Metabolômica de Plantas: Métodos e Desafios

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RELATÓRIO DE ARTIGO CIENTÍFICO 
 
Metabolômica de Plantas: Métodos e Desafios 
 
 
 
 
Estagiário: Jorge Luis da Silva Azevedo 
Orientador: Dr. Guilherme Julião Zocolo 
 
 
Fortaleza-CE 
25 de julho de 2020 
 
Metabolômica de Plantas: Métodos e Desafios  
Link:​http://static.sites.sbq.org.br/quimicanova.sbq.org.br/pdf/RV2019-0431.pdf 
  
1 - Introdução  
  
A metabolômica pode ser considerada como a ciência que investiga a                     
totalidade da expressão qualitativa e quantitativa do metabolismo primário e                   
secundário dos organismos, assim como estabelece que o seu entendimento ocorre                     
através da análise comparativa de perfis metabólicos entre indivíduos e/ou                   
populações sujeitos às diferentes condições genéticas, ambientais ou patológicas.                 
Em plantas, a maioria dos experimentos em metabolômica são realizados                   
utilizando da combinação de ferramentas analíticas de separação e detecção,                   
conhecidas como abordagens hifenadas ou acopladas. Entretanto, é importante                 
saber que se trata de uma tarefa difícil, devido ao conjunto de metabólitos da                           
planta ter uma alta complexidade.  
Nesse contexto, dentre as combinações mais utilizadas no estudo                 
metabolômico de plantas, estão as técnicas de separação cromatográfica                 
(cromatografia líquida e gasosa) acopladas a detectores de ultravioleta ou                   
espectrometria de massas, como por exemplo a CLAE-UV-DAD, CLAE-EM ou CG-EM.                     
Somado a isso, a ressonância magnética nuclear (RMN) vem sendo empregada tanto                       
para a elucidação estrutural de moléculas previamente isoladas e purificadas,                   
quanto para o estudo de frações enriquecidas ou mesmo extratos brutos de alta                         
complexidade.   
As etapas que compõe o estudo metabolômico de plantas são as seguintes:                       
planejamento experimental, pré-processamento, aquisição de dados, identificação             
de marcadores, análise e interpretação de dados. As comunidades científicas que                     
tratam desse ramo têm-se mobilizado para a criação de protocolos que auxiliem a                         
execução, validação e a troca de informações inter ou intra-laboratoriais.   
  
2- Planejamento Experimental  
http://static.sites.sbq.org.br/quimicanova.sbq.org.br/pdf/RV2019-0431.pdf
 
  
Em metabolômica, os planejamentos experimentais devem ser elaborados               
contextualizando todo o conjunto de etapas do estudo uma vez que cada escolha                         
interfere nos resultados e suas interpretações. De uma forma geral, os PE indicam                         
as condições mais favoráveis para um estudo metabolômico onde serão                   
previamente selecionados o tamanho da amostra a ser estudada, as condições                     
ambientais a qual ela está submetida, o tipo de solvente adequado para ser usado                           
na extração entre outras variáveis.  
Portanto, os planejamentos experimentais arranjam sistematicamente o             
conjunto de variáveis dentro de um espaço amostral delimitado, diminuindo o                     
número de experimentos e maximizando a extração de informações, como                   
interações entre variáveis e a distribuição dos efeitos. Sendo de suma importância                       
antes de iniciar um estudo metabolômico. 
 
3- Amostragem 
 
No momento de escolhermos nossa população de planta para estudo,                   
devemos estar atentos a forma como será feita a coleta, a secagem e                         
homogeneização e o processo de extração, para não nos depararmos com                     
resultados tendenciosos e consequentemente erros de interpretação.  
Com base nisso, primeiro precisamos ter uma coleta de amostras bem feita                       
e previamente planejada levando em conta fatores como: condições físicas,                   
químicas, biológicas e geográficas. É muito importante saber se se a planta foi                         
cultivada em casas de vegetação, herbários ou reservas; e tratando-se de coleta de                         
campo, o monitoramento e conhecimento do clima ao qual o organismo foi exposto                         
ao longo do tempo é fundamental. Uma vez coletado o material vegetal, a                         
atividade enzimática deve ser inibida de imediato para garantir a integridade                     
metabólica. Em pequenos órgãos, tecidos dissecados ou até pequenas plantas                   
inteiras, utiliza-se de choques térmicos para a desnaturação de proteínas.  
A secagem e homogeneização consiste no processo de remoção de água por                       
meio de estufas ou liofilização. Sequencialmente, a etapa de extração determina o                       
 
intervalo ou cobertura química, considerando aspectos de polaridade e                 
solubilidade dos metabólitos a serem detectados pelas técnicas analíticas. As                   
extrações por solventes orgânicos constituem a melhor escolha em estudos                   
metabolômicos devido a eficiência e compatibilidade com as principais                 
plataformas analíticas, como CLAE-EM, CG-EM e RMN.  
 
4- Pré-tratamento de Amostras e Aquisição de Dados 
 
Nessa etapa, é onde escolhemos a seleção do método analítico para                     
empregar nos extratos obtidos. É importante a escolha de uma técnica                     
reprodutível, simples e rápida, permitindo a detecção de analitos em diferentes                     
concentrações. Antes de submeter os extratos aos métodos analíticos, é preciso                     
realizar a remoção de interferentes da amostra através de extração em fase sólida                         
(SPE - ​solid-phase extraction​), assim como remover interferentes dos solventes a                     
serem usados. Por exemplo, para CLAE usamos filtros PTFE hidrofílica de 0,45 e                         
0,22 micrômetros para filtrar o solvente utilizado.   
Devido à falta de uma técnica capaz de analisar todo o conteúdo do                         
metaboloma, diversos métodos analíticos vêm sendo empregados             
complementarmente, com o objetivo de se minimizar as deficiências individuais                   
das ferramentas analíticas, e assim aumentar o nível de separação, detecção,                     
estabilidade, resolução, sensibilidade, velocidade e a amplitude do intervalo                 
dinâmico de detecção. As técnicas abordadas neste relatório serão aquelas                   
presentes no Laboratório Multiusuário de Química de Produtos Naturais, às quais                     
estamos habituados. 
 
● Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (CLAE-EM) 
 
Essa é a técnica analítica de separação considerada a mais recente para a                         
aquisição de perfis cromatográficos, podendo ser acoplada a diferentes                 
analisadores e detectores. O processo de separação em CLAE procede através dos                       
diferentes estados de equilíbrio entre analito e as fases móvel (solventes orgânicos                       
 
e aquosos) e a estacionária (coluna cromatográfica). Nosso equipamento utiliza o                     
analisador do tipo ​time of flight (ToF), que obtém espectros de alta resolução e                           
determina fórmulas elementares a partir dos valores de massa/carga dos íons                     
detectados, tornando mais eficiente o processo de identificação e quantificação de                     
metabólitos.  
● Ressonância Magnética Nuclear (RMN) 
 
Nesse método, temos análises qualitativas e quantitativas altamente               
reprodutível e não seletiva,ou seja, não depende das características químicas dos                       
compostos observados, como polaridade e acidez (pKa). O principal objetivo da                     
RMN é a elucidação estrutural de compostos, tanto de metabólitos primários                     
quanto secundários, assim como a comparação direta das suas concentrações.  
 
5- Pré-processamento e Processamento dos Dados 
 
O pré-processamento dos dados é uma etapa intermediária entre a aquisição                     
dos dados obtidos através da metodologia analítica escolhida e a análise                     
estatística. Ela visa melhorar a qualidade dos sinais e reduzir a interferência de                         
ruídos, tornando os dados comparáveis entre si. Algumas funções de                   
pré-processamento são específicas para cada técnica analítica: para os dados                 
cromatográficos e de espectrometria de massas, melhoramos os resultados através                   
da filtração de ruídos no cromatograma (​denoisesing​), alinhamento de sinais,                   
detecção de picos e normalização. Tudo isso feito através de ​softwares avançados.                       
Já para os dados de RMN temos o pré-processamento do decaimento indutivo livre                         
(FID), referenciamento e faseamento, correção da linha de base (​smoothing​),                   
alinhamento, ​binning/bucketing​, deconvolução e normalização. Assim como o               
pré-processamento dos dados do cromatograma, todas essas etapas para a RMN                     
também podem ser realizadas por programas computacionais. 
Quanto ao processamento de dados, temos as técnicas de centralização e                     
escalonamento como uma prática comum. A centralização na média, ou seja,                     
procedimento em que a média de um sinal (intensidade de um íon, ou sinal de                             
 
RMN) obtida a partir de um conjunto de amostras é subtraída de cada sinal das                             
amostras, é realizada a fim de remover a compensação dos dados e focar na                           
variação biológica, como as similaridades e discrepâncias entre as amostras. Os                     
métodos de escalonamento são empregados a fim de extrair adequadamente                   
informações mais precisas, como o auto-escalonamento, onde é dado pesos iguais                     
a todos os sinais da amostra para se ter uma equivalência entre metabólitos                         
majoritários e minoritários e ambos contribuir igualmente para o ajuste.  
As análises quimiométricas são importantes métodos estatísticos que visam                 
aprimorar as interpretações do estudo metabolômico, podem ser               
não-supervisionadas - visando o entendimento global dos dados - e supervisionadas                     
- as amostras são associadas a um valor de atributo -. Dentre elas se destacam a                               
Análise de agrupamentos hierárquicos (HCA)​, uma análise não-supervisionada em                 
que consiste no agrupamento de amostras de acordo com sua similaridade; e a                         
Análise supervisionada, que visa comparação de resultados para atividade                 
biológica.  
As comunidades científicas têm proposto medidas alternativas e racionais                 
para o processo de anotação molecular, visando flexibilizar o refinamento da                     
anotação de acordo com os tipos e objetivos de cada estudo metabolômico, uma                         
vez que os metabólitos secundários possuem natureza muito diversificada e                   
complexa.