Espectrofotometria

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Introdução 
O comportamento da energia eletromagnética é chamado de espectroscopia que é dividida em 
espectrofotometria e em espectrometria. 
A espectrofotometria é um método utilizado para medir o quanto uma molécula ou substância absorve a luz, 
medindo a intensidade quando um feixe de luz passa através da solução da amostra. Vale ressaltar que, a luz 
inicial é maior do que a luz final e essa diferença se dá pela quantidade de luz absorvida pela molécula e a 
quantidade de luz que possa ser refletida. 
As cubetas podem ser feitas basicamente de três materiais: vidro, plástico de resistência e quartzo. Dito isso, 
os comprimentos de onda na região do invisível (menores que 390) possuem bastante energia, ou seja, só é 
possível usar cubetas de quartzos, já os comprimentos de onda entre 390nm e 790nm estão na região do visível 
(cores possíveis de ver no dia a dia). 
 
Conceitos da espectrofotometria 
O conhecimento da absorção de luz pela matéria é a forma mais usual de determinar a concentração de 
compostos presentes em solução. Todas moléculas e compostos químicos absorvem, transmitem ou refletem 
luz (radiação eletromagnética) em uma certa amplitude de comprimento de onda. 
A espectrometria é muito utilizada nas áreas de biologia, físico-química, indústria e em diversos laboratórios, 
incluindo a nossa, ou seja, as análises clínicas e toxicológicas 
 
 Exemplo de regra de três utilizada na determinação da glicose (espectrometria molecular) 
Solução de glicose 100mg/dL --------- ABS para solução de 100mg/dL de glicose 
 Amostra teste ---------- X 
A concentração da amostra teste = fator de calibração X absorvância da amostra teste. Sendo que, o fator de 
calibração = concentração do padrão/ pela absorvância do padrão. 
Espectros Luminosos trabalhados em um laboratório químico 
Por meio da espectrofotometria é realizada a medição da intensidade da luz em comprimentos de onda, sendo 
que os componentes de uma solução podem ser identificados por seus espectros característicos ao ultravioleta 
(invisível), visível ou infravermelho. O infravermelho geralmente não é utilizado nos laboratórios 
convencionais. 
Vale ressaltar que a quantidade de energia no invisível é muito maior do que a do visível. Quanto maior o 
comprimento de onda, menor a quantidade de energia transmitida no meio. 
 
Esquema de Espectrofotômetro 
No laboratório, ao observar um espectrofotômetro por dentro é possível enxergar uma lâmpada, um colimador 
que tem a função de separar a energia luminosa e deixar ela colimada. Assim, o colimador passa a luz para o 
prisma que decompõe a luz que posteriormente passa para um seletor no qual vai fazer uma “peneiragem” da 
luz monocromática fazendo com que seja passado apenas um comprimento de onda. A cubeta comportará a 
amostra a ser analisada e aí vai haver a presença de uma fotocélula pra captar a energia luminosa e transformar 
em dados que indicará a absorvância. 
A depender da região luminosa a ser estuda, a cubeta terá que ser de quartzo, de plástico ou de vidro. Se for 
uma região no ultravioleta só poderá ser utilizado cubetas de quartzo, se for uma região no visível poderá ser 
utilizado cubetas de vidros ou de plásticos resistentes. 
Além disso, é de suma importância o cuidado com a qualidade da energia que vai alimentar a lâmpada. Por 
exemplo, um espectrofotômetro que estiver diretamente ligado a tomada terá oscilações de energia elétrica 
brutais ao longo do dia. O interessante é que o aparelho esteja ligado a uma fonte de energia estável e contínua, 
assim é indicado a ligação em estabilizadores ou Nobreak, o nobreak é uma das melhores opções porque 
absorve a energia de má qualidade da rua, armazena e transfere ela com uma melhor qualidade. 
Outro ponto importante é que, só deve chegar na cubeta a luz oriunda da lâmpada. Por exemplo, se um aparelho 
cair no chão e sofrer uma rachadura, ele vai começar a receber energia de fora também e isso vai ocasionar 
interferências (luz parasita). 
 
 
Lei de Lambert e Beer 
A força vital da espectrofotometria está fundamentada na lei de Lambert-Beer, que estabelece: 
 “A absorvância é diretamente proporcional à concentração da substância em solução” 
Na imagem abaixo é possível ver um decaimento energético (luz inicial maior que a final) isso porque alguma 
quantidade de energia luminosa fica absorvida nas moléculas em solução e quantidades menores podem ser 
refletidas. 
 
 A relação entre a energia que chega e a que sai se dá em função de uma base logarítmica. A absorvância vai 
ser igual a razão da energia inicial menos a final. 
 
Transmitância e Absorvância 
Quando um feixe de luz incidente com intensidade I0 passa através de uma célula quadrada contendo uma 
solução com um composto que absorve luz em comprimento de onda específico, λ, a intensidade do feixe de 
luz transmitida I S é inferior a I0, e a luz transmitida é definida como: 
 
Parte da luz incidente, entretanto, pode ser refletida pela superfície ou absorvida pela parede da célula ou 
solvente. Estes fatores são eliminados pela utilização de uma célula de referência idêntica à da amostra. 
 
Conceitualmente: 
 Transmitância = A medida da intensidade de um feixe luminoso que atravessa um meio (no caso, a 
solução analisada) cuja densidade seja diferente da densidade do solvente (utilizado na solução). 
 Absorbância = O quanto de luz que esse meio é capaz de absorver em relação à célula de referência 
(branco). 
 Resumindo, transmitância = o quanto que passa de luz, absorbância = o quanto que fica de luz. 
Relação entre Transmitância e Absorvância: 
 Antigamente era determinado somente a transmitância que é inversamente proporcional a 
concentração, quanto menor a transmitância maior a concentração, ou seja, quanto mais concentrado 
o meio menos luz será transmitida. Quanto maior a concentração do meio, mais luz será absorvida 
(diretamente proporcional). 
 A concentração tem grande influência porque normalmente é utilizado corantes que são identificadores 
de pH, assim, as reações bioquímicas possuem cor na região do visível e quando a concentração está 
muito alta as cores ficam muito intensas fazendo com que a luz não chegue do outro lado e impedindo 
o cálculo. 
 No dia a dia em laboratório clínico, se a amostra for passada e não for lida (ex: der uma concentração 
0), é necessário diluir a amostra até conseguir uma leitura. Ou seja, nunca se deve liberar um resultado 
com concentração 0 sem diluir a amostra e lê-la várias vezes. 
 Exemplo: fenômeno prozona, ocorre quando há falsos resultados negativos em soros com elevado 
título de anticorpos aglutinantes. Esse feito é eliminado empregando-se diluições seriadas do soro. 
 Lembrando que, quando a curva estoura ou perde a linearidade é necessário diluir a amostra. 
 
Pré-requisitos necessários para correta utilização e aplicação da Lei de Lambert-Beer 
1. As partículas (átomos, moléculas ou íons) presentes em solução devem absorver a luz de forma 
independente entre si; 
2. O meio absorvente deve ser homogêneo (solução) e não dispersar a radiação; 
3. A radiação incidente deve estar colimada (pelos paralelos entre si) e deve atravessar a mesma distância 
durante a qual interage com as partículas existentes em solução; 
4. A radiação deve ser monocromática, isto é, composta por apenas um comprimento de onda selecionado 
(normalmente corresponde ao comprimento de onda para o qual a absorvância da espécie em estudo é 
máxima); 
5. O fluxo de radiação incidente não pode induzir processos que impliquem a desestabilização dos átomos, 
moléculas ou íons, como por exemplo, excitação eletrônica que dê origem a fenômenos de fluorescência 
ou fosforescência. Florescência ou fosforescência geralmente são lidas em outro tipo de equipamento 
porque o princípio das peças da maquinária interna tem que ser diferente, já que se trata de reações de 
aumento deenergia. 
Obtenção dos comprimentos de onda 
É possível obter comprimentos de onda que sejam específicos para certas substâncias através da construção 
de uma curva de absorção espectral (varredura: ler vários comprimentos de onda na região do visível e do 
invisível e depois será lido uma solução com e sem a substância para analisar qual melhor comprimento de 
onda para ser utilizado para encontrar a concentração da substância na solução); onde a substância em questão 
(aquela que se quer determinas) é colocada na cubeta, e os comprimentos de onda do UV até o IV vão sendo 
passados, e a absorção de cada faixa é medida. O comprimento de onda a ser ajustado no aparelho será aquele 
onde tiver ocorrido a maior absorbância, pois, em essência se trata do pico de absorção de energia pela 
molécula. 
 Ex: para a análise do teor de glicose deve-se ajustar o aparelho em 500nm, pois, se trata da maior 
absorbância para esta molécula