Apostila_enzimas_ja_si

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA 
 
 
 
 
 
JANAINA DUARTE BAUMER 
 
SIANNAH MARIA MAS DIEGO 
 
 
ESTÁGIO EM DOCÊNCIA 
 
 
PROF. AGENOR FURIGO JR. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Florianópolis 
2008 
 
SUMARIO 
 
1.Introdução .............................................................................................................................3 
2. Histórico ..............................................................................................................................3 
3. Propriedades Gerais ..........................................................................................................4 
3.1 A maioria das enzimas são proteínas ...........................................................................5 
3.2 Diferenças entre enzimas e catalisadores químicos .................................................5 
3.3 Nomenclatura das enzimas ............................................................................................6 
3.4 Especificidade ..................................................................................................................8 
3.5 Mecanismo de ação de uma enzima ............................................................................9 
4. Reações Catalisadas por Enzimas............................................................................... 10 
5. Fatores que Influenciam a Ação Enzimática ................................................................ 12 
5.1 pH..................................................................................................................................... 12 
5.2 Temperatura ................................................................................................................... 12 
5. 3 Concentração da Enzima ........................................................................................... 13 
5.4 Concentração do Substrato ......................................................................................... 13 
6. Inibição enzimática .......................................................................................................... 14 
6.1Inibição Reversível ......................................................................................................... 15 
6.2 Inibição Reversível Competitiva .................................................................................. 16 
6.3 Inibição Reversíve l Não Competitiva ......................................................................... 15 
6.4 Inibição Irreversível ....................................................................................................... 16 
7. Co-fatores e Coenzimas................................................................................................. 17 
7.1 As coenzimas devem ser regenaradas ..................................................................... 17 
8. Regulação da Atividade Enzimática ............................................................................. 17 
9. Medida de atividade enzimática.................................................................................... 18 
10. Produção industrial de enzimas .................................................................................. 19 
11. Referencias Bibliográficas ........................................................................................... 23 
 
 
 
 
 
 
 
1. Introdução 
 
Os sistemas vivos são formados por uma enorme variedade de reações 
bioquímicas, e quase todas elas são mediadas por uma série de 
extraordinários catalisadores biológicos conhecidos como enzimas. A função 
da enzima é viabilizar a atividade das células, quebrando moléculas ou 
juntando-as para formar novos compostos. 
As enzimas são proteínas (com exceção de um pequeno grupo de moléculas 
de RNA) especializadas em catalisar reações biológicas, ou seja, aumentam a 
velocidade de uma reação química sem interferir no processo. Elas estão 
associadas a biomoléculas, devido as sua extraordinária especificidade e poder 
catalítico. 
 
2. Histórico 
 
A atividade catalítica de enzimas tem sido utilizada pelo homem há 
milhares de anos, em processos tais como fermentação do suco de uva para 
obtenção do vinho, fabricação de queijo e pão. No entanto, estas eram apenas 
aplicações práticas, uma vez que o conhecimento do modo de ação dos 
catalisadores biológicos só recentemente foi elucidado. 
- 1833 - A primeira hidrólise enzimática do amido 
Os cientistas franceses Payen e Persoz isolaram um complexo 
enzimático do malte que catalisava a transformação do amido em glicose, 
denominando-o "diastase" do grego "separar") porque separava os blocos de 
amido em unidades individuais de glicose. É a primeira vez que foi isolado uma 
enzima, um composto orgânico que apresentava as propriedades de um 
catalisador. O sufixo ase de diastase passou a ser usado para designar as 
enzimas. 
- 1835 - o químico sueco Berzelius descreveu a primeira hidrólise enzimática 
do amido. 
O sueco Jons Jacob Berzelius demonstrou que o amido pode ser mais 
eficientemente decomposto usando-se extrato de malte preferencialmente ao 
ácido sulfúrico e cunhou o termo catálise, foi o primeiro a notar que certas 
substâncias aceleram uma reação. 
- 1836 - Theodor Schwann descobre a enzima digestiva Pepsina 
- 1860 - Debate: Qual é o papel da levedura no processo de fermentação? 
Pasteur, em 1860, demonstrou através de uma série de experimentos 
que a fermentação alcoólica só ocorria em presença de células vivas de 
levedura. Na mesma época, Liebig defendia que os processos fermentativos 
eram reações químicas. 
1897 - A polêmica foi resolvida. Os irmãos Buchner demonstraram que 
um extrato de levedura livre de era capaz de fermentar o açúcar do mesmo 
modo que a célula de levedura. Isto significava que o extrato continha 
catalisadores da fermentação alcoólica, o que tornava possível estudar “in 
vitro” reações químicas da fermentação. 
- 1878 - William Kuhne propôs que o nome enzima fosse utilizado, a palavra 
em si significa 'na levedura'. 
- 1894 - Primeira produção comercial de alimentos com enzimas. Nos EUA, o 
bioquímico e líder industrial japonês Dr. Jokichi Takamine começou a produção 
comercial de koji a partir do fungo Aspergillus. 
- 1894 - Cientistas definem a teoria Fechadura e Chave 
- 1913 - Michaelis e Lyn descreveu cinética enzimática matematicamente. 
- 1914 - É lançado o primeiro detergente compacto 
- 1926 - Cientistas descobrem que as enzimas são proteínas 
- 1926 – James Summer’s isolou e cristalizou a primeira enzima, a urease. 
- A partir 1960 - A evolução no estudo das enzimas, acompanhado por 
avanços tecnológicos, possibilitou o isolamento e a identificação de 
propriedades das enzimas. Desde então, vem sendo feita a caracterização e o 
estudo cinético de milhares de enzimas de diferentes fontes: animais, vegetais 
e de microrganismos. 
- 1986 - A primeira enzima a partir de organismo geneticamente modificado 
(OGM). 
 
3. Propriedades Gerais 
 
 
 
3.1 A maioria das enzimas são proteínas 
 
 Com exceção de um pequeno grupo de moléculas de RNA que 
apresentam atividade catalítica, todas as enzimas são proteínas. 
 Proteínas são moléculas compostas por aminoácidos, unidos por 
ligações peptídicas. Os aminoácidos apresentam em sua fórmula química um 
grupo carboxílico (-COOH), um grupo amino (-NH2) e um radical R. Os 
aminoácidos são diferenciados de acordo com o grupo R ligado ao carbono 
assimétrico. Na natureza, são encontrados 20 aminoácidos. 
A atividade catalítica das proteínas depende da integridade da sua 
conformação protéica nativa. Se uma enzima é desnaturada ou dissociada em 
subunidades, a atividade catalítica geralmente é destruída. Se uma enzima é 
quebrada em seus aminoácidos constituintes, a sua atividade catalítica é 
sempre destruída. Assim, a estrutura protéica primária,secundária, terciária e 
quaternária das enzimas são essenciais para sua atividade catalítica. 
 As enzimas como outras proteínas tem pesos moleculares que variam 
de cerca de 12.000 até mais de 1 mi lhão. 
 
3.2 Diferenças entre enzimas e catalisadores químicos 
 
 As enzimas diferem-se dos catalisadores químicos comuns em vários 
aspectos: 
- Velocidade de reação mais rápida: as velocidades de reações catalisadas por 
enzimas são tipicamente 106 a 1012 vezes maiores do que as reações 
correspondentes não catalisadas, e são no mínimo, varias ordens de 
magnitude maiores do que as mesmas reações catalisadas quimicamente. 
- Condições reacionais mais brandas: as reações catalizadas enzimaticamente 
ocorrem em condições brandas: temperaturas inferiores a 100º C, pressão 
atmosférica e pH quase neutro. Em contraste, geralmente uma catálise química 
eficiente requer temperaturas e pressão elevadas, assim como pH extremos. 
- Maior especificidade da reação: as enzimas apresentam um grau de 
especificidade imensamente maior do que os catalisadores químicos em 
relação a identidade dos seus substratos e dos seus produtos; isto é, as 
reações enzimáticas raramente produzem subprodutos. Diante de várias rotas 
potencialmente possíveis, a enzima escolhe a com menor energia livre de 
ativação. 
- Capacidade de regulação: as atividades catalíticas de muitas enzimas variam 
em resposta às concentrações de outras substancias que não os seus 
substratos. Os mecanismos desses processos regula tórios incluem o controle 
alostérico, a modificação covalente de enzimas e a variação nas quantidades 
de enzimas sintetizadas. Permite o ajuste fino do metabolismo em diferentes 
condições fisiológicas. 
 
3.3 Nomenclatura das enzimas 
 
 As enzimas são comumente denominadas adicionando-se o sufixo –ase 
ao nome do substrato da enzima ou a uma expressão que descreva a sua ação 
catalítica. Desse modo a uréase catalisa a hidrolise da uréia, e a álcool-
desidrogenase catalisa a oxidação de alcoóis em seus aldeídos 
correspondentes. Entretanto, o fato de no inicio não haver regras para a 
nomenclatura das enzimas acabou gerando confusões, resultando na utilização 
de dois nomes diferentes para uma mesma enzima, ou ainda, a utilização do 
mesmo nome para duas enzimas diferentes. Além disso, muitas enzimas, como 
a catalase (que intermedeia a dismutacao de H2O2 em H2O e O2) tinham 
nomes que não ofereciam qualquer indicação da sua função. Em esforço para 
eliminar tal confusão e providenciar regras para a denominação racional do 
crescente numero de enzimas descobertas, um esquema de classificação 
funcional sistemática e de nomenclatura de enzimas foi adotado pela 
International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 
 As enzimas são classificadas de acordo com a natureza da reação 
química que catalisam. Há seis classes principais de reações enzimáticas, 
assim como subclasses e sub-subclasses. Para cada enzima são atribuídos 
dois nomes e um numero de classifição de quatro subdivisões. O nome 
alternativo é conveniente para o uso rotineiro e é, em geral, um nome trivial 
utilizado anteriormente. O nome sistemático é utilizado para minimizar 
ambiquidades; é o nome do(s) seu(s) substrato(s) seguido por uma palavra 
terminada em –ase que especifica o tipo de reação que, de acordo com seu 
grupo de classificação principal, a enzima cataliza. Por exemplo a enzima cujo 
nome recomendado é carboxipeptidase A possui nome sistemático peptidil-L-
aminoácido-hidrolase e número de classificação EC 3.4.17.1 (EC é a 
abreviatura de Enzyme Comission). 
 
Classificação das Enzimas Segundo a Comissão de Enzimas 
1. Oxido-redutases (reações de oxidação-redução ou transferência de 
elétrons – Desidrogenases e Oxidases) 
 1.1.atuando em CH-OH 
 1.2.atuando em C=O 
 1.3.atuando em C=O- 
 1.4.atuando em CH-NH2 
 1.5.atuando em CH-NH- 
 1.6.atuando em NADH, NADPH 
2.Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, 
carboxil – Quinases e Transaminases) 
 2.1.grupos com um carbono 
 2.2.grupos aldeído ou cetona 
 2.3.grupos acil 
 2.4.grupos glicosil 
 2.7.grupos fosfatos 
 2.8.grupos contendo enxôfre 
3.Hidrolases (reações de hidrólise de ligação covalente - Peptidases) 
 3.1.ésteres 
 3.2.ligações glicosídicas 
 3.4.ligações peptídicas 
 3.5.outras ligações C-N 
 3.6.anidridos ácidos 
4.Liases (catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de 
moléculas de água, amônia e gás carbônico – Dehidratases e 
Descarboxilases) 
 4.1. =C=C= 
 4.2. =C=O 
 4.3. =C=N- 
5.Isomerases (reações de interconversão entre isômeros óticos ou 
geométricos - Epimerases) 
 5.1.racemases 
6.Ligases (catalisam reações de formação de novas moléculas a partir 
da ligação entre duas pré-existentes, sempre às custas de energia - 
Sintetases) 
 6.1. C-O 
 6.2. C-S 
 6.3. C-N 
 6.4. C-C 
 
 
 
3.4 Especificidade 
 
Existe uma correlação entre a estrutura das proteínas ou peptídeos que 
fazem parte da molécula enzimática e suas propriedades biológicas, e esta 
propriedade leva a uma especificidade extraordinariamente alta e reproduzível. 
Provavelmente apenas uma fração da molécula, denominada sítio ativo, é a 
responsável pela ligação da enzima ao substrato ou substratos, e essa fração 
determinaria a especificidade enzimática. 
A especificidade das enzimas varia muito de uma enzima para outra, 
sendo muito baixa para algumas enzimas e muito alta para outras. É chamada 
especificidade baixa, quando esta relação existe apenas em relação a tipos de 
ligação, como certas peptidases (ligações peptídicas), fosfatases (ligações 
fosfato-éster) e estearases (ligações carboxi-éster, podendo-se citar a lipase 
que hidrolisa as ligações ácido-álcool de quase todos os ésteres orgânicos). A 
especificidade baixa é mais comumente encontrada em enzimas degradativas, 
mas é raramente encontrada em enzimas biosintéticas. Um conjunto 
intermediário de enzimas apresenta especificidade de grupo, como as 
hexoquinases, que catalisam a fosforilação de uma variedade de açúcares 
contanto que sejam aldohexoses. A especificidade absoluta, é o tipo de 
especificidade exclusiva, isto é, quando uma enzima atua somente sobre um 
determinado composto, como a urease que hidrolisa a uréia, mas nenhum de 
seus derivados, ou a tripsina, que hidrolisa apenas ligações peptídicas 
formadas por grupos carboxílicos dos aminoácidos básicos. Esta enzima é de 
importância extraordinária na determinação da seqüência de aminoácidos em 
proteínas. 
Outro aspecto importante da especificidade das enzimas é a sua 
estereo- especificidade com relação ao substrato. Uma enzima pode ter uma 
especificidade ótica em relação aos isômeros D e L dos aminoácidos. A 
maioria das enzimas hidrolisa apenas ligações peptídicas de L-aminoácidos, o 
que deveria ser esperado, já que as proteínas enzimáticas são constituídas 
por L-aminoácidos e tem conformações determinadas. 
As forças não covalentes por meio das quais substratos e outras moléculas se 
ligam as enzimas são similares em caráter às forcas que regem a conformação 
das próprias proteínas. Ambas envolvem forças de Van der Waals, interações 
eletrostáticas, pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas 
 Em geral, o sitio de ligação do substrato consiste de um entalhe ou 
sulco na superfície de uma enzima, complementar ao formato dos substratos 
(complementaridade geométrica). Além disso, os resíduos de aminoácidos que 
formam o sitio de ligação estão organizados de modo a formar interações de 
atração especificamente com os substratos (complementaridade eletrônica). As 
moléculas que se diferem do substrato no formato ou na distribuição de grupos 
funcionais não podem ligar-se produtivamente à enzima. 
 
3.5 Mecanismo de ação de uma enzima 
 
A reação enzimática ocorre em duas etapas: 
(1) S + E ES* (etapa reversível) 
(2) ES E + P (etapa irreversível) 
 * complexo enzima-substratoAlguns modelos foram propostos para explicar o tipo de ligação 
estabelecida entre enzima e substrato. Emil Fischer desenvolveu no século 
passado o conceito de especificidade enzimática, estabelecendo que existe 
uma relação estérica entre enzima e substrato. Em 1894 enunciou a sua teoria 
na qual a especificidade enzimática é comparada a um conjunto de chave e 
fechadura onde a chave, neste caso o substrato, deve se ajustar à fechadura, 
neste caso a enzima (figura 1). Assim, cada enzima agiria sobre um número 
muito limitado de compostos. 
 
 
Figura 1: Representação esquemática do modelo proposto por Fischer 
 
 
 
Figura 2: Representação esquemática do modelo do encaixe induzido de 
Koshland. 
 
 A hipótese de Koshland, mais moderna, da “enzima flexível” ou do 
“encaixe induzido” considera que o sítio ativo não precisa preexistir sob uma 
forma geométrica rígida, devendo contudo existir um arranjo espacial preciso e 
específico dos grupamentos R (cadeia lateral) dos aminoácidos, arranjo esse 
que é induzido pelo contato com o substrato (figura 2). 
Estudos por raio X indicam que os sítios de ligação aos substratos da 
maioria das enzimas são, em grande parte, pré-formados, mas sofrem 
mudanças conformacionais no momento da ligação do substrato (um fenômeno 
denominado ajuste induzido). 
 
4. Reações Catalisadas por Enzimas 
 
Para reagir, as moléculas presentes em uma solução devem colidir com 
orientação apropriada e com a quantidade de energia que lhes permitam 
formar o complexo ativado, denominado estado de transição que representa 
os reagentes em seu estado ati vado. Para atingir o estado de transição, 
necessita-se de uma quantidade de energia definida como energia de ativação 
(E a) ou mais comum em bioquímica energia livre de ativação, ?G+ (o 
símbolo (+ ) indica o processo de ativação). Sob condições fisiológicas, a 
velocidade das reações pode ser aumentada pela redução da energia livre de 
ativação conseguida pela ação de enzimas. 
A comparação do perfil energético das reações catalisadas e não- 
catalisadas é mostrada na Figura 3 para a reação: 
 A + B ? C + D 
No gráfico, o estado de transição corresponde ao ponto de mais alta 
energia da reação não-catalisada e é a medida da energia livre de ativação, 
?G+ . Ou ainda, ?G+ é a energia livre do estado de transição subtraída da 
energia livre dos reagentes. No complexo ativado (estado de transição do 
sistema), os reagentes estão em forma intermediária de alta energia e não 
podem ser identificados nem como reagentes nem como produtos. O 
complexo do estado de transição pode ser decomposto em produtos ou voltar 
aos reagentes. 
 
Figura 3: diagrama energético de reação catalisada e de reação não catalisada 
?G+ = energia livre de ativação. ?G0 = variação de energia livre. A diferença 
entre os valores da energia de ativação de uma reação catalisada e de uma 
reação não-catalisada, indica a eficiência do catalisador. 
 
A velocidade de uma reação é inversamente proporcional ao valor de 
sua energia livre de ativação. Quanto maior o valor de ?G+ , menor será a 
velocidade da reação. Os catalisadores aumentam a velocidade da reação 
reduzindo a energia livre de ativação. A velocidade de uma reação pode 
aumentar na ordem de 106 a 1012 vezes mais do que a reação correspondente 
não-catalisada. 
Embora a enzima participe da seqüência da reação, ela não sofre 
nenhuma transformação. Sendo assim, apenas poucas moléculas de E são 
capazes de catalisar a conversão de milhares de moléculas de S a P. 
 Um catalisador é uma substância que acelera uma reação química, até 
torná-la instantânea ou quase instantânea, ao diminuir a energia de ativação. 
Como catalisadores, as enzimas atuam em pequena quantidade e se 
recuperam indefinidamente sem serem consumidas. Não levam a cabo 
reações que sejam energeticamente desfavoráveis, não afetam o ?G (energia 
livre de Gibbs) e não modificam o sentido dos equilíbrios químicos. 
 
5. Fatores que Influenciam a Ação Enzimática 
 
5.1 pH 
 
Ao comprovar experimentalmente a influência do pH na velocidade das 
reações enzimáticas se obtém curvas que indicam que as enzimas 
apresentam um pH ótimo de atividade. O pH pode afetar de várias maneiras: 
 - O sítio ativo pode conter aminoácidos com grupos ionizados que podem 
variar com o pH. 
- A ionização de aminoácidos que não estão no sítio ativo pode provocar 
modificações na conformação da enzima. 
 - O substrato pode ver-se afetado pelas variações do pH. 
As enzimas possuem grupos químicos ionizáveis (carboxilas –COOH; 
amino – NH2; tiol –SH; imidazol, etc) nas cadeias laterais de seus 
aminoácidos. Segundo o pH do meio, estes grupos podem ter carga elétrica 
positiva, negativa ou neutra. Como a conformação das proteínas depende, em 
parte, de suas cargas elétricas, haverá um pH no qual a conformação será a 
mais adequada para a atividade catalítica. Este é o chamado pH ótimo. 
Ligeiras mudanças de pH podem provocar a desnaturação da proteína. 
Algumas enzimas apresentam variações peculiares. A pepsina do estômago 
apresenta um ótimo de atividade a pH = 2, e a fosfatase alcalina do intestino a 
pH = 12. 
 
5.2 Temperatura 
 
A temperatura influi na atividade e o ponto ótimo representa o máximo 
de atividade. A temperaturas baixas, as enzimas encontram-se muito rígidas e 
quando se supera um valor considerável (maior que 50°C) a atividade cai 
bruscamente porque, como proteína, a enzima se desnatura. 
Em geral, os aumentos de temperatura aceleram as reações químicas: 
a cada 10°C de aumento, a velocidade de reação se duplica. As reações 
catalisadas por enzimas seguem esta lei geral. Entretanto, sendo proteínas, a 
partir de certa temperatura, começam a desnaturar-se pelo calor. A temperatura 
na qual a atividade catalítica é máxima chama-se temperatura ótima. Acima 
desta temperatura, o aumento de velocidade da reação devido a temperatura é 
compensado pela perda de atividade catalítica devido a desnaturação térmica, e 
a atividade enzimática decresce rapidamente até anular-se. 
 
5.3 Concentração da Enzima 
 
A velocidade máxima da reação é uma função da quantidade de enzima 
disponível. Assim, a velocidade inicial da reação enzimática é diretamente 
proporcional à concentração de enzima (existindo substrato em excesso) 
(Figura 4). 
Figura 4: Efeito da concentração da enzima sobre a ve locidade inicial (V0). A 
concentracao do substrato esta acima da necessária para atingir a velocidade 
máxima. 
 
5.4 Concentração do Substrato 
 
 
Para atender as necessidades do organismo, as reações bioquímicas 
devem ocorrer em velocidade compatível. A velocidade de uma reação 
bioquímica é expressa em termos de formação de produto ou pelo consumo 
do reagente por unidade de tempo. 
 Inicialmente a velocidade da reação é diretamente proporcional a 
concentração do reagente A. O processo exibe cinética de primeira ordem 
(Figura 5). Quando a adição de mais reagente não aumenta a velocidade, a 
reação exibe cinética de ordem zero (Figura 5). A velocidade passa a ser 
constante porque não depende mais da concentração dos reagentes, mas de 
outros fatores. A quantidade de reagente é o suficiente grande para saturar 
todos os sítios catalíticos das moléculas enzimáticas. Assim, o reagente só 
existe na forma de complexos enzima-substrato (ES). Como a curva 
velocidade-substrato é hiperbólica, a fase de ordem zero atinge uma 
velocidade máxima. 
 
Figura 5: efeito da concentração de substrato sobre a velocidade inicial V0 em 
reações catalisadas por enzimas. 
 
6. Inibição enzimática 
 
 Muitas substâncias alteram a atividade de uma enzima associando 
reversivelmente a ela, de forma a influenciar a ligação do substrato e/ou seu 
numero de reciclagem. As substâncias que reduzem a atividade de uma 
enzima são conhecidas como inibidores. Grande parte do arsenal farmacêutico 
moderno é constituído por inibidoresenzimáticos (Por ex. tratamento da AIDS é 
feito quase exclusivamente com drogas que inibem a atividade de certas 
enzimas virais. 
 Os inibidores podem ser classificados em reversíveis competitivos e não 
competitivos ou irreversíveis. 
 
6.1 Inibição Reversível 
 
 Neste tipo de inibição, a atividade enzimática é recuperada com a 
remoção do inibidor. 
 
6.2 Inibição Reversível Competitiva 
 
 Uma substância que compete diretamente com o substrato normal pelo 
sitio de ligação de uma enzima. Esse inibidor normalmente é semelhante ao 
substrato, de modo que se liga especificamente ao sitio ativo, mas difere do 
substrato por não poder reagir com ele. 
 O inibidor liga-se à enzima formando o complexo EI cataliticamente 
inativo. 
 
6.3 Inibição Reversível Não Competitiva 
 
 Na inibição não-competitiva, o inibidor liga-se diretamente a enzimas ou 
ao complexo enzima-substrato. Esta ligação pode distorcer a enzima tornando 
o processo catalítico ineficiente. 
 
 
O inibidor não competitivo pode ser uma molécula que não se 
assemelha com o substrato, mas apresenta uma grande afinidade com a 
enzima. 
 
6.4 Inibição Irreversível 
 
 A inibição irreversível ocorre quando o inibidor liga-se tão fortemente à 
enzima que a dissociação é muito lenta. Podem destruir grupos funcionais que 
são essenciais para a atividade enzimática. A enzima não retoma a sua 
atividade normal. 
Ex.: Inibição dos gases neurovenenosos e inseticidas organofosforados 
na acetilcolinesterase (enzima importante na transmissão dos impulsos 
nervosos). 
 
7. Co-fatores e Coenzimas 
 
 Algumas enzimas como a quimotripsina (enzima que hidrolisa proteína) 
ou triosefosfato isomerase são ativas sem necessitar a presença de outro fator. 
No entanto, quase um terço das enzimas conhecidas requerem um componente 
não protéico para sua atividade, denominado cofator. 
 Os co-fatores podem ser íons metálicos, como o Cu2+, o Fe3+ ou o 
Zn2+. A natureza essencial de tais co-fatores explica por que razão os 
organismos necessitam de quantidades diminutas de certos elementos nas 
suas dietas. Isso também explica, em parte, os efeitos tóxicos de certos metais 
pesados. Por exemplo, o Cd2+ e o Hg2+ podem substituir o Zn2+ (todos se 
encontram no mesmo grupo na tabela periódica) nos sítios ativos de certas 
enzimas, incluindo a RNA-polimerase, tornando, desse modo, essas enzimas 
inativas. 
 Os co-fatores também podem ser moléculas orgânicas, conhecidas 
como co-enzimas, tal como o NAD+ na YADH. Alguns co-fatores (p.ex., o 
NAD+) são apenas temporariamente asssociados com uma dada molécula 
enzimática, de maneira que elas funcionam como co-substratos. Outros co-
fatores, conhecidos como grupos protéticos, estão permanentemente 
associados com suas proteínas, em geral por meio de ligações covalentes. Por 
exemplo, o grupo prostético heme do citocromo c é fortemente ligado a essa 
proteína por uma extensa rede de interações hidrofóbicas e pontes de 
hidrogênio junto com ligações covalentes entre o heme e as cadeias laterais 
especificas da proteína. 
 Um complexo enzima-co-fator cataliticamente ativo é chamado de 
holoenzima. A proteína enzimaticamente inativa resultante da remoção do co-
fator da holoenzima é chamada de apoenzima; ista é, 
Apoenzima (inativa) + cofator ? holoenzima (ativa) 
 
7.1 As coenzimas devem ser regenaradas 
 
 As coenzimas são quimicamente modificadas pelas reações enzimáticas 
em que participam. Na reação da YADH, por exemplo, o NAD+ é reduzido a 
NADH. A fim de complementar o ciclo catalítico, a coenzima deve retornar ao 
seu estado original (no exemplo da YADH, o NADH deve ser reoxidado a 
NAD+). 
 
8. Regulação da Atividade Enzimática 
 
 Um organismo deve poder regular as atividades catalíticas de suas 
enzimas para que ele possa coordernar seus processos metabólicos, 
responder às mudanças no meio, crescer e diferenciar-se, tudo de maneira 
ordenada. Há duas maneiras pelas quais isso pode ocorrer: 
1. Controle da disponibilidade da enzima. A quantidade de uma dada 
enzima em uma célula depende da sua velocidade de síntese e da sua 
velocidade de degradação. Cada uma dessas velocidades é diretamente 
controlada pela célula e esta sujeita a mudanças drásticas em períodos 
que vão de minutos (em bactérias) até horas (em organismos 
superiores). 
2. Controle da atividade da enzima. A atividade catalítica de uma enzima 
pode ser diretamente regulada por meio de alterações estruturais que 
influenciem a afinidade da ligação do substrato à enzima. A afinidade de 
ligação do substrato a uma enzima pode, de modo semelhante, variar 
com a ligação de pequenas moléculas, chamadas efetores alostéricos. 
Os mecanismos alostéricos podem ocasionar grandes alterações da 
atividade enzimática, tanto aumentando, como diminuindo a atividade. 
Um modelo muito comum de regulação alostérica é a inibição por "feed-
back", onde o próprio produto da reação atua como modulador da 
enzima que a catalisa. 
 
9. Medida de atividade enzimática 
 
As medidas de concentração, expressas em unidades de massa por 
unidades de volume não tem aplicação para soluções enzimáticas, já que o 
que importa não é a massa, mas a atividade. Uma solução de enzimas 
desnaturadas conserva a massa protéica mas a propriedade catalítica está 
perdida. Desnaturações parciais podem levar duas soluções de mesma 
concentração enzimática a ter atividades muito diferentes. 
 Em virtude disto, a dosagem de enzimas é sempre feita através da 
medida de sua atividade, que é avaliada pela velocidade da reação que a 
enzima cataliza. Dada a especificidade das enzimas, essa medida é possível, 
mesmo na presença de outras proteínas. Para efetuar essas dosagens, uma 
amostra da solução contendo a enzima é incubada com concentrações altas de 
substratos (para garantir a velocidade máxima e impedir que pequenas 
variações na concentração do substrato possam afetar as medidas). A 
velocidade da reação é medida e expressa em Unidades Internacionais. Uma 
Unidade Internacional (U) é a quantidade de enzima capaz de formar 1µmol de 
produto por minuto em condições ótimas de medida (pH, temperatura, etc.), 
especificadas para o caso. 
 A medida da atividade enzimática é imprescindível para monitorar a 
purificação de uma enzima. 
 A atividade específica é o número de Unidades de enzima por 
miligramas de proteína. Portanto se a etapa de purificação for bem sucedida a 
atividade específica encontrada deve aumentar. Esse aumento significa que o 
procedimento adotado eliminou proteínas indesejáveis. 
 A concentração de produtos aumenta linearmente com o tempo num 
dado intervalo (velocidade constante). No entanto , a partir de certo tempo, a 
velocidade (valor da tangente à curva num dado instante) decresce. Vários 
fatores podem contribuir para este decréscimo: diminuição da concentração de 
substrato, inativação parcial da enzima no decorrer da reação, inibição por 
produto e deslocamento do equilíbrio se a reação for reversível. Para evitar a 
influencia destes fatores costuma-se associar a atividade á medida da 
velocidade de reação em condição inicial, ou seja, aquela que assegura 
velocidade constante. 
 A escolha de um método para a determinação da atividade de uma 
enzima produzida por fermentação requer conhecimento prévio da faixa de 
concentração enzimática que permite obter uma variação linear da 
concentração de produto (ou substrato) com o tempo. Podem ser usados 
métodos variados para avaliar a acriacao das concentrações das espécies. 
Alguns deles são muito diretos (espectrofotometria, fluorimetria, titulometria) e 
outros menos (medida da viscosidade). 
 
10. Produção industrial de enzimas 
 
 A produção de enzimas em escala industrial se faz majoritariamente por 
fermentação submersa, embora nos países orientais haja uma tradição 
estabelecida de utilização da fermentação semi-sólida. 
 Um dos processos mais importantesprévios à fermentação é o preparo 
do inoculo. Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado com a 
cultura estoque liofilizada. Decorrido o tempo suficiente, essa cultura é 
inoculada no fermentador principal. A quantidade de inoculo pode variar de 1 a 
10% (p/v) e a produção da enzima pode ser afetada por esse parâmetro. 
 
Fonte 
 As enzimas podem ser obtidas de animais (amilase pancreática, lípase 
pancreática, pancreatina, pepsina, quimosina), vegetais (a-amilase, ß-amilase, 
bromelina, ficina, papaína) e microrganismos [a) enzimas amilolíticas: Bacillus 
subtilis, Aspergillus oryzae, A.niger, A.flavus, A.awamori; b) glicoseoxidase: 
A.niger, Penicillium amagasakiense, P.notatum; c) lactase: Saccharomyces 
fragilis, Zygosaccharomyces lactis; d) lípase: A.niger, Rhysopus sp; e) 
proteases: B.subtilis, A.oryzae, A.flavus, A.niger, Endothia parasítica, Mucor 
pusillus. 
 
 
 
O processo fermentativo 
 A linhagem microbiana utilizada industrialmente é, em geral, fruto de um 
longo trabalho de melhoramento e, portanto, sigilosamente protegida. Sendo 
que os cuidados de estocagem e manutenção são muito importantes para a 
reprodução dos resultados. 
 Os meios de cultivo são formulados através da utilização de compostos 
quimicamente conhecidos (meios sintéticos) ou de matérias-primas naturais. 
Os meios devem conter fontes de carbono e energia, fontes de nitrogênio, 
substâncias minerais e fatores de crescimento. Os meios de cultivo são, em 
geral, resultado de um processo de otimização. A influência de certos 
componentes do meio na produção da enzima-alvo pode ser muito significativa. 
A composição dos meios de cultivo usados industrialmente também é 
sigilosamente guardada. 
 A fermentação industrial é conduzida em fermentadores mecanicamente 
agitados. A produção de enzimas geralmente ocorre em fermentadores com 
capacidade de 10.000 a 100.000 litros, operados de modo descontinuo 
(batelada). Tais fermentadores são munidos de camisas ou serpentinas 
internas para as necessidades de aquecimento e refrigeração e de sistemas de 
medidas (sensores de pH, temperatura, oxigênio dissolvido e espuma). As 
fermentações em batelada para produção de enzimas tem duração da ordem 
de 30 a a150 horas. 
 
Processo a jusante (downstream) da fermentação 
 As operações que se seguem ao processo fermentativo dependem da 
localização da enzima de interesse (intra ou extracelular). 
 
Etapas iniciais de separação e concentração 
 No caso de enzimas extracelulares, ao término do processo 
fermentativo, o caldo é resfriado a cerca de 5°C, para assegurar condições de 
estabilidade do produto e evitar o crescimento de microrganismos 
contaminantes. O pH é geralmente ajustado para o valor ótimo de atuação da 
enzima produzida. 
 A separação das células pode ser feita por centrifugação ou filtração. 
 A solução clarificada contendo a enzima de interesse deve ser 
concentrada. A concentração pode ser feita por ultrafiltração (utilizando a 
tecnologia de processos com membranas) ou por evaporação a vácuo 
(conduzida a temperaturas inferiores a 35°C. 
 Esta solução concentrada diluída a níveis convenientes e acondiciona 
com estabilizantes da atividade enzimática pode ser embalada para 
comercialização. 
 No caso das enzimas intracelulares, a separação da biomassa celular já 
fornece um alto fator de concentração da enzima. A biomassa, em geral, obtida 
por centrifugação, é lavada e as células são rompidas. Diversas técnicas 
podem ser usadas nessa operação: moagem com esferas de vidro, 
homogeneização em alta pressão (ruptura é proporcionada pelo bombeamento 
em alta pressão da suspensão contra uma válvula de descarga que dispõe de 
um pequeno orifício para passagem do fluido), sonificação, congelamento, 
tratamentos químicos (como soluções de soda caustica tem aplicação muito 
limitada pois a enzima deve ser tolerante a valores elevados de pH) e 
enzimáticos. 
 A ruptura das células libera inúmeras substâncias para o meio aquoso. 
 A precipitação dos ácidos nucléicos é um procedimento necessário. 
Essa precipitação pode ser feito com sais de Mn (II). Deve-se escolher uma 
agente que não precipite a enzima de interesse ou provoque sua desativação. 
o sobrenadante pode ser clarificado por filtração e concentrado por 
ultrafiltração ou evaporação a vácuo. 
 
Purificação e acabamento 
 A partir da obtenção do concentrado enzimático as operações de 
processamento não se diferenciam quanto à natureza da enzima, mas quanto a 
forma de apresentação (solida ou liquida) e o grau de pureza desejado. 
 A solução concentrada e diluída a níveis convenientes pode ser um 
produto comercializável. Ou pode ser preferível a obtenção de um produto na 
forma sólida. Nesse caso o produto deve ser seco a vácuo ou por atomização 
(spray drying). O produto final não pode apresentar baixa granulometria, pois 
há riscos de geração de poeiras, que podem provocar problemas de saúde 
para os trabalhadores que o manuseiam. Deve proceder-se à peletizacao ou 
aglomeração desse material sólido, para obter partículas maiores, na faixa de 
200 a 500 µm. para padronização da atividade enzimática misturam-se 
quantidade apropriadas de material sólido inerte. 
 Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com maior grau 
de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e 
purificação. 
 A adição de sais como o sulfato de amônia (NH4)2SO4 provoca a 
precipitação de moléculas protéicas, então a é realizada centrifugação para 
obter as moléculas protéicas. A precipitação pode ser feita também com 
solventes (etanol, metanol) embora deve-se tomar cuidado para não provocar a 
desnaturação das proteínas. Outras técnicas para separação de proteínas 
consistem na utilização de membranas como ultrafiltracao, microfiltracao e 
osmose inversa. 
 Quando busca-se um alto grau de pureza do produto, técnicas 
cromatográficas são empregadas, como a cromatografia de troca iônica que se 
baseia na carga das moléculas, a cromatografia de partição ou de filtração em 
gel, baseada no tamanho da moléculas, a cromatografia de afinidade baseada 
na ligação bio-específica da enzima com os ligantes, que podem ser substratos 
ou inibidores. 
 A concentração pode ser obtida das seguintes formas: 
- adição de um polímero tipo Sephadex G-25, cujos poros são muito pequenos 
para permitir a entrada de moléculas grandes. Remove cerca de 70% da água. 
- ultrafiltrção: remoção do solvente por uma mebrana semi-permeável não que 
permite a passagem da enzima. 
- Remoção de água sob vácuo – liofilização. 
 
Controle de Pureza 
O controle da pureza pode ser realizado por eletroforese. A eletroforese 
é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de 
partículas com a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são 
separadas de acordo com o seu tamanho, forma ou carga. Das muitas técnicas 
existentes para a análise de proteínas (enzimáticas ou não), a eletroforese em 
gel é sem dúvida a mais versátil e facilmente aplicável. A eletroforese é tão 
sensível que se podem detectar prote ínas que só diferem em um aminoácido 
de um total de várias centenas que as constituem. 
O grau de purificação almejado esta relacionado à aplicação do produto. 
No mercado estão disponíveis tanto preparações pouco purificadas, para uso 
técnico ou industrial, como preparados de alto grau de pureza para uso 
analítico ou farmacêutico. 
 
11. Referencias Bibliográficas 
 
AQUARONE, Eugênio; BORZANI, Walter; ALMEIDA LIMA, Urgel de; 
SCMIDELL, Willibaldo. Biotecnologia industrial. Volumes 1, 2, 3 e 4. 
CHAMPE, Pamela C. & HARVEY, Richard A. - Bioquímica Ilustrada. Artes 
Médicas. Porto Alegre, 1997. pp 126-131. 
LEHNINGER, Albert L; NELSON, David L.; COX, Michael M. Principios de 
bioquimica. 4. ed. São Paulo: Sarvier, 2006. 
STRYER, Lubert. Bioquímica. Rio de Janeiro:Guanabara Koogan,1996. 
VOET, Donald; VOET,Judith G. Bioquímica. 3. ed. Porto Alegre: ARTMED, 
2006. 1596p.