Relatório 10- quantificação de proteínas do leite pelo método do biureto

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INTRODUÇÃO
A primeira etapa essencial de uma análise quantitativa de proteínas é a seleção do método. Questões como nível de exatidão requerido, natureza da proteína, número de amostras, fator econômico, tempo, complexidade e número de componentes da amostra, entre outros, devem ser considerados na escolha do procedimento. Os métodos espectrofotométricos são um dos mais comuns para este tipo de análise, pois possuem características que os tornam favoráveis para a quantificação de proteínas. 
O conhecimento da absorção de luz pela matéria é a forma mais usual de determinar a concentração de compostos presentes em solução. Todo composto químico absorve, transmite ou reflete luz (radiação eletromagnética) em uma certa amplitude de comprimento de onda.
A espectrofotometria pode ser definida como toda técnica analítica que usa a luz para medir as concentrações das soluções. A técnica é baseada na interação da matéria com a radiação eletromagnética calculando o quanto é absorvido e quanto é transmitido. A razão entre a intensidade da luz emergente (I) e a intensidade da luz incidente (Io), dá-se o nome de transmitância (T), sendo T= I/Io.
A Lei de Lambert-Beer tem como fundamento a relação entre a transmissão de luz e a espessura da camada do meio absorvente. Quando um feixe de luz monocromática, atravessava um meio transparente homogêneo, cada camada deste meio absorve igualmente a fração de luz que o atravessa, independente da intensidade da luz que incide. A partir desta conclusão foi enunciada a seguinte lei: " A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente ".
Esta lei pode ser expressa pela seguinte equação: 
T = 10 –kcl 
Onde: 
· T é a transmitância;
· k, é um coeficiente de extinção molar;
· c, concentração da substância; 
· I, espessura da solução atravessada pela luz. 
Transformando essa equação em uma forma linear, pode-se calcular a absorvância (A), tem-se: 
 Log T = -kcl ou –log T = kcl 
Sendo –log de T a absorvância (A).
Assim, segundo a lei de Lambert Beer, em determinado comprimento de onda, a concentração na solução da substância absorvente e sua espessura são proporcionais a quantidade de luz absorvida (absorvância), ou seja, quanto mais concentrada for a solução, maior será a absorção de luz. Por outro lado, a cor da solução é determinada pela cor da luz transmitida. Os métodos espectrofotométricos tem como base esse princípio.
Enquanto a absorvância exprime a fração da energia luminosa que é absorvida por uma determinada espessura de um material. Ou seja, a capacidade de absorver a luz. A transmitância exprime a fração da energia luminosa que consegue atravessar uma determinada espessura de um material, sem ser absorvida. Ou seja, a capacidade de transmitir a luz. Assim, quando a absorbância de uma solução aumenta, a transmitância diminui. 
Existem dois equipamentos capazes de determinar transmitância e absorvância de soluções, são eles: espectrofotômetros e colorímetros. Alguns componentes são comuns a todos os espectrofotômetros, como é verificado a seguir. A luz, habitualmente fornecida por uma lâmpada, é fracionada pelo prisma ou rede de difração nos comprimentos de onda que a compõem). O comprimento de onda selecionado é dirigido para a solução contida em um recipiente transparente (cubeta). Parte da luz é absorvida e parte é transmitida. A redução da intensidade luminosa é medida pelo detector (célula fotelétrica) porque o sinal elétrico de saída do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele. O sinal elétrico amplificado e visualizado no galvanômetro em números, é lido como uma absorbância e é proporcional à concentração da substância absorvente existente na cubeta. o colorímetro é um aparato que permite a determinação da absorbância de uma solução em uma frequência particular de cores, do espectro visível, (comprimento de onda de 400 a 750 nm). Colorímetros tornam possíveis as verificações de concentração de um soluto conhecido, desde que esta seja proporcional à absorbância. É composto por uma fonte luminosa emissora de luz branca que atravessa um filtro, o qual deixa passar apenas a faixa de comprimento de energia radiante desejada.
O método do biureto, utilizado nesta prática, se baseia na reação do reativo do biureto (azul), que é constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o cobre em solução, sendo o tartarato de sódio. O cobre, em meio alcalino, reage com proteína formando um complexo de cor violeta entre os quatro grupos –NH das cadeias peptídicas e o íon metálico cúprico, Cu2+ (que se encontra no reagente de Biureto). O produto de reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm aumentar em seis vezes a sensibilidade do método do biureto, a banda na região de 540 nm é a mais utilizada para fins analíticos, porque diversas substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na região de 270 nm causando muita interferência no método. Este método apresenta sensibilidade entre 1 e 5 mg ml-1 de proteína, portanto, amostras contendo menos proteína do que a faixa de sensibilidade devem ser concentradas para que haja eficácia do método, assim como amostras que ultrapassem a faixa de sensibilidade devem ser diluídas
Essa aula teve como objetivo a utilização do método do biureto para se realizar a quantificação das proteínas do leite. 
DISCUSSÃO
1- A partir do sulfato cúprico, há reação das proteínas com o cobre, formando um complexo de cor violeta entre os quatro grupos –NH das cadeias peptídicas e o íon metálico cúprico, Cu2+. O hidróxido de sódio cora as ligações peptídicas e o tartarato duplo de sódio e potássio estabiliza o cobre em solução.
EXERCÍCIOS
1- A Lei de Lambert enuncia que a intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente, portanto, a lei foi obedecida, já que a medida que a concentração aumentou, a absorvância também aumentou, resultando ,no gráfico, numa reta, a qual chamamos de curva padrão.
2- O produto referente ao método do biureto, utilizado nessa prática para a quantificação das proteínas do leite, apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Utilizou-se a banda na região de 540 nm pois, apesar de ter sensibilidade menor, não há tanta interferência quanto na banda de 270nm, pois nesta diversas substâncias podem ser absorvidas, que é o que causa as interferências. 
3- Pois é o tubo branco que calibra o aparelho, corrigindo a absorção de luz devido ao solvente e, com isso, gerando um valor zero de absorvância do aparelho ou 100% de transmitância. 
4- A partir da curva padrão, pode-se determinar a concentração de uma amostra desconhecida apenas pela sua absorvância, para isso, deve-se medir a absorvância e achar o valor de concentração correspondente no gráfico, por meio da curva padrão. É calculado por regressão linear.
5- Pois o método do biureto apresenta sensibilidade entre 1 e 5 mg ml-1 de proteína, as amostras utilizadas foram de 5 ml e 0,5 ml respectivamente, ou seja, ambas ultrapassaram a faixa de sensibilidade e, por isso, tiveram de ser diluídas. 
6- Porque a amostra 2 continha as proteínas totais do leite, enquanto a amostra 1 continha apenas as lactoproteínas.
7- a) Fator de diluição=n54ml/20ml=m2,7
0,215=0,05x- 0,002
X= 4,34 mg/ml
A concentração das proteínas é 4,34 vezes 2,7= 11,718 mg/ml
b) as lactoproteínas. Isso ocorre pois quando o ácido é adicionado à solução, a caseína precipita e após a filtragem é descartada e não há mais caseína presente na solução.