CAPÍTULO 3 - ASPECTOS MOLECULARES DA AÇÃO INSULÍNICA

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ASPECTOS MOLECULARES DA AÇÃO INSULÍNICA
CAPÍTULO 3
· Introdução: Cerca de 50% da insulina secretada no sistema venoso portal é degradada pelo fígado. A fração de insulina não-extraída pelo fígado entra na circulação sistêmica e liga-se aos receptores específicos nos órgãos-alvo. 
A ligação da insulina com seus receptores estimula atividade tirosina quinase intrínseca e, após a autotransfosforilação do receptor, recruta moléculas sinalizadoras intracelulares (primeira fase), como os substratos do receptor de insulina.
Essas e outras proteínas adaptadoras iniciam uma complexa cascata de reações de fosforilação e desfosforilação (segunda fase) que resultarão em extensivos efeitos metabólicos e mitogênicos (terceira fase). Assim a ativação da via da fosfatidilnositol-3’ quinase (PI3K) estimula a translocação de transportadores de glicose (GLUT-4) dos depósitos intracelulares para a superfície celular, evento crucial para que haja a captação da glicose no músculo esquelético e no tecido adiposo.
A ativação de outras vias de síntese protéica, lipogênese e regulação de inúmeros genes nas células responsivas à insulina. A homeostase da glicose resulta do equilíbrio preciso entre a produção hepática e utilização de glicose. Embora a insulina seja o mais importante regulador desse equilíbrio metabólico, vias neurais, sinais metabólicos e hormônios (glucagon) participam do controle integrado da disponibilidade e utilização da glicose. 
· Estado de jejum: No jejum, as baixas concentrações de insulina aumentam a produção de glicose decorrente da neoglicogênese e da glicogenólise. O glucagon também estimula a glicogenólise e a neoglicogênese pelo fígado e pela medula renal. As baixas concentrações plasmáticas de insulina diminuem a síntese de glicogênio, reduzem a captação de glicose nos tecidos insulinossensíveis e promovem a mobilização dos precursores armazenados. 
· Período pós-prandial: No período pós-prandial, a sobrecarga de glicose estimula a secreção insulínica e a diminuição das concentrações de glucagon levando à reversão desses processos. A principal porção da glicose pós-prandial é utilizada pelo músculo esquelético, efeito da captação de glicose dependente de insulina. Admite-se que a resistência insulínica desempenha papel primordial no desenvolvimento da intolerância à glicose e do diabetes mellitus, sendo considerada fator preditivo para o diabetes mellitus. A resistência à insulina é um achado comum no paciente com diabetes mellitus tipo 2 e já se encontra presente antes do diagnóstico de diabetes mellitus. O termo resistência à insulina indica o comprometimento da resposta biológica à insulina endógena secretada ou exógena administrada. A resistência insulínica é manifestada pela diminuição do transporte de glicose mediado pela insulina e do metabolismo da glicose em adipócitos e músculos esqueléticos, e pelo comprometimento da supressão da produção hepática de glicose. A sensibilidade à insulina é influenciada por inúmeros fatores, que incluem idade, peso, raça, gordura corporal (sobretudo a abdominal), atividade física e drogas. A resistência insulínica está associada à progressão para intolerância à glicose e diabetes mellitus tipo 2, muito embora o diabetes mellitus tipo 2 raramente seja diagnosticado em indivíduos resistentes à insulina sem um grau de disfunção da célula . A constatação de que parentes de primeiro grau, não-obesos, de pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2 apresentam resistência insulínica torna evidente a importância do componente genético na gênese dessa resistência. Ademais, considera-se a forte influência de fatores ambientais sobre a predisposição genética para resistência insulínica e, portanto, para o diabetes mellitus. 
· Início da sinalização insulínica: Após sua secreção pelas células  das ilhotas de Langerhans, a insulina circulante atinge rapidamente o tecido-alvo, no qual interage com seu receptor. O receptor de insulina (INSR) é o protótipo de uma família de proteínas homólogas integrais de membrana compostas pelo domínio extracelular de ligação como a insulina que controla a atividade da porção intracelular tirosina quinase.
O pró-receptor de insulina é codificado por um gene de 150 kb localizado no cromossomo 19 composto por 22 éxons. Durante a tradução, dois pró-receptores homólogos formam um dímero ligado por pontes dissulfeto que, cindindo, forma, um tetrâmero de dois dímeros com configuração 22. 
O receptor de insulina é uma tirosina quinase transmembrana amplamente expressa em todos os tecidos. Uma montagem alternativa do éxon 11, regulada de forma tecido-específica, direciona a síntese de duas isoformas do receptor de insulina INSRa e INSRb (contém o éxon 11). 
O INSRb apresenta afinidade reduzida para os fatores de crescimento semelhantes à insulina I (IGF-I) e II (IGF-II) e uma afinidade discretamente diminuída para a insulina. A ativação das duas isoformas de receptores induz captação de glicose e proliferação celular; a isoforma INSRa, entretanto, responde de forma igual ou até melhor que a isoformas INSRb.
Há diferenças na sinalização insulínica que são isoformas específicas, por exemplo, nas células  pancreáticas, a insulina é mais eficiente na estimulação da expressão da insulina quando a sinalização ocorre cia INSRa. 
Além disso, pode haver a montagem pós-traducional de híbridos entre as isoformas INSRa e INSRb e o receptor do IGF-I (IGF-IR), que é um receptor homólogo ao INSR. Essas montagens alternativas do INSR podem modificar o padrão de crescimento fetal e contribuir para algumas formas raras de resistência à insulina no adulto. 
A insulina liga-se a regiões específicas da subunidade , e a rápida alteração conformacional no receptor leva à auto-fosforilação de resíduos de tirosina da região intracelular das subunidades  por mecanismo de transfosforilação. A autofosforilação resulta na ativação da atividade tirosina quinase do receptor. No estado inativo, o sítio catalítico da tirosina quinase é ocluído pelo laço de ativação (activation-loop) que previne o acesso do trifosfato de adenosina (ATP) e de vários substratos. 
A auto-fosforilação dos resíduos de tirosina das posições 1.158, 1.162 e 1.163 no laço de ativação causa alterações conformacional, permitindo que o ATP e outros substratos alcancem o sítio catalítico da subunidade  do receptor. As quinases do INSR ativado fosforilam proteínas de substrato 1 a 4 nos resíduos tirosina que servem como na coragem para outros efetores subjacentes na cascata de ativação insulínica. 
· A divergente sinalização insulínica: A divergência da sinalização insulínica torna-se evidente a partir da ativação dos receptores de insulina (INSR). Os efetores subjacentes aos receptores de insulina incluem as proteínas GAB1, Shc, APS, p60DOK e c-Cbl. Cada um desses substratos recruta diferentes grupos de outras proteínas sinalizadoras contendo domínios src homology 2 (SH2), que interagem especificamente com seqüências adjacentes às fosfotirosina. Além disso, cada um desses substratos pode ser compartimentalizado em diferentes locais da célula devido a seqüências que orientam sua interação com proteínas e lipídios. 
A importância dessa complexidade sobre o metabolismo, o crescimento e a sobrevida carece de complexo esclarecimento. A evidência sobre a necessidade de um substrato para a tirosina quinase do receptor de insulina (INSR) adveio dos estudos de imunoprecipitação com anticorpos antifosfotirosinas em células de hepatoma que identificaram uma fosfotirosina de 185 kDa. Sua clonagem mostrou uma proteína estrutural de sinalização insulínica e o primeiro substrato de insulina (ISR1). Toda ou quase toda a sinalização insulínica é produzida e/ ou modulada pela fosforilação em tirosina do ISR1, de seu homólogo ISR2 e de outras proteínas como ISR3, ISR4, Shc, Cbl, APS, SH2B, GAB1, GAB2, DOCK1 e DOCK2, cujos papeis foram, de certa forma, caracterizados pelo estudo com animais transgênicos. Enquanto o ISR1 controla o crescimento corporal e a ação periférica da insulina, o ISR2 regula ocrescimento neural, o peso corporal, a homeostase da glicose e a fertilidade da fêmea. Por outro lado, outras evidências sobre o papel dessas proteínas surgiram com os experimentos em camundongos knoch-out (KO) para proteína IRS1. Apesar de apresentarem resistência à insulina, esses animais não desenvolvem diabetes mellitus, a menos que sejam cruzados com outro camundongo knoch-out (KO) para uma outra proteína se sinalização. 
Os animais knoch-out (KO) heterozigotos com deleção hemialélica para ISR1 e ISR2 exibem tanto intolerância à glicose como diabetes mellitus resultante de um defeito na secreção e na sensibilidade à insulina, presumivelmente devido à diminuição da proliferação da célula  diante do aumento da demanda por insulina.
As moléculas diretamente envolvidas com o INSR, como Sch, IRS1 a 4 e GAB1 proporcionam ancoragem para outros substratos subjacentes. Os IRSs apresentam um domínio aminoterminal conservado, homólogo à plesctrina [pleckstrein homology (PH)], que serve para fixar os ISRs na proximidade do INSR. As proteínas IRSs contêm um domínio ligador der fosfotirosina (PTB) na região carboxiterminal do domínio PH. O domínio PTB, presente em inúmeras outras proteínas sinalizadoras, confere cerca de 75% de identidade entre o IRS1 e o IRS2 e funciona como sítio de ligação ao motivo NPXY [Asn-Pro-Xaa-Try (Pi)], em Xaa é qualquer aminoácido e Pi é fosfato inorgânico). 
A região carboxiterminal dos IRSs é pouco conservadora e, sem qualquer atividade catalítica contém inúmeros motivos de fosforilação em tirosina e serina, que servem como ancoragem para proteínas com domínio SH2, tais como subunidade reguladora p85 da PI3K, receptor do fator de crescimento ligador de proteína 2 [grow factor receptor bound protein 2 (GRB2)], Nck, Crk, Fyn, SHP-2, etc. todas envolvidas na intermediação das funções metabólicas e mitogênicas da insulina. 
A enzima PI3K, ativada durante sua associação com os IRSs, converte um fosfolipídio inositol em P1 (4,5) P2 em PI(3,4,5) P3 na membrana plasmática, que recruta a proteinoquinase B (PKB) e a proteinoquinase 1 dependente de 3-fosfoinositídio (PDK1) para a membrana plasmática. A PKB fosforila inúmeros substratos, incluindo BAD (BCL2- antagonist of celll death), que é importante para a sobrevida celular; GSK3 (glycogen synthase kinase 3), que está envolvido no metabolismo energético e no desenvolvimento neuronal; e FOXO1 (forkhead box O1A), que estaria envolvido no desenvolvimento e crescimento mitogênicos. 
· Vias MAPK e PI3K: A sinalização insulínica envolve duas vias principais, a proteinoquinase ativada por mitógenos (MAPK) e a PI3K que, embora descritas como vias independentes, podem, em certas circunstâncias, ativar-se mutuamente. Assim a Akt pode ativar a Raf quinase e, inversamente, a proteínas Ras ativar a PI3K.
A via MAPK é ativada pela ligação do GRB2 ao IRS ou Shc fosforiladas em tirosina por meio de seus domínios SH2. O GRB2 está ligado ao mammalian son of sevenless (mSOS), uma proteína de intercâmbio que catalisa a conversão de difosfato de guanosina (GDP) em trifostafo de guanosina (GTP) na proteína Ras, ativando-a. A forma prenilada de Ras liga-se ao folheto interno da membrana plasmática e, quando ativada, liga-se à região aminoterminal da Raf, recrutando-a para a membrana plasmática. A interação Ras-Raf, deslocando proteínas ligadas à Raf proporciona a fosforilação de Raf por inúmeras serina e tirosina quinases, ativando a Raf quinase. A Raf1 ativa a quinase de dupla especificidade, MEK1, fosforilando dois resíduos de serina regulatórios.
Por sua vez, a MEK1 ativa as quinases reguladoras de sinais extracelulares [extracelular signal-regulated kinase 1 e 2 (ERK1 e 2)] pela fosforilação de resíduos de tirosina e treonina regulatórios. As ERKs intermedeiam os efeitos promotores do crescimento da insulina pela fosforilação de fatores de transcrição, incluindo a proteína Elk1, que ativa outros genes.
 
 
· Via dos transportadores de glicose – Tecidos dependentes e independentes de insulina: 
· Transporte de glicose: O transporte de glicose é fundamental para o metabolismo energético celular. A rota glicolítica é empregada por todos os tecidos para degradação de glicose e fornecimento de energia (na forma de ATP) e intermediários para outras rotas metabólicas. A glicose não pode difundir-se através dos poros da membrana, visto que seu peso molecular é de 180, e o máximo das partículas permeáveis é cerca de 100. Existem dois mecanismos de transporte de glicose através da membrana celular: transporte facilitado, mediado por transportadores de membrana específicos (GLUT) e o co-transporte com o íon Sódio (SGLT). Os transportadores de glicose mostram homologia significativa em sua sequência primária, mas apresentam um padrão de expressão com especificidade tecidual. O peso molecular das moléculas carreadoras é de aproximadamente 45.000, podem transportar outros monossacarídeos, com estruturas semelhantes à da glicose, incluindo, especialmente a galactose. 
· Co-transporte de glicose juntamente com íons sódio SGLT: A glicose é transportada para dentro da maioria das células contra um grande gradiente de concentração. O mecanismo de co-transporte está presente na parte apical da célula intestinal e túbulo proximal renal. Tem a função de captar a glicose da dieta para levar à corrente sanguínea e prevenir da perda urinária da glicose. Este transporte é independente da influência da insulina, processo que é mediado por um transportador, no qual o movimento da glicose é acoplado ao gradiente de concentração do sódio, que é transportado para o interior da célula ao mesmo tempo. A proteína carreadora responsável pelo transporte tem dois locais de fixação em seu lado externo, um para o sódio e outro para glicose. Além disso, a concentração dos íons sódio é muito alta no exterior e muito baixa no interior, o que proporciona a energia para o transporte (proveniente do gradiente de concentração do sódio). O gradiente de concentração do íon sódio é mantido pela Na/K ATPase. Uma propriedade especial da proteína responsável pelo transporte é a mudança de conformação que permite a movimentação do sódio para o interior, somente após a fixação de uma molécula de glicose, após a fixação de ambas, a alteração conformacional ocorre automaticamente, e o sódio e a glicose são transportados para o interior da célula ao mesmo tempo. Há dois tipos de transportadores SGLT. A absorção intestinal de glicose é mediada pela SGLT1 onde há o co-transporte de um íon sódio para uma molécula de glicose, esse transportador tem alta afinidade pela glicose, mas baixa capacidade. A reabsorção renal de glicose é feita pela SGLT1 e SGLT2 esta última possui baixa afinidade pela molécula de glicose, porem e alta capacidade, realizando o co-transporte de dois íons sódio para cada molécula de glicose. Defeitos em SGLT1 ocorrem pró-expressão de um gene autossômico recessivo, causando diarreia, desidratação, glicosuria pediátrica. O tratamento é feito com a substituição de glicose por frutose e galactose na dieta, sendo os sinais clínicos minimizados. Os pacientes acometidos têm perda de peso e atraso no seu desenvolvimento na fase inicial da vida. Problemas no correto funcionamento do SGLT2 gera glicosuria, não apresentando hiperglicemia, sua origem genética não foi elucidada.
· Difusão facilitada: Em todas as células a glicose é transportada através de transportadores, de uma área de maior concentração para uma de menor, por difusão facilitada (exceção feita a célula intestinal e túbulo renal) que é possível devida as propriedades especiais de ligação da proteína transportadora de glicose (GLUT) da membrana. A velocidade de transporte da glicose, bem como de alguns outros monossacarídeos, é acentuadamente aumentada pela insulina. Quando o pâncreas secreta grande quantidade de insulina a velocidade de transporte é aumentada em 10 a 20 vezes, em relação à velocidade observada na ausência da secreção de insulina A quantidade de glicose passível de se difundirpara o interior da maioria das células, na ausência de insulina, a exceção dos hepatócitos e neurônios, é insuficiente para o metabolismo energético. Logo, nestas células o transporte de glicose não é dependente da insulina.
· Transportadores de glicose GLUT: A expressão dos transportadores de glicose nos tecidos está ligada aos diferentes metabolismos destes, conforme a demanda e utilização a quantidade de transportadores pode variar. Cada grupo de transportadores possui propriedades cinéticas únicas, caracterizando suas funções e sua distribuição por diferentes tecidos. A maioria das células expressa um número diferente de GLUTs em proporções distintas. Com os recentes e constantes avanços na biologia molecular, são descobertas, ou desvendadas novas moléculas. Atualmente é proposta a presença de doze tipos de transportadores de glicose, até pouco tempo essa família era composta apenas de cinco tipos.
· Transportadores de glicose GLUT1: Os transportadores de glicose tipo 1 estão amplamente difundidos por todo o corpo, sendo responsáveis pelo nível basal de glicose celular. Largamente difusos nos tecidos fetais, tendo diminuída sua expressão nos tecidos adultos. Possuem alta capacidade de transporte e alta afinidade pela molécula de glicose, mantendo rapidamente o nível de glicose dentro da célula. Não tem atividade alterada pela presença da insulina. 
· Transportadores de glicose GLUT1-3: Os transportadores GLUT1 e 3 são considerados responsáveis pelo transporte de glicose ao cérebro. Como o transporte mínimo de glicose deve ser mantido a este órgão, seus transportadores de glicose são independentes de insulina. O GLUT1 é expresso nas células endoteliais, sendo responsável pelo transporte de glicose através da barreira hemato-encefálica. Já o transportador GLUT3 proporciona o transporte da glicose do astrócito ao neurônio. Expressão de GLUT1 relaciona-se com o crescimento do cérebro, sendo este transportador mais abundante na infância e fase de desenvolvimento, já o GLUT3 está associado à maturação funcional, quanto mais maduro e evoluído maior a expressão deste transportador. Em situações frequentes de hipoglicemia há um aumento na expressão de GLUT1 para maior captação de glicose. A hipóxia e/ou isquemia com morte celular e consequente baixa de GLUT3 gera um incremento na expressão de GLUT1 nas proximidades à área afetada. Na doença de Alzheimer ocorre uma redução nos transportadores tipo 1 e 3, principalmente nos lobos parietais e temporais.
· Transportadores de glicose GLUT2: O transportador de glicose tipo 2 possui a maior cinética entre os GLUT, está presente nos hepatócitos, células β pancreáticas, mucosa intestinal e rins. A alta afinidade do transportador com a glicose promove que o transporte a essas células seja proporcional à glicemia. Este transportador, por suas funções, não tem sua atividade modulada pela insulina. Na célula intestinal após a absorção e reabsorção de glicose no rim é via GLUT2 que a molécula de glicose entra na circulação. Toda variação de glicemia é detectada pelas células β, iniciando automaticamente o controle da secreção de insulina e captação ou liberação de glicose hepática. Alterações na expressão de GLUT2 está associada a um defeito de estimulação da insulina em diabéticos, o que não permite a baixa na glicemia. Há variações na expressão em células β pancreáticas desses transportadores, o que explicaria em parte a baixa ou nenhuma liberação de insulina nos diabéticos com a doença tipo I. Expressão de GLUT2 é estimulada pela hiperglicemia, dietas ricas em carboidratos e suprimida pela hiperinsulinemia. Defeitos no GLUT2 resulta na Síndrome Fanconi-Bickel doença caracterizada por: raquitismo, acúmulo glicogênio hepático, glicosuria, perda de aminoácidos e acidose renal, síndrome descrita em humanos.
· Transportadores de glicose GLUT4: Os GLUT4 são os transportadores insulina-dependente, mais abundante nas membranas celulares do músculo esquelético, cardíaco e tecido adiposo. No fígado: a insulina inibe glicogenólise e gliconeogênese e estimula síntese de glicogênio, na musculatura esquelética estimula a: captação de glicose e síntese de glicogênio, no tecido adiposo estimula a captação de glicose e redução da liberação de ácidos graxos e síntese de triglicerídeos. Também estimula a entrada de aminoácidos nas células para promover a síntese proteica. O transportador possui a menor cinética da família dos GLUT, mas grande afinidade. Sem estimulação a densidade do GLUT4 na membrana é extremamente baixa, estando presente em vesículas citoplasmáticas, a quantidade de vesículas é variável pela atividade do tecido. Após a estimulação pela insulina, esses transportadores são translocados para a membrana e o transporte de glicose é aumentado. A contração muscular aumenta a taxa de transcrição e translocação do GLUT4 este processo é mediado pelo AMP, formado em grande quantidade durante o esforço da musculatura. Como são vários fatores envolvidos, não unicamente a presença ou não do receptor ou transportador, não há uma correlação simples entre resistência à insulina e os GLUT4, qualquer defeito na rota de translocação das vesículas determina a resistência ao estimulo da insulina, tornando assim o indivíduo um diabético tipo II. O mecanismo de fusão vesicular está envolvido na resistência à insulina. Exercício extenuante provoca lesão celular, o que leva a inflamação tecidual, e resistência à insulina, esse processo é mediado pelo fator de necrose tumoral (TNF-α) e demais substancias do processo inflamatório, que diminuem a densidade dos GLUT na membrana e torna o músculo mais resistente à captação de glicose. Em animais diabéticos o nível de GLUT4, tanto nos adipócitos e células musculares cardíacas e esqueléticas, esta diminuído. Essa citação reflete a decisão de iniciar um programa de exercícios leves em indivíduos diabéticos, sem contanto promover uma agressão aos tecidos musculares. Dietas ricas em gordura diminuem os níveis de GLUT4 nos adipócitos e músculos. Sendo assim a dieta um fator determinante para o tratamento de pacientes diabéticos. Não há relatos de identificação de defeitos em GLUT4, ratos “knock-out” GLUT4, onde esse gene foi suprimido, os animais são menores, apresentando cardiomegalia, e não possuem tecido adiposo. Porém, não desenvolvem diabetes, mas evidenciam resistência à insulina, que a longo prazo leva a uma diabetes tipo II. Experimentos feitos com ratos “overexpressing” GLUT4 que apresentaram baixo nível de glicose sanguínea, e marcado aumento na sensibilidade à insulina com grande mobilização ácidos graxos ao tecido adiposo. Isso demonstra uma potencial terapia ao diabetes, que deve ser objetivo de maiores estudos, pois mais de 80% dos pacientes com diabetes tipo II são obesos, sendo resistentes à insulina.
· Outros transportadores de glicose GLUT: Com os avanços na biologia molecular, atualmente são propostos outros componentes da família dos transportadores de glicose, como serão brevemente descritas a seguir. O transportador GLUT5 já havia sido descrito há algum tempo, sendo uma proteína transportadora de frutose, com pequena ou nenhuma afinidade pela glicose. Dois genes codificantes, denominados por alguns autores como pseudogenes não funcionais são responsáveis pela expressão dos GLUT6, possivelmente encontrados nos leucócitos. Sugerido como transportador no reticulo endotelial dos hepatócitos o GLUT7 não é caracterizado e reconhecido por parte da literatura. As mais novas proteínas descritas são os GLUT9 presentes no fígado e rins, o GLUT11 presente no coração e músculo esquelético, GLUT8 expresso nos blastocistos, e o GLUT10 no fígado e pâncreas. Todas estas moléculas foram descritas, porem suas reais funções, se é que serão relevantes devem ser esclarecidas com maiores pesquisas.
· GLUT e neoplasias: Alguns tipos de neoplasias apresentam em suas membranas transportadores de glicose não expressos no tecido saudável, estando ligada a expressão de alguns tipos de transportadores ao grau de malignidade das tumorações. Células malignaspossuem maior expressão de GLUT1 e 3, quanto maior a expressão dessas estruturas, mais sombrio o prognóstico. A expressão de GLUT1 está relacionada ao potencial maligno de neoplasias mamárias, tumores hepáticos, pancreático, esofagiano, cerebral, renal, ovariano e cutâneo. Já a presença elevada de GLUT3 em neoplasias gástricas, ovariana e pulmonar, revela um prognostico desfavorável e alto nível de atividade, mas estes transportador não é comum nesses órgãos quando estes são sadios. Os transportadores GLUT5 presente tumores mamários, também não é encontrado neste tecido normal. Recentemente descoberto o GLUT12 está expresso em células prostáticas e mamárias neoplásicas, e em adultos na musculatura cardíaca, esquelética e tecido adiposo normal. Tumores de ovário, com maior produção de estradiol, podem estimular a expressão de GLUT no tecido neoplásico e piorar o prognóstico. A hipóxia tecidual estimula a expressão dos GLUT nos tumores, o que aumenta o aporte de glicose e debilita mais o quadro geral do paciente.