Paulo, entre as 131 amostras 
virais caracterizadas, também o HRV-A mostrou-se predominante contribuindo com 61% da 
positividade, sendo o HRV B detectado em 16.8% e o HRV-C em 22.2% do total analisado 
(WATANABE et al., 2010). 
 
2. 5 DIAGNÓSTICO 
O diagnóstico clínico da infecção por Rinovírus humano é dificultado pela similaridade 
dos sintomas apresentados em todas as infecções respiratórias, como as ocasionadas pelos 
Influenza, Orthopneumovirus Humano e Metapneumovírus. Desta forma, torna-se necessária a 
realização do diagnóstico laboratorial para confirmar a infecção por este agente infeccioso 
(GERN, 2010). 
Para o diagnóstico laboratorial, o espécime clínico deve ser colhido o mais breve 
possível após o início dos sintomas, sendo que os maiores índices de HRV no trato respiratório 
são verificados nos dois primeiros dias da apresentação dos sintomas, contudo o vírus pode ser 
detectado um dia antes do aparecimento dos sintomas até seis dias depois (JACOBS et al., 
2013). 
Os espécimes clínicos de escolha para a detecção de HRV, assim como para outros 
patógenos respiratórios, são aspirado de nasofaringe, swab nasal, swab de orofaringe, aspirado 
traqueal ou brônquico e lavado brônquio-alveolar. Os espécimes coletados devem ser obtidos 
em meio de transporte viral e enviados ao laboratório sob refrigeração adequada (4 a 8°C) para 
processamento diagnóstico (GERN, 2010; JACOBS et al., 2013). 
23 
 
 
As técnicas laboratoriais de diagnóstico disponíveis envolvem detecção de anticorpos, 
isolamento do vírus em cultivo celular ou detecção do ácido nucleico por métodos 
moleculares. As técnicas para detecção de anticorpo envolvem testes de fixação do 
complemento e ensaios imunoenzimáticos, contudo frente à diversidade de sorotipos de HRV 
os testes sorológicos têm sido utilizados somente em pesquisa. O isolamento viral é limitado 
em virtude da especificidade dos HRV a algumas linhagens celulares, como por exemplo 
HeLa e Vero, vale ressaltar que ainda não há um sistema de cultivo celular que permita o 
isolamento dos HRV-C (ARRUDA et al., 1996; ARRUDA; HAYDEN,1993; BLOMQVIST 
et al., 2002; MACKAY, 2008; JACOBS et al., 2013). 
Com a utilização de métodos moleculares a participação dos HRV em doenças 
respiratórias tem sido mais frequentemente demonstrada (MILLER et al., 2009; PIRALLA et 
al., 2009). A maioria dos testes de reação em cadeia mediada pela polimerase (PCR) utilizados 
para detectar Rinovírus humano é baseada na amplificação de um fragmento da extremidade 
5’ da região não codificante (NCR) do genoma viral, assim sendo, garantem uma alta 
sensibilidade. A análise da sequência de nucleotídeos permite ainda determinar os diferentes 
sorotipos/genótipos de HRV (MORI; CLEWLEY, 1994; SAVOLAINEN et al., 2002; 
JACOBS et al., 2013). 
 
 
24 
 
 
3 OBJETIVO 
3.1 OBJETIVO GERAL 
 Verificar a frequência dos tipos de Rinovírus humano detectados em amostras de 
pacientes atendidos com queixas sugestivas de infecção respiratória aguda na cidade de 
Belém, Pará, Brasil, no ano de 2015. 
 
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 Descrever a diversidade genética das espécies de HRV circulantes na população 
estudada; 
 Relacionar a circulação do Rinovírus humano com as variáveis: sexo, idade e 
sazonalidade; 
 Relacionar a circulação do Rinovírus humano com os índices pluviométricos no estado 
do Pará. 
 
25 
 
 
4 MATERIAL E MÉTODOS 
4.1 ASPECTOS ÉTICOS E DE BIOSSEGURANÇA 
Este projeto foi elaborado obedecendo as Diretrizes e Normas Regulamentadoras de 
Pesquisas Envolvendo Seres Humanos, Resolução do CNS nº 466 de 12/12/2012, sendo 
submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) com seres humanos do Instituto Evandro 
Chagas (IEC) com o parece de número 112505/2015. (Anexo 1) 
Os procedimentos laboratoriais deste projeto foram realizados em laboratórios Nível 
de Biossegurança 2 (NB-2), com a utilização de todos os equipamentos de proteção individual 
(EPI) e de proteção coletiva (EPC) pertinentes. 
 
4.2 TIPO DE ESTUDO 
Trata-se de um estudo epidemiológico de base populacional, do tipo observacional, 
transversal. 
 
4.3 POPULAÇÃO DE ESTUDO 
A população de estudo compreendeu 274 indivíduos em diferentes faixas etárias, com 
queixas sugestivas de infecção respiratória aguda (IRA) provenientes do Centro de Saúde 
Escola da Universidade do Estado do Pará (UEPA) – localizado no bairro do Marco em 
Belém, bem como do Laboratório Central de Saúde Pública do Estado do Pará (LACEN/PA). 
 
4.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO 
Os pacientes inclusos, foram aqueles que apresentavam sintomas até 7 dias após o 
início dos sintomas, e assinarem o TCLE (Termo de Consentimento Livre e Esclarecido), e os 
excluídos foram os pacientes com os sintomas a mais de 7 dias, ou que se recusarem a assinar 
o TCLE. 
 
4.5 COLETA DAS AMOSTRAS 
Os espécimes clínicos analisados neste estudo foram coletados, no período 
compreendido entre os meses de janeiro a dezembro de 2015 e consistiram em amostras de 
aspirado nasofaríngeo ou swab combinado (narina/garganta) coletados por uma equipe 
especializada do LACEN-PA e do Centro de Saúde Escola da UEPA, a partir de pacientes que 
apresentavam sinais e sintomas de síndrome gripal com até sete dias de evolução. 
26 
 
 
A coleta do aspirado nasofaríngeo foi realizada com auxílio de uma bomba a vácuo 
acoplada a um tubo coletor contendo meio de transporte (Hanks e gelatina a 0,5%). Neste 
procedimento o cateter do tubo coletor é delicadamente introduzido nas cavidades 
nasofaríngeas do paciente, aspirando assim a secreção existente juntamente com células da 
mucosa nasofaríngea. A realização do swab combinado (SC) consistiu em friccionar o swab 
(espécie de cotonete) contra a mucosa nasal, sendo utilizado um swab para cada narina e outro 
para a garganta. Após a coleta todos os três Swabs são disponibilizados em um mesmo tubo 
contendo meio conservante, devidamente rotulado com o nome do paciente e a data de coleta. 
Após a coleta, os espécimes foram encaminhados, sob refrigeração (4°C), para o Laboratório 
de Vírus Respiratórios do Instituto Evandro Chagas (IEC) para processamento laboratorial. 
Vale ressaltar que a coleta das amostras clínicas foi conduzida em função de um outro 
projeto de pesquisa aprovado pelo CEP/IEC sob o parecer nº919.642 de 17/12/2014. As 
mesmas foram obtidas mediante a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 
(TCLE) no qual está expressa a possibilidade de utilização das amostras em novos estudos. 
 
4.6 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS 
4.6.1 Caracterização Genética 
A caracterização genética dos vírus foi desenvolvida utilizando-se 3 etapas principais: 
a) extração do RNA viral (RNAv); b) Detecção e amplificação do RNAv pela técnica de 
Reação em Cadeia mediada pela Polimerase precedida de Transcrição Reversa em tempo real 
(rRT-PCR) e convencional (RT-PCR); e c) sequenciamento parcial dos genes VP4/VP2. 
 
4.6.2 Extração do RNA viral (RNAv) 
O RNAv foi extraído a partir de 200µL do espécime clínico utilizando-se o 
PureLink
TM
 Viral RNA/DNA Mini Kit (Invitrogen - Thermo Scientific), seguindo as 
orientações do fabricante. Resumidamente, o método consiste em três etapas principais: lise, 
lavagem e eluição. O RNA eluído foi estocado a -70°C, quando não submetido de imediato a 
rRT-PCR. 
 
27 
 
 
4.6.3 Reação em Cadeia mediada pela Polimerase Precedida de Transcriptase Reversa 
em Tempo Real (rRT-PCR) para detecção de HRV 
A detecção do genoma viral foi realizada através da Reação em Cadeia mediada pela 
Polimerase precedida de Transcrição Reversa em tempo real (rRT-PCR), onde foram 
empregados o kit comercial AgPath-ID
TM
 One Step RT-PCR Kit (Ambion – Life 
Technologies), iniciadores específicos para HRV (Quadro 1) de acordo com o protocolo 
desenvolvido pelo Center for Disease Control and Prevention (CDC, Atlanta, EUA). 
 A mistura de reação para detecção de HRV foi composta por 5µL de H2O, 12,5 µL de 
PCR Master Mix, 0,5µL de cada iniciador, 0,5µL de sonda, 1µL de AgPath RT/Platinum Taq 
e 5µL do RNAv. Esta mistura foi inicialmente submetida a uma etapa a 45°C por 10 minutos 
para transcrição reversa, seguido por uma etapa de um ciclo a 95° por 10 minutos para 
ativação da Taq Polimerase e finalizando com a terceira etapa de 45 ciclos cada um composto 
por etapas de desnaturação a 95°C por 15 segundos e hibridização/extensão a 55°C por 1 
minuto. Todas as etapas de rRT-PCR foram realizadas em termociclador automático ABI 
7500 (Applied Biosystem – Thermo Scientific) 
 
Quadro 1 – Iniciadores utilizados na amplificação da região NCR (Noncoding Region – região 
não codificadora) de Rinovírus humano 
Iniciador 
Sequência dos oligonucleotídeos 
5’ – 3’ 
Tamanho do 
amplicom 
HRV For CPXGCCXGCGTGGC 
207 pb HRV Rev GAAACACGGACACCCAAAGTA 
HRV Pro FAM-TCCTCCGGCCCCTGAATGYGG C-BHQ1 
 
X = Base modificada (LNA – Locked Nucleic Acid - Ácido Nucléico Bloqueado) 
P= Pirimidina derivada (base degenerada mimetizando uma mistura de bases C/T) 
FAM= 6-carboxifluoresceína 
BHQ1= Black Hole Quencher
®
1 
 
4.6.4 Reação em Cadeia mediada pela Polimerase precedida de transcrição reversa (RT-
PCR) para amplificação parcial da região NCR e dos genes VP4/VP2 
A partir das amostras positivas na detecção, a RT-PCR foi feita em etapa única 
utilizando-se AgPath-ID
TM
 One Step RT-PCR Kit (Ambion – Life Technologies) e iniciadores 
específicos (Quadro 2), que produzem um fragmento de 549 pb, que compreende os genes 
28 
 
 
VP4 e VP2 e a parte hipervariável da região 5’ NCR, como descrito por Savolainen et al., 
2002. 
 
Quadro 2 – Iniciadores utilizados na amplificação da região NCR e genes VP4/VP2 dos Rinovírus 
humano 
Iniciador 
Sequência dos oligonucleotídeos 
5’ – 3’ 
Posição do fragmento no 
genoma* 
Tamanho do 
amplicom 
HRV F GCATCIGGYARYTTCCACCACCANCC 534–560 
549 pb 
HRV R GGGACCAACTACTTTGGGTGTCCGTGT 1083–1058 
I= inosina; Y= T, C; R= G, A; N= A, C, G, T 
* Baseado no genoma da cepa de Rinovírus humano 1b 
 
 As reações de RT-PCR foramfeitas para um volume final de 25µL contendo, 5 µL de 
RNA, 0.5µL de cada iniciador (50 µM) [Quadro 2], 12.5 µL de PCR Master Mix 2X e 0,5µL 
de AgPath RT/Platinum Taq. Para amplificação dos segmentos gênicos, a mistura de reação 
foi inicialmente incubada a 45°C por 30 minutos e 94°C 5 minutos. Seguido de 40 ciclos de 
94° por 45 segundos, 61°C por 45 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto. A etapa de 
extensão final foi feita a 72°C por 10 minutos. Sendo as etapas de RT-PCR realizadas em 
termociclador automático MasterCycler EP Gradient S (Eppendorf, Birkmann Instrument). 
4.6.5 Eletroforese em gel de agarose 
Ao término da amplificação, os produtos da RT-PCR foram analisados por meio de 
eletroforese horizontal em gel de agarose 1,5% corado por GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain 
(Biotium, Hayward, CA5). Os produtos foram submetidos à migração no gel, junto com o 
marcador de peso molecular 200 lines SmartLadder (EUROGENTEC), inicialmente por 5 
minutos 80 volts (V), seguido de 25 minutos a 110V. A visualização dos amplicons 
impregnados pelo corante foi feita em transiluminador com luz UV e fotografado com auxilio 
do sistema Vilber Loumart. 
4.6.6 Purificação e quantificação do produto da RT-PCR 
As amostras que apresentaram a banda de interesse foram submetidas à purificação do 
produto da RT-PCR, utilizando o kit comercial QIAquick PCR Purification (QIAGEN), 
29 
 
 
seguindo as instruções do fabricante. O produto eluído foi então quantificado seguindo 
instruções do fabricante do marcador de peso molecular Low Mass Ladder (Invitrogen). 
Sendo a concentração de cada amostra determinada, comparando-se a intensidade das bandas 
do marcador com a banda das amostras, o resultado foi expresso em nanogramas (ng). 
4.6.7 Reação de sequenciamento 
Para reação de sequenciamento foi utilizado o Kit Big Dye
®
 terminator Cycle 
Sequencing v 3.1(Applied Biosystem – Life Technologies). Foram preparadas misturas de 
reação com volume final de 10 µL, composta por 2 µL de Big Dye
®
, 1µL de tampão 5X 
Running Buffer, 5µL de DNA (50ng) e 0,5µM de iniciadores específicos (Quadro 2). Esta 
mistura foi processada em termociclador automático (MasterCycler EP Gradient S, 
Eppendorf, Birkmann Instrument) onde foi executado um ciclo a 94°C por 2 min, seguido de 
25 ciclos cada um composto por 94°C 45 segundos, 50°C 30 segundos e 60°C 4 minutos. 
4.6.8 Precipitação do produto da reação de sequenciamento 
Após a reação de sequenciamento as amostras foram submetidas à precipitação com 
isopropanol e etanol, com finalidade de retirar o excesso de bases marcadas não incorporadas 
na reação de sequenciamento. Para isso foram adicionados 40µL de isopropanol 65% ao 
produto da reação, incubando-se por 15 minutos a TA. Em seguida, foi realizada 
centrifugação a 4.500 rpm durante 45 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento 
lavado com 200µL de etanol 70%, seguiu-se a centrifugação a 4.500 rpm por 20 minutos e o 
sobrenadante foi desprezado. Após o descarte do sobrenadante o sedimento foi submetido à 
secagem em termobloco a 60°C por 5 minutos e ressuspenso em 15µL de formamida 
deionizada (Formamida Hi Di – Applied Biosystems – Life Technologies). 
4.6.9 Eletroforese em sequenciador automático 
Após ressuspensas em formamida, as amostras foram submetidas à desnaturação por 
95°C durante 5 minutos e em seguida colocadas em gelo por 2 minutos. Posteriormente, 
foram analisadas por meio da eletroforese capilar em sequenciador automático ABIPrism 
3130 xl (Applied Biosystem), baseada no método de terminação de cadeia (SANGER et al., 
1977). 
 
30 
 
 
4.6.10 Análise da sequência de nucleotídeos e inferências filogenéticas 
As suítes de bioinformática Geneious v 8.1.4 foram utilizadas para visualização das 
sequências e realização da edição e alinhamento. Para o estudo comparativo, as sequências 
foram alinhadas com as de outros vírus isolados e disponíveis no banco de dados do Genbank 
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 
A construção das árvores filogenéticas foi realizada através do método de máxima 
verossimilhança (maximum likelihood-ML), usando o programa Fasttree. A análise de 
Bootstrap com 1.000 réplicas foi usada para dar confiabilidade aos grupamentos filogenéticos 
(FELSENSTEIN, 1985). 
https://mail.iec.pa.gov.br/exchweb/bin/redir.asp?URL=http://www.ncbi.nlm.nih.gov
31 
 
 
5 RESULTADOS 
No período de janeiro a dezembro de 2015 foram coletadas 274 amostras de pacientes 
com queixas de IRA. Deste total, 43 (15,7%) mostraram-se positivas para o HRV por meio da 
técnica laboratorial rRT-PCR (Figura 5). 
Figura 5 – Resultado obtido nas amostras analisadas por rRT-PCR para detecção de HRV em 
pacientes com quadro sugestivo de infecção respiratória aguda no ano de 2015 
Fonte: próprio autor 
A distribuição por faixa etária das amostras positivas evidencia que os pacientes 
situados na faixa de zero a cinco anos foram os mais acometidos com 14, de um total de 46 
crianças (30,4%) amostras positivas (Figura 6). 
Figura 6 – Distribuição dos casos positivos por faixa etária, em comparação com o total de 
indivíduos de cada um dos grupos etários avaliados, sendo as crianças menores de 5 anos de 
idade as mais acometidas em relação ao total de crianças no presente estudo 
 
Fonte: próprio autor 
32 
 
 
A distribuição por gênero demonstra que o sexo feminino foi o mais frequente, com 27 
das 43 positivas com infecção por HRV, contudo, em relação ao total de mulheres e homens 
avaliados, a proporção foi maior em homens, representando 18,1% (Figura 7). 
Figura 7 – Distribuição dos casos positivos por sexo 
Fonte: Próprio autor 
Os sinais e sintomas mais relatados pelos pacientes que apresentaram infecção por 
HRV foram tosse (83,7%), coriza (79%), febre (67,4%) e dor de garganta (62,7%) (Figura 8) 
Figura 8 – Sinais e sintomas mais prevalentes nos pacientes com infecção por HRV 
Fonte: Próprio autor 
33 
 
 
Das 43 amostras positivas na rRT-PCR foi possível realizar a caracterização por 
sequenciamento em 21 delas. A análise evidenciou a circulação das três espécies de HRV na 
população investigada. Sendo 14 (32,5%) HRV-A, 1 (2,3%) HRV-B e 6 (13,9%) HRV-C 
(Figura 9). 
Figura 9 – Espécies de HRV identificadas na população de estudo 
Fonte: Próprio autor 
 
34 
 
 
Figura 10 – A construção das árvores filogenéticas foi realizada através do método de máxima 
verossimilhança (maximum likelihood-ML), usando o programa Fasttree 
Fonte: Próprio autor 
Nas amostras postivas para HRV foi investigada também a ocorrência de outros vírus 
respiratórios. Neste contexto, foi observada a co-infecção em 5 (11,6%) do total de amostras 
positivas para HRV (Figura 11) 
Figura 11 – Casos positivos para HRV que apresentaram co-infecção com outros vírus respiratórios, 
todos os principais sintomas foram relatados, além de mialgia e cefaléia 
Fonte: Próprio autor 
35 
 
 
Quanto a distribuição mensal dos casos positivos de HRV durante o ano de 2015, 
nota-se que 95% da incidência dos casos se concentrou no primeiro semestre do ano, com 
picos de incidência nos meses de janeiro, fevereiro e junho (Figura 12). 
Figura 12 – Distribuição das amostras positivas para HRV em relação ao total mensal de amostras 
analisadas 
Fonte: Próprio autor 
Dados das médias mensais das chuvas em Belém, Pará, no ano de 2015, evidenciando 
que no primeiro semestre do ano se apresentam as maiores concentrações de chuvas (Figura 
13) 
Fonte: Instituto Nacional de Meteorologia - INMET 
36 
 
 
6 DISCUSSÃO 
O HRV foi intimamente associado aos quadros de infecções respiratórias moderadas, 
tais como o resfriado comum desde sua descoberta em 1956. Atualmente, frente às diversas 
investigações conduzidas em todo o mundo, o HRV vem sendo demonstrado como um dos 
principias agentes associados à casos graves de infecções respiratórias, como asma e 
infecções do trato respiratório inferior, fato que vem atribuindo maiornotoriedade a este 
agente dentro da saúde pública (LANDA-CARDENÃ et al., 2008; MILLER et al., 2009; 
MARCONE et al., 2012; PRETORIUS et al., 2014; LU et al., 2014). 
O presente estudo avaliou a presença de HRV em pacientes com sintomas sugestivos 
de infecção respiratória aguda (IRA) no período de 12 meses. Os resultados obtidos 
expressam uma taxa de infecção por HRV relevante, fato já descrito em outros estudos, 
mostrando que esse vírus é um agente importante na etiologia das infecções respiratórias 
(ALBUQUERQUE et al., 2012; COSTA et al., 2012; MARCONE et al., 2012; MARTINS JR 
et al., 2014). 
Os resultados demonstraram que os principais grupos etários acometidos foram os de 
crianças na faixa de zero a cinco anos, visto que nesse grupo o sistema imunológico ainda é 
debilitado de defesas e suscetível a infecções, o grupo de adultos de 30 a 59 anos apresentou 
positividade, o que reforça a importância de detectar o HRV nesta população. Da mesma 
forma, investigação conduzida por Costa em 2012 verificou uma alta taxa de crianças 
menores de cinco anos com infecção respiratória aguda causada por HRV, bem como uma 
maior frequência em indivíduos do sexo feminino (58%), e segundo o estudo realizado em 
2014 por Seo, que detectou a presença do vírus em adultos hospitalizados com IRA (COSTA 
et al., 2012; SEO et al., 2014). 
O HRV é amplamente distribuído em todo o mundo. Mais de um subtipo de HRV 
pode estar presente em uma comunidade ou em um indivíduo ao mesmo tempo (VESA et al., 
2001). Quanto à distribuição do HRV na cidade de Belém, no período estudado, foi verificado 
a maior circulação destes agentes ocorreu nos meses de janeiro, fevereiro e junho. Observou-
se que a maior circulação do HRV incidiu predominantemente no primeiro semestre do ano, 
correspondendo ao período de maior pluviosidade no Estado do Pará, esse fato pode estar 
atrelado com as maiores taxa de umidade, que favorecem a viabilidade do vírus (MELLO et 
al., 2009; VESA et al., 2001; LEOTTE et al., 2016). 
37 
 
 
A caracterização genética realizada neste estudo, ainda que em um número reduzido 
de amostras, evidenciou a circulação das espécies A, B e C de HRV na cidade de Belém no 
período pesquisado. Os achados corroboram com os de outros autores, os quais demonstram 
uma maior ocorrência das espécies HRV-A e HRV-C (KAIDA et al., 2011; LU et al., 2014; 
PRETORIUS et al., 2014). 
Investigações realizadas por Kaida e colaboradores nos anos de 2008 e 2009 na cidade 
de Osaka no Japão, demonstraram dados semelhantes, onde das 336 amostras de pacientes de 
zero a 74 anos de idade, em 271 foi possível detectar um ou mais vírus. No total foram 
detectados 364 vírus respiratórios, sendo HRV o mais frequente com 84 (23%) detecções, 
sendo o tipo A mais frequente. A exemplo do encontrado em nosso estudo, também observou 
que entre os principais agravos estava a asma e bronquite (KAIDA et al., 2011). 
Em um estudo realizado em Seul na Coreia do Sul, entre 2009 e 2012, com pacientes 
divididos em crianças de zero até 14 anos, e adultos entre 15 e maiores de 65 anos, foi 
observado que de 3.865 amostras clínicas de crianças com quadros de infecção respiratória, 
2800 mostraram-se positivas (72,4%) para vírus respiratórios, e o mais frequente entre os 
patógenos identificados foi o HRV (889/31,8%).Nos adultos, das 763 amostras analisadas, 205 
se revelaram positivas para algum dos vírus analisados, e o agente mais relatado foi o 
Influenza A (28.5%) seguido pelo HRV (15.5%). Sendo que casos de co-infecção foram 
observados em 279 espécimes (31,4%) (SEO et al., 2014). 
No Brasil em um estudo conduzido no Estado de São Paulo nos anos de 2008 e 2009, 
demonstrou-se que de 134 amostras clínicas de crianças menores de 12 anos de idade, em 99 
delas foi possível identificar pelo menos um vírus (73,9%). O HRV foi o agente mais 
detectado com 53 amostras positivas (53,5%), seguidos por Influenza A com 33%, e 
Orthopneumovirus com 8 detecções. Foram observadas 69 monoinfecções, sendo 30 dessas 
relacionadas ao HRV (22,4%), 30 Co-infecções onde o HRV foi responsável por 21 (70%) 
dos casos, assim como nosso presente estudo que foram evidenciados 5 co-infecções 11,6%. 
(KAMIKAWA et al., 2015) . 
Em Curitiba, Paraná, Leotte investigou 755 amostras clínicas de pacientes internados 
com síndrome respiratória aguda em um hospital terciário, nos anos de 2012 a 2013 em 
Curitiba. Destas, em 444 foi possível detectar algum vírus respiratório, sendo o HRV o mais 
incidente com 162 amostras positivas (36,5%), e também o agente mais prevalente nas co-
38 
 
 
infecções, com 88 (68,7%) das 128 relatadas. A maioria dos pacientes infectados pelo HRV 
possuía menos de 5 anos, assim como também observado em nosso estudo, onde 32% dos 
indivíduos afetados eram crianças menores de 5 anos de idade (LEOTTE et al., 2016.) 
Um estudo anterior conduzido em Belém, Pará, foram analisadas 224 amostras de 
pacientes com SRAG atendidos em unidades hospitalares no período de janeiro de 2013 a 
janeiro de 2014. Das quais 59 (26,3%) foram positivas para HRV, sendo as crianças menores 
de 5 anos de idade as mais afetadas. Destas HRV positivas, em 22 foi possível realizar a 
caracterização das espécies de HRV por sequenciamento, e como em nosso estudo, as 
espécies HRV-A e HRV-C mostravam-se as mais frequentes, respectivamente (LIMA et al., 
2016). 
 
39 
 
 
7 CONCLUSÃO 
O Rinovírus humano apresentou-se como um importante agente de doença respiratória 
na população investigada. 
A faixa etária de zero a cinco anos de idade foi a que concentrou a maioria de casos de 
infecção respiratória associada ao HRV, além de que o total de crianças foi mais de 50% 
menor que o total de adultos. 
O pico de atividade do HRV na cidade de Belém, Pará, ocorreu principalmente nos 
primeiros seis meses, período este reconhecido por apresentar altos índices pluviométricos na 
região amazônica, sugere-se que a chuva tenha influenciado nesse fator. 
Observou-se também a co-circulação das espécies de HRV, com predomínio da 
espécie HRV-A (66,7%). 
 
40 
 
 
REFERÊNCIAS 
ALBUQUERQUE, M. C. M.; SANTOS, N.; VARELLA, R. B. Acute respiratory viral 
infections in children in Rio de Janeiro and Teresópolis, Brazil. Revista do Instituto de 
Medicina Tropical de São Paulo, v. 54, n. 5, p. 249-255, 2012. 
 
ALTO, W. A. Human metapneumovirus: a newly described respiratory tract pathogen. The 
Journal of the American Board of Family Medicine, v. 17, n. 6, p. 466-469, 2004. 
 
ANDREWES, C. The Common Cold. New York, NY: Norton, 1965. 
 
ARAKAWA, M.; OKAMOTO-NAKAGAWA, R.; TODA, S.; TSUKAGOSHI, H.; 
KOBAYASHI, M.; RYO, A.; MIZUTA, K.; HASEGAWA, S.; HIRANO, R.; WAKIGUCHI, 
H.; KUDO, K.; TANAKA, R.; MORITA, Y.; NODA, M.; KOZAWA, K.; ICHIYAMA, T.; 
SHIRABE, K.; KIMURA, H. Molecular epidemiological study of human rhinovirus species 
A, B and C from patients with acute respiratory illnesses in Japan. Journal Medical of 
Microbiology, v. 61, p. 410-419, 2012. 
 
ARRUDA, E.; HAYDEN, F.G. Detection of human rhinovirus RNA in nasal washings by 
PCR. Molecular and Cellular Probes, v. 7, p. 373-379, 1993. 
 
ARRUDA, E.; CRUMP, C. E.; ROLLINS, B. R.; OHLIN, A.; HAYDEN, F. G. Comparative 
Susceptibilities of Human Embryonic Fibroblasts and HeLa Cells for Isolation of Human 
Rhinoviruses. Journal of Clinical Microbiology, v. 34, n. 5, p. 1277-1279, 1996. 
 
BELLA, J.; ROSSMANN, M. G. Review: rhinoviruses and their ICAM receptors. Journal 
Structure Biology, v. 128, n. 1, p. 69-74, 1999. 
 
BELLEI, N.; CARRARO, E.; PEROSA, E. Acute respiratory infections and influenza-like 
illness viral etiologies in Brazilian adults. Journal Medicine Virology, v. 80, n. 10, p. 1824-
1827, 2008. 
 
BERTINO, J. S. Cost burden of viral respiratory infections: issues for formulary decision 
makers. American Journal of Medicine, v. 112, n. 6, p. 42-49, 2002. 
 
BLOMQVIST, S.; ROIVAINEN, M.; PUHAKKA, T.; KLEEMOLA,M.; HOVI, T. 
Virological and serological analysis of rhinovirus infections during the first two years of life 
in a cohort of children. Journal Medicine Virology, v. 66, n. 2, p. 263-268, 2002. 
 
BOCHKOV, Y. A.; HANSON, K. M.; KELES, S.; BROCKMAN-SCHNEIDER, R. A.; 
JARJOUR, N. N.; GERN, J. E. Rhinovirus-included modulation of gene expression in 
bronchial epithelial cells from subjects with asthma. Mucosal Immunology, v. 1, n. 3, p. 69-
80, 2010. 
 
BOIVIN, G.; OSTERHAUS, A. D.; GAUDREAU, A.; JACKSON, H. C.; GROEN, J. 
WARD, P. Role of picornaviruses in flu-like illnesses of adults enrolled in an oseltamivir 
treatment study who had no evidence of influenza virus infection. Journal Clinical of 
Microbiology, v. 40, n. 2, p. 330-334, 2002. 
 
41 
 
 
BRIESE, T.; RENWICK, N.; VENTER, M.; JARMAN, R. G.; GHOSH, D.;
 
KÖNDGEN, S. 
et al. Global distribution of novel rhinovirus genotype. Emerging Infectious Disease, v. 14, 
n. 6, p. 944-947, 2008. 
 
COSTA, F. L.; YOKOSAWA, J.; VIEIRA-UEIRA, C. Rinovírus humano em infecções 
respiratórias agudas em crianças menores de cinco anos de idade: fatores envolvidos no 
agravamento da doença. 2012. 58 p. Tese (Doutorado em Imunologia e Parasitologia 
Aplicadas) – Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2012. 
 
CORDEY, S.; SCHIBLER, M.; TAPPAREL, C.; KAISER, L. Rhinovirus: diversité clinique 
et génomique. Virologie, v. 12, n. 5, p. 361-373, 2008. 
 
CORDEY, S.; JUNIER, T.; GERLACH, D.; GOBBINI, F.; FARINELLI, L.; ZDOBNOV, E. 
M.; WINTHER, B.; TAPPAREL, C.; KAISER, L. Rhinovirus Genome Evolution during 
Experimental Human Infection. PLoS One, v. 5, n. 5, p. e10588, 2010. 
 
DALENO, C.; PIRALLA, A.; SCALA, A.; SENATORE, L.; PRINCIPI, N.; ESPOSITO, S. 
Phylogenetic analysis of human rhinovirus isolates collected from otherwise healthy children 
with community-acquired pneumonia during five successive years. PLoS One, v. 8, n. 11, p. 
e80614, 2013. 
 
DIMOPOULOS, G. LERIKOU, M.; TSIODRAS, S. Viral epidemiology of acute 
exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. Pulmonary Pharmacology and 
Therapeutics, v. 25, n. 1, p. 12-18, 2012. 
 
DOWLING, H. F.; JACKSON, G. G.; INOUYE, T. Transmission of the common cold to 
volunteers using controlled conditions. II. The effect of certain host factors upon 
susceptibility. Journal Laboboratory Clinical Medicine, v. 50, n. 8 p. 516-525, 1957. 
 
DOYLE, W. J.; CASSELBRANT, M. L.; LI-KOROTKY, H.; DOYLE, A. P. C.; LO, C.; 
TURNER, R.; COHEN, S. The interleukin 6 – 174 C/C genotype predicts greater rhinovirus 
illness. Journal Infection Disease, v. 201, n. 2, p. 199-206, 2010. 
 
DRAKE, J. W.; HOLLAND, J. J. Mutation rates among RNA viruses. Proceedings of the 
National Academy of Sciences USA, v. 96, n. 24, p. 13910-139103, 1999. 
 
DUECHLER, M.; KETTER, S.; SKERN, T.; KUECHLER, E.; BLAAS, D. Rhinoviral 
receptor discrimination: mutational changes in the canyon regions of human Rhinovirus types 
2 and 14 indicate a different site of interaction. Jornal of General Virology, v. 74, pt. 10, p. 
2287-2291, 1993. 
 
FELSENSTEIN, J. Phylogenies and the Comparative Method. The American Naturalists, v. 
125, n. 1, p. 1-15, 1985. 
 
FICA, A.; DABANCHA, J.; ANDRADE, W.; BUSTOS, P.; CARVAJAL, I.; CERONI, C.; 
TRIANTFILO, V.; CASTRO, M.; FASCE, R. Clinical relevance of rhinovirus infections 
among adult hospitalized patients. The Brazilian Journal of Infectious Diseases, v. 19, n. 2, 
p. 118-124, 2015. 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Renwick%20N%5Bauth%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Venter%20M%5Bauth%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jarman%20RG%5Bauth%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ghosh%20D%5Bauth%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=K%26%23x000f6%3Bndgen%20S%5Bauth%5D
http://repositorio.ufu.br/handle/123456789/2794
http://repositorio.ufu.br/handle/123456789/2794
http://repositorio.ufu.br/handle/123456789/2794
42 
 
 
FUCHS, R.; BLAAS, D. Uncoating of human rhinoviruses. Medicine Virololy, v. 20, n. 5, p. 
281-297, 2010. 
 
GARDINASSI, L. G.; SIMAS, P. V. M.; SALOMÃO, J. B.; DURIGON, E. L.; TREVISAN, 
D. M. Z.; CORDEIRO, J. A.; LACERDA, M. N.; RAHAL,P; SOUZA, F. P. Seasonality of 
viral respiratory infections in southeast of Brazil: the influence of temperature and air 
humidity. Brazilian Journal of Microbiology, v. 43, n.1, p. 98-108, 2012. 
 
GAMA, R. E.; HUGHES, P. J.; BRUCE, C. B.; STANWAY, G, Polymerase chain reaction 
amplification of rhinovirus nucleic acids from clinical material. Nucleic Acids Research, v. 
16, n. 19, p. 9346, 1988. 
 
GAMA, R. E.; HORSNELL, P. R.; HUGHES, P. J.; NORTH, C.; STANWAY, G.; BRUCE, 
C. B.; AL-NAKIB, W.; STANWAY, G. Amplification of rhinovirus specific nucleic acids 
from clinical samples using the polymerase chain reaction. Journal Medical Virology, v. 28, 
n. 2, p. 73-77, 1989. 
 
GIAMBERARDIN, H. I.; HOMSANI, S.; BRICKS, L. F.; PACHECO, A. P.; GUEDES, M.; 
DEBUR, M. C.; RABONI, S. M. Clinical and epidemiological features of respiratory virus 
infections in preschool children over two consecutive influenza seasons in southern Brazil. 
Journal of Medical Virology, v. 88, n. 8, p. 1325-1333, 2016. 
 
GERN, J. E. The ABCs of rhinoviruses, wheezing, and asthma. Journal of Virology, v. 84, n. 
15, p. 7418-7426, 2010. 
 
GREVE, J. M.; DAVIS, G.; MEYER, A. M.; FORTE, C. P.; YOST, S. C.; MARLOR, C. W.; 
KAMARCK, M. E.; McCLELLAND, A. The major human rhinovirus receptor is ICAM-1. 
Cell, v. 56, n. 5, p. 839-847, 1989. 
 
GHILDYAL, R.; JORDAN, B.; LI, D.; DAGHER, H.; BARDIN, P. G.; GERN, J. E.; JANS, 
D. A. Rhinovirus 3C Protease Can Localize in the Nucleus and Alter Active and Passive 
Nucleocytoplasmic Transport. Journal of Virology, v. 83, n. 14, p. 7349-7352, 2009. 
 
HAMPARIAN, V. V.; COLONNO, R. J.; COONEY, M. K. A collaborative report: 
Rhinoviruses-extension of the numbering system from 89 to 100. Virology, v. 159, n. 1, p. 
191-192, 1987. 
 
HASEGAWA, K.; LINNEMANN, R. W.; AVADHANULA, V.; MANSBACH, J. M.; 
PIEDRA, P. A.; GERN, J. E.; CAMARGO JÚNIOR, C. A. Detection of respiratory syncytial 
virus and rhinovirus in healthy infants. BMC Research Notes, v. 8, art. 718, 2015. 
 
HENQUELL, C.; MIRAND, A.; DEUSEBIS, A. L.; REGAGNON, C.; ARCHIMBAUD, C.; 
CHAMBON, M.; BAILLY, J. L.; GOURDON, F.; HERMET, E.; DAUPHIN, J. B.; LABBÉ, 
A.; PEIGUE-LAFEUILLE, H. Prospective genotyping of human rhinoviruses in children and 
adults during the winter of 2009-2010. Journal of Clinical Virology, v. 53, n. 4, p. 280-284, 
2012. 
 
JACKSON, G. G.; DOWLING, H. F.; SPIESMAN, I.G. Transmission of the common cold to 
volunteers under controlled conditions. I. The common cold as a clinical entity. Archives of 
Internal Medicine, v. 101, n. 2, p. 267-278, 1958. 
javascript:void(0);
javascript:void(0);
javascript:void(0);
javascript:void(0);
javascript:void(0);
43 
 
 
JACKSON, G. G.; DOWLING, H. F. Transmission of the common cold to volunteers under 
controlled conditions. IV. Specific immunity to the common cold. Journal of Clininical 
Investigation, v. 38, n. 35, p. 762-769, 1959. 
 
JACKSON, G. G.; DOWLING, H. F.; MOGABGAB, W. J. Infectivity and interrelationships 
of 2060 and JH viruses in volunteers. Journal Laboratory Clinical Medicine, v. 55, n.3, p. 
331-341, 1960. 
 
JACOBS, S. E.; LAMSON, D. M.; KIRSTEN, S.; GEORGE, THOMAS, J. Walsh Human 
Rhinoviruses. Clinical Microbiology, v. 26, n. 1, p. 135, 2013. 
 
JAIN, S.; WILLIAMS, D. J.; ARNOLD, S. R.; AMPOFO, K.; BRAMLEY, A. M.; REED, C. 
et al. Community-Acquired Pneumonia Requiring Hospitalization among U.S. Children. New 
England Journal of Medicine, v. 372, n. 9, p. 835-845, 2015. 
 
KAIDA, A.; KUBO, H.; TAKAKURA, K. I.; TOGAWA, M.; SHIOMI, M.; KOHDERA, U.; 
IRITANI, N. Molecular Epidemiology of Human Rhinovirus C in Patients with Acute 
Respiratory Tract Infections in Osaka City, Japan. Journal Infection Disease, v. 64, n. 6, p. 
488-492, 2011.KAMIKAWA, J.; GRANATO, C. F. H.; BELLEI, N. Viral aetiology of common colds of 
outpatient children at primary care level and the use of antibiotics. Memórias do Instituto 
Oswaldo Cruz, v. 110, n. 7, p. 884-889, 2015. 
 
KAPIKIAN, A. Z.; CONANT, R. M.; HAMPARIAN, V. V. Rhinoviruses, a numbering 
system. Nature, v. 213, n. 5078, p. 761-763, 1967. 
 
KAPIKIAN, A. Z.; CONANT, R. M.; HAMPARIAN, V. V. Collaborative report: 
rhinoviruses extension of the numbering system.Virology, v. 43, n. 2, p. 524-526, 1971. 
 
KELLIS-ROGERS, N.; BENDALL, M. L; CRANDALL, K. A. Phylogenetic relationships 
and molecular adaptation dynamics of human rhinoviruses. Molecular Biology Evolution, v. 
26, n. 5, p. 969-981, 2009. 
 
KELLY, J. T.; BUSSE, W. W. Hoste immune responses to rhinovirus: mechanisms in asthma. 
Journal Allergy Clinical Immunology, v. 122, n. 4, p. 671-682, 2008. 
 
KIRSHBERGER, S.; MAJDIC, O.; STOCKL, J. Modulation of immune system by human 
rhinoviruses. International Archives of Allergy and Immunology, v. 142, n. 1, p. 1-10, 
2007. 
 
KISTLER, A. L; WEBSTER, D. R.; ROUSKIN, S.; MAGRINI, V.; CREDLE, J. J.; 
SCHNURR, D. P.; BOUSHEY, H. A.; MARDIS, E. R.; LI, H.; DERISI, J. L. Genome-wide 
diversity and selective pressure in the human rhinovirus. Journal Virology, v. 4, art. 40, 
2007. 
 
LANDA-CARDEÑA, A.; MORALES-ROMERO, J.; GARCÍA-ROMAN , R.; COBIÁN-
GÜEMES, A, G.; MÉNDEZ, E.; ORTIZ-LEON, C.; PITALÚA-CORTÉS, F.; MORA, S. I.; 
MONTERO, H. Clinical characteristics and genetic variability of human rhinovirus in 
Mexico. Viruses, v. 4, n. 2, p. 200-210, 2012. 
44 
 
 
LAMSON, D.; RENWICK, N.; KAPOOR, V.; LIU, Z.; PALACIOS, G.; JU, J.; DEAN, A.; 
ST GEORGE, K.; BRIESE, T.; LIPKIN, W. I. MassTag polymerase-chainreaction detection 
of respiratory pathogens, including a new rhinovirus genotype, that caused influenza-like 
illness in New York State during 2004-2005. Journal of Infectious Diseases, v. 194, n. 10, p. 
1398-1402, 2006. 
 
LAU, S. K.; YIP, C. C. Y.; TSOI, H. W.; LEE, R. A.; SO, L. Y.;
 
LAU, Y. L.; CHANM, K. 
H.; WOOM, P. C.; YUENM K. Y. Clinical features and complete genome characterization of 
a distinct human rhinovirus genetic cluster, probably representing a previously undetected 
HRV species, HRV-C, associated with acute respiratory illness in children. Jounal Clinical 
Microbiology, v. 45, n. 11, p. 3655-3664, 2007. 
 
LEDFORD, R. M.; PATEL, N. R.; DEMENCZUK, T. M.; WATANYAR, A.; HERBERTZ, 
T.; COLLETT, M. S. VP1 Sequencing of All Human Rhinovirus Serotypes: Insights into 
Genus Phylogeny and Susceptibility to Antiviral Capsid-Binding Compounds. Journal of 
Virology, v. 78, n. 7, p. 3663-3674, 2004. 
 
LEOTTE, J.; TROMBETTA, H.; FAGGION, H. Z.; ALMEIDA, B. M.; NOGUEIRA, M. B.; 
VIDAL, L. R.; RABONI, S. R. Impact and seasonality of human rhinovirus infection in 
hospitalized patients for two consecutive years. Jornal de Pediatria (RJ), v. 93, n. 3, p. 294-
300, 2016. 
 
LESSLER, J.; REICH, N. G.; BROOKMEYER, R.; PERL, T. M.; NELSON, K. E.; 
CUMMINGS, D. A. T. Incubation periods of acute respiratory viral infections: a systematic 
review. Lancet Infection Disease, v. 9, n. 5, p. 291-300, 2009. 
 
LIMA, S. T.; VERGUEIRO, M. V. B.; SOUZA JÚNIOR, E. C.; FERREIRA, D. L. SOUZA, 
E. M. A.; MELLO, W. A.; SOUZA, R. C. M.; SANTOS, M. C.; Epidemiologia molecular de 
cepas de rinovírus humano circulantes na Cidade de Belém, Estado do Pará, Brasil. Revista 
Pan-Amazônica de Saúde, v. 7, n. esp., p. 159-165, 2016. 
 
LOUIE, J. K.; HACKER, J. K.; GONZALES, R.; MARK, J.; MASELLI, J. H.; YAQI, S.; 
DREW, W. L. Characterization of viral agents causing acute respiratory infection in a San 
Francisco University Medical Center Clinic during the influenza season. Clinical Infect 
Disease, v. 41, n. 6, p. 822-828, 2005. 
 
LU, X.; HOLLOWAY, B.; DARE, R. K.; KUYPERS, J.; YAGI, S.; WILLIAMS, J. V.; 
HALL, C. B.; ERDMAN, D. D. Real-time reverse transcription-PCR assay for 
comprehensive detection of human rhinoviruses. Journal Clinical Microbiology, v. 46, n. 2, 
p. 533-539, 2014. 
 
LUCHSINGER, V.; AMPUERO, S.; PALOMINO M. A.; CHNAIDERMAN, J.; LEVICAN, 
J.; GAGGERO, A.; LARRAÑAGA, C. E. Comparison of virological profiles of respiratory 
syncytial virus and rhinovirus in acute lower tract respiratory infections in very young Chilean 
infants, according to their clinical outcome. Journal of Clinical Virology, v. 61, n. 1, p. 138-
144, 2014. 
 
MACKAY, I. M. Human rhinovirouses; the cold wars resume. Journal Clinical Virology, v. 
4, n. 2, p. 297-320, 2008. 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yip%20CC%5Bauth%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tsoi%20Hw%5Bauth%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20RA%5Bauth%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lau%20Yl%5Bauth%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Reich%20NG%5Bauth%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brookmeyer%20R%5Bauth%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Perl%20TM%5Bauth%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nelson%20KE%5Bauth%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cummings%20DA%5Bauth%5D
45 
 
 
MACKAY, I. M.; LAMBERT, S. B.; FAUX, C. E.; ARDEN, K. E.; NISSEN, M. D.; 
SLOOTS, T. P.; NOLAN, T. M. Community-Wide, Contemporaneous Circulation of a Broad 
Spectrum of Human Rhinoviruses in Healthy Australian Preschool-Aged Children During a 
12-Month Period. Journal of Infectious Diseases, v. 207, n. 9, p. 1433-1441, 2013. 
 
MARCONE, D. N. VIDELA, C.; RICARTE, C.; CARBALLAL, G.; VIDAURRETA, S.; 
ECHAVARRÍA, M. Rhinovirus detection by real-time RT-PCR in children with acute 
respiratory infection in Buenos Aires, Argentina. Revista Argentina de Microbiologia, v. 
44, n. 4, p. 259-265, 2012. 
 
MARCONE, D. N.; CULASSO, A.; CARBALLAL, G.; CAMPOS, R.; ECHAVARRÍA, M. 
Genetic diversity and clinical impact of human rhinoviruses in hospitalized and outpatient 
children with acute respiratory infection, Argentina. Journal of Clinical Virology, v. 61, n. 4, 
p. 558-564, 2014. 
 
MARTIN, E. K.; KUYPERS, J.; CHU, H. Y.; LACOMBE, K.; QIN, X.; STRELITZ, B.; 
BRADFORD, M.; JONES, C.; KLEIN, E. J.; ENGLUND, J. A. Molecular epidemiology of 
human rhinovirus infections in the pediatric emergency department. Journal of Clinical 
Virology, v. 62, p. 25-31, 2015. 
 
MARTINS Jr, R. B; CARNEY, S.; GOLDEMBERG, D.; BONINE, L.; SPANO, L. C.; 
SIQUEIRA, M.; CHECON, R. E. Detection of respiratory viruses by real-time polymerase 
chain reaction in outpatients with acute respiratory infection. Memórias do Instituto 
Oswaldo Cruz, v. 109, n. 6, p. 716-721, 2014. 
 
MCERLEAN, P.; SHACKELTON, L. A.; LAMBERT, S. B.; NISSEN, M. D.;SLOOTS, T. 
P.; MACKAY, I. M. Characterisation of a newly identified human rhinovirus, HRV-QPM, 
discovered in infants with bronchiolitis. Journal Clinical Virology, v. 39, n. 2, p. 67-75, 
2007. 
 
MCINTYRE, C. L.; SAVOLAINEN-KOPRA, C.; HOVI, T.; SIMMONDS, P. 
Recombination in the evolution of human Rhinovirus genomes. Archives of Virology, v. 158, 
n. 7, p. 1497-1515, 2013. 
 
MCINTYRE, C. L.; KNOWLES, N. J; SIMMONDS, P. Proposals for the classification of 
human rhinovirus species A, B and C into genotypically assigned types. Journal General 
Virology, v. 94, pt. 8, p.1791-1806, 2013. 
 
MELLO, W. A.; PAIVA, T. M.; ISHIDA, M. A.; BENEGA, M. A.; SANTOS, M. C.; 
VIBOUD, C.; MILLER, M. A.; ALONSO, W. J. The dilemma of influenza vaccine 
recommendations when applied to the tropics: the Brazilian case examined under alternative 
scenarios. PLoS One, v. 4, n. 4, p. e5095, 2009. 
 
MILLER, E. K.; EDWARDS, K. M.; WEINBERG, G. A.; IWANE, M. K.; GRIFFIN, M. R.; 
HALL, C. B.; ZHU, Y.; SZILAGYI, P. G.; MORIN, L. L.; HEIL, L. H.; LU, X.; 
WILLIAMS, J. V. A novel group of rhinoviruses is associated with asthma hospitalizations. 
Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 123, n. 1, p. 98-104, 2009. 
 
MORI, J.; CLEWLEY, J. P. Polymerase chain reaction and sequencing for typing rhinovirus