Lab - Cultivo de Aspergillus awamori

Prévia do material em texto

Cultivo de 
Aspergillus awamori
Cristhofer Busch 09.02076-4
Caio Cammarota 11.02900-5
Andrezza Sleiman 12.02593-3
Gabriela Crespilho 14.02137-4
OBSERVAÇÃO:
Para mudar a imagem deste slide, selecione a imagem e exclua-a. Em seguida, clique no ícone Imagens do espaço reservado para inserir sua própria imagem.
Agenda 
Objetivo
 Introdução
 Materiais e Métodos
 Resultados e discussão
 Conclusão 
Objetivo
Cultivar o Aspergillus awamori, entendendo assim a partida de um processo industrial;
 Avaliar a importância da metodologia asséptica;
Realizar o repique de Aspergillus awamori em meio sólido inclinado no tubo de ensaio e no erlenmeyer.
Obter o inóculo a partir de cultura de Aspergillus awamori em meio sólido inclinado. E quantificar a suspensão de esporos de A. awamori e inocular em meio de cultura aquoso. 
Comparar as formas de cultivo (estático e submerso) do microrganismo em meio aquoso.
Introdução
Microorganismo
Aspergillus awamori
 Substrato
Meio de cultivo sólido
Meio de cultivo aquoso
Microorganismo: Espécies do gênero Aspergillus foram o grupo mais importante de microorganismo utilizados para a produção de enzimas empregadas na indústria alimentícia. O gênero Aspergillus compreende mais de 100 espécies. O Aspergillus Awamori é um fungo sintetizador de amiloglucosidase. Esse microorganismo tem uma história de uso seguro para a fabricação de produtos alimentícios destinados ao consumo humano, sendo considerado como não tóxico e não patogênico.
Substrato: A escolha adequada de uma fonte de carbono é importante no sucesso da síntese do produto desejado. O substrato ideal é aquele que provê todos os nutrientes necessários aos microorganismo para sua função ótima. O custo e a disponibilidade são outras considerações importantes. Assim, a seleção de um substrato apropriado possui um papel importante no desenvolvimento de processos fermentativos eficientes. A escolha do meio de cultura é tão essencial para o sucesso do processo fermentativo quanto a escolha do microorganismo. Nem sempre o meio que permite o melhor desenvolvimento do microorganismo favorece a formação dessas enzimas. A produção ótima e os parâmetros que afetam a síntese enzimática devem ser investigados sempre, pois as condições ótima variam para o diferentes microorganismo, assim como para diferentes enzimas.
4
Materiais 
Equipamentos
Instrumentos 
Câmara de fluxo laminar
Câmara de contagem de Neubauer
Microscópio óptico
Autoclave
Erlenmeyers
Tubos de ensaio
Béqueres
Bico de Bunsen
Gaze
Papel alumínio
Pipeta esterilizada
Proveta
Alça de platina
Tela de amianto 
Algodão
Preparo do meio sólido
	Composto	Quantidade (g/L)	Função
	Glicose	30,0	Fonte de carbono
	Extrato de levedura	1,0	Fonte de nitrogênio
	MgSO4.7H2O	0,5	Nutriente
	K2HPO4	1,0	Controle de pH
	KCl	0,5	Nutriente
	FeSO4.7H2O	0,01	Nutriente
	NaNO3	2,0	Fonte de nitrogênio
	Ágar	20,0	Gelificante
Tabela 1 – Composição do meio para cultivo Czapek (sólido) para propagação do Apergillus awamori
Preparo do meio sólido
500 mL
Água da torneira
Dissolver os nutrientes (menos ágar) em água enquanto é aquecida no Bico de Meker
Adicionar o ágar aos poucos
10 mL em um tubo de ensaio com tampa
100 mL
 A água de torneira foi utilizada, pois os microrganismos necessitam dos sais minerais dissolvidos nela para se desenvolver e o aquecimento até a fervura foi necessário no preparo do meio sólido para evitar a solidificação do ágar até completar a dissolução.
 É transferido 10 mL para um tubo de ensaio com tapa fechado parcialmente para que o vapor possa entrar e sair enquanto estiver na autoclave 
7
Preparo do meio aquoso
	Composto	Quantidade (g/L)	Função
	Fonte de carbono	20,0	Fonte de carbono
	Extrato de levedura	1,0	Fonte de nitrogênio
	Uréia	2,3	Fonte de nitrogênio
	MgSO4.7H2O	0,5	Nutriente
	Na2HPO4.12H2O	3,8	Controle de pH
	KH2PO4	3,5	Nutriente
Tabela 2 – Composição do meio para cultivo do Apergillus awamori
Preparo do meio aquoso
Diluir a (glicose/sacarose/amido) em 300 mL de água de torneira
Distribuir a solução igualmente em 3 erlenmeyers de 500 mL
Diluir sais e extrato de levedura em 200 mL de água de torneira
Distribuir a solução igualmente em 3 erlenmeyers de 1000 mL
Esterilização dos meios de cultivo
Os meios de cultivo devem estar devidamente adequados:
Tubos de ensaio com as tampas semifechadas;
 Erlenmeyers tampados com filtros de profundidade (algodão e gaze) envolvidos com papel alumínio;
 O frasco não pode estar completamente cheio na autoclave devido o processo de ebulição.
Importância do procedimento: eliminação de todos os microrganismos presentes no meio através de vapor
 O objetivo do filto de profundidade é para não permitir a entrada de microorganismos.
 O alumínio é utilizado para evitar que o vapor condense (na autoclave) e caia no filtro. Desta forma o meio não é diluído e evita que crie caminhos para a entrada de microorganismos.
10
Esterilização dos meios de cultivo
2 Resistências
Pressão
Travas
Saída de vapor
Processo na Autoclave:
O pedal foi acionado para que seja possível movimentar a tampa;
Colocou-se água até a base de apoio dos cestos;
Com os meios de cultivo alocados na autoclave as travas foram levemente rosqueadas;
Com todas as travas alocadas, aperta-se uma a uma, sempre alternando entre travas opostas;
Ligam-se as duas resistências;
Verificar na autoclave o nível de água destilada. Deve estar na altura do suporte “X” garantindo que as resistências estejam submersas evitando assim a danificação destas.
11
Esterilização dos meios de cultivo
2 Resistências
Pressão
Travas
Saída de vapor
Após 15 minutos com as resistências ligadas, a válvula de saída de vapor foi fechada;
 Quando a pressão chegou a 1 kg/cm² (121°C) uma das resistências foi desligada;
 Após 15 minutos, a esterilização ter sido completada, a segunda resistência foi desligada
Os meios de cultivos foram retirados da autoclave.
12
Esterilização dos meios de cultivo
 Por fim retirar os meios de cultivo da autoclave, resfriar e refrigerar, com os meios de cultivo sólidos dispostos inclinados para aumentar a superfície de contato obtendo assim uma maior quantidade de microorganismos.
13
Repique em tubo de ensaio – meio sólido
Flambou-se a alça de platina até o rubro para a coleta de uma porção de microrganismo do tubo de ensaio contendo cultura de A. awamori, flambando-se também o bocal do tubo quando este foi aberto. Fechou-se o tubo, abriu-se e flambando-se o bocal do segundo tubo contendo o meio inclinado estéril, sem que o tampão entrasse em contato com a bancada, e transferiu-se o microrganismo.
14
Transferir os microrganismos sem contaminar com outros.
A transferência é feita para outro meio que esteja asséptico em uma câmara de fluxo laminar.
Entre a pessoa e o microrganismo tem que haver a chama para não haver contaminação
Repique em Erlenmeyer – meio sólido
 É uma técnica de esterilização feita dentro da câmara de fluxo laminar, com o vidro da câmara abaixado e atrás da chama do Bico de Bunsen. Isto para evitar contaminação do meio e contaminação de quem está manipulando. A flambagem é realizada antes e depois do uso do instrumento.
 Usa-se solução salina ao invés de alça de platina porque assim é possível transferir uma maior quantidade de microrganismos, e isso é necessário visto que a área do meio de cultivo em erlenmeyer é maior.
A solução salina foi utilizada no repique em vez de água, pois utilizando-se água ocorreria lise das células devido a entrada excessiva de água por osmose.
15
Adicionar solução salina (0,9%) no tubo de ensaio contendo os microrganismos isolados e agitar
Flambar os bocais das vidrarias com o auxílio do bico de Bunsen
Transferir a solução salina com os esporos de Aspergillius awamori para o Erlenmeyer
Manter em estufa a 35°C por uma semana (cultivo da colônia)
Obtenção do inóculo no meio de cultivo sólido
 Tween 80 - detergente que gera bolha no inoculousado para auxiliar na etapa de quantificação ajudando os esporos a se separarem e ficarem mais lisos 
16
Flambar o erlenmeyer contendo os esporos e o a solução salina
Flambar um novo erlenmeyer vazio
Transferir a solução contendo os esporos no novo erlenmeyer vazio
Flambar o erlenmeyer contendo a solução salina (0,9% NaCl + Emulsifier Tween 80 com esferas de vidro) 
Flambar o erlenmeyer com os esporos cultivados em meio sólido
Transferir a solução salina para o Erlenmeyer com os esporos cultivados no meio sólido e agitar para que o atrito solte os esporos na solução (atrito entre esferas de vidro)
Juntar todos os esporos cultivados pelos grupos em laboratório
 
Quantificação dos esporos 
Câmaras de contagem: Camâra de Neubauer
a) Lâmina de vidro grossa retangular com uma cavidade central de 0,1 mm abaixo do nível das laterais
b) Superfície da cada metade da plataforma central existe um quadrado dividido em 25 quadrículos.
c) Um quadrículo contém 16 retículos, total de 400 retículos. 
Área de um retículo: 1/400 mm2 
Volume de um retículo: 1/4000 mm3 
Quantificação dos esporos 
Quadrículo
Retículo
Possível erro considerado: podemos contar os microorganismos viáveis e não viáveis, sendo que apenas queremos os viáveis, pois são aqueles que conseguem se reproduzir.
18
Solução preparada e diluída
Posicionar a camâra de contagem de Neubauer no suporte para amostra do microscópio
Focalizar utilizando a objetiva do microscópio que oferece o menor aumento (objetiva de 10 vezes)
Após focalizar, alterar para a objetiva com aumento que permita uma visualização adequada do microorganismo.
Contar o número de microorganismos em 5 quadrículos (80 retículos) 
Quantificar de acordo com as equações a seguir 
Cálculo do número de esporos por retículo contado (N):
Cálculo da concentração de esporos (C):
Onde: 
C – concentração de esporos (número de esporos /mL);
N – número de esporos por retículo contado;
V – volume de suspensão em um retículo (1/4000mm³);
D – diluição da amostra. 
 
19
Obtenção do inóculo no meio de cultivo aquoso
Cultivo submerso
Cultivo estático
Juntar a fonte de carbono aos nutrientes de forma asséptica
Colocar aproximadamente 20 mL do inóculo 
Colocar em um erlenmeyer no incubador rotativo (35°C, 48 horas e 200 rpm)
Juntar a fonte de carbono aos nutrientes de forma asséptica
Colocar aproximadamente 20 mL do inóculo 
Colocar o erlenmeyer em uma estufa (35°C a 48 horas)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Concentração de esporos
Bancada 1 
Bancada 2 
Bancada 3 
Média 
Bancada 4 
Um número de esporos por quadrículo maior que 30 torna necessária uma diluição da amostra e a repetição da contagem. Apesar de ter sido obtido um valor superior a 30 seguiu-se a análise sem este procedimento. 
A diferença do número total de esporos para cada bancada se dá por conta da homogeneização.
22
11
80
89
88
172
Concentração do inóculo
Cálculo da concentração de esporos no volume dos microrganismos juntos à fonte de carbono e nutrientes.
23
Resultados e discussão
Meio de cultivo não esterilizado:
Não houve inoculação do A. awamori, ocorrendo o crescimento de microrganismos indesejáveis no meio.
Meio aquoso estático:
O crescimento ocorreu apenas na superfície do meio, onde havia oxigênio concentrado. Observou-se a presença de esporos com hifas.
Meio aquoso submerso:
Crescimento de microrganismos em todo o meio, fato este devido há oxigenação gerada a partir da agitação no recipiente. Formação de pellets a partir de hifas soltas e emaranhadas sem a ocorrência de esporos.
CONCLUSÕES
Conclusões
 É fundamental que seja realiza a esterilização do meio de cultivo para que não haja microorganismos indesejáveis que inibam o crescimento da espécie de interesse;
 O cultivo submerso é mais eficiente em relação ao estático, visto que o microorganismo se desenvolve por todo o volume do meio de cultivo;
 Após a análise das três fontes de carbono (glicose, sacarose e amido), podemos concluir que o amido é a melhor fonte de carbono, visto que o mesmo é sintetizador da enzima glicoamilase.
16
*
5
88
=
N
retículo
esporos
N
/
1
,
1
=
D
V
N
C
=
1
10
.
4
1
1
,
1
6
=
C
mL
esporos
C
/
10
.
4
,
4
6
=
)
.(
.
2
1
1
1
V
V
C
V
C
inóculo
+
=
mL
esporos
C
C
inóculo
inóculo
/
10
.
0
,
4
)
200
20
.(
20
.
10
.
4
,
4
5
6
=
+
=
mL
V
mL
V
200
20
2
1
=
=