ok metabolomic_3 arbovirus_2019 traduzido

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Informações metabolômicas sobre as infecções arbovirais humanas: dengue, chikungunya e zika
Traduzido por Camila Amato Montalbano
(Este texto trata-se apenas de uma tradução fidedigna ao artigo original com o intuito de ajudar estudantes e pesquisadores que possuem dificuldade com a língua inglesa. Há partes grifadas em amarelo, as quais foram consideradas importantes e foram destacadas por este motivo)
Dados do artigo original em inglês e autores:
Metabolomic Insights into Human Arboviral Infections: Dengue, Chikungunya, and Zika Viruses
Nathaniel M. Byers 1, Amy C. Fleshman 1, Rushika Perera 2 and Claudia R. Molins 1,*
1 Division of Vector-Borne Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, Fort Collins, CO 80521, USA;
ngv8@cdc.gov (N.M.B.); muj3@cdc.gov (A.C.F.)
2 Arthropod-borne and Infectious Diseases Laboratory, Department of Microbiology, Immunology &
Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO 80523-1692, USA; Rushika.Perera@colostate.edu
* Correspondence: CMolins@cdc.gov
Received: 31 January 2019; Accepted: 21 February 2019; Published: 6 March 2019
Resumo
A carga global de doenças arbovirais e as limitações em controlá-las despertam a necessidade de métodos inovadores para entender as infecções por arbovírus. A metabolômica é aplicada para detectar alterações na fisiologia do hospedeiro durante a infecção. Esta abordagem se baseia em espectrometria de massa ou espectroscopia de ressonância magnética nuclear para avaliar como as perturbações em sistemas biológicos alteram vias metabólicas, permitindo a diferenciação de condições intimamente relacionadas. Devido aos vírus dependerem fortemente dos recursos e vias do hospedeiro, eles apresentam desafios únicos para caracterizar alterações metabólicas. Aqui, nós revisamos a literatura sobre metabolômica de arbovírus e nos concentramos em a interpretação das características moleculares identificadas. A metabolômica revelou biomarcadores que diferenciam estados de doenças e os resultados mostram semelhanças nas alterações metabólicas causadas por vírus diferentes (por exemplo, metabolismo de lipídios). Pesquisadores que investigam tais alterações metabolômica visam compreender melhor a dinâmica vírus-hospedeiro, identificar características moleculares úteis para o diagnóstico, discernir vias perturbadas para a terapêutica e orientar futuras pesquisas bioquímicas. Esta revisão concentra-se em lições derivadas de estudos metabólicos em amostras de humanos infectados por arbovírus.
Palavras-chave: arbovírus; metabolômica; metabolismo; alfavírus; flavivírus; lípidios
Introdução
Metabólitos são os produtos a jusante de enzimas e vias celulares e fornecem uma janela para o estado bioquímico das células em condições variadas. Um metabólito é uma pequena molécula sintetizado por processos catabólicos ou anabólicos. A metabolômica é o estudo sistemático dessas pequenas moléculas, incluindo aminoácidos, lipídios, nucleotídeos, açúcares, hormônios e vitaminas; virtualmente todos compostos orgânicos encontrados em um organismo, exceto DNA, RNA e proteínas [1,2]. Metabolômica as análises podem ser realizadas em qualquer biofluido, bem como nos tecidos ou mesmo na respiração [1–3].
A triagem da abundância de metabólitos no sangue de recém-nascidos permitiu aos médicos melhorar os efeitos potencialmente devastadores de erros inatos do metabolismo desde 1960, reduzindo o tempo para diagnosticar e tratar esses distúrbios que ocorrem em milhares de crianças por ano [4,5]. Aplicando técnicas de espectrometria de massa (MS) direcionadas, 49 erros inatos do metabolismo podem ser identificados em nascimento [6]. Este programa de grande sucesso demonstra claramente a utilidade de detectar anormalidades nas concentrações de pequenas moléculas, e que os dados metabolômicos podem fazer a transição para práticas de testes de diagnóstico. Como erros inatos do metabolismo, os arbovírus esgotam pequenas moléculas particulares durante a infecção em alguns e causam aumento dos níveis emoutras pessoas - geralmente mediadores da inflamação. Elucidando alterações metabólicas em estados de doença, a metabolômica pode fornecer insights sobre moléculas terapêuticas que poderia inibir a multiplicação do vírus ou diminuir os sintomas de doenças virais. Além disso, as mudanças em abundâncias de metabólitos podem ser exploradas como ferramentas de diagnóstico e prognóstico para doenças arbovirais.
1.1. Arbovírus
Os arbovírus são, por definição, transmitidos aos hospedeiros vertebrados por meio de artrópodes, que incluem mosquitos, carrapatos ou pulgas. Eles circulam entre hospedeiros vertebrados e invertebrados para sobreviver, e em geral, não são efetivamente passados ​​horizontalmente em um tipo de hospedeiro [7,8]. Esta revisão se concentra em arbovírus nas famílias Flaviviridae e Togaviridae, a saber, vírus da dengue (DENVs), vírus Zika (ZIKV) e vírus chikungunya (CHIKV), visto que são as infecções arbovirais humanas investigadas por técnicas metabolômicas até o momento. Esses vírus têm faixas geográficas sobrepostas e inicialmente surgiram na África antes de se espalhar para outros continentes [9-12]. Vetorizado pelos mosquitos do gênero Aedes, esses arbovírus infectam coletivamente milhões de pessoas por ano [9-12]. Já que eles podem frequentemente causam sintomas clínicos semelhantes e inúmeras complicações, diagnósticos rápidos e precisos para tratamento e prognóstico de infecções arbovirais são imperativos [10,13]. Ambos flavivírus e togavírus são vírus envelopados com genomas de RNA de fita simples de sentido positivo de aproximadamente 11–12 quilobases [14]. A replicação do genoma ocorre via RNA polimerase dependente de RNA viral em Esférulas de replicação ligadas à membrana conectadas ao citoplasma, mas protegidas por células de defesa [15]. Como resultado, esses vírus alteram significativamente o ambiente metabólico do hospedeiro para suas vantagem replicativas. As vias metabólicas do hospedeiro manipuladas por vírus dependem do ciclo de vida do vírus, as defesas imunológicas ativadas, bem como os tecidos e tipos de células infectadas [16,17]. Pesquisas de metabolômica de arbovírus identificou lipídios de membrana induzidos por DENVs para replicação e também detectou alterações inflamatórias do hospedeiro e alterações metabólicas lipídicas virais [18-20]. Comparando pacientes infectados com DENVs pacom pacientes febris que têm doenças não causadas por identificados por DENVs, é possível melhorar o diagnóstico clínico de DENVs através da descoberta destes metabólitos [21,22]. Bioassinaturas prognósticas que separam graves formas de dengue de formas mais leves foram desenvolvidas [21-24]. Estudos metabolômicos sugeriram que prescrever ácido úrico ou dihomo-ácido linolênico (DGLA) pode melhorar a doença da dengue [24,25]. Outro estudo relacionou os metabólitos alterados aos sintomas da infecção por CHIKV [26]. Moléculas alteradas durante a infecção por ZIKv, envolvia autofagia e complicações potencialmente neurológicas associadas a formas graves desta doença, tudo também identificadado por técnicas metabolômicas [27,28]. Estes estudos demonstraram o potencial real da metabolômica para elucidar as interações vírus-hospedeiro para auxiliar na desenvolvimento de tratamentos antivirais e sintomáticos, bem como testes prognósticos ou diagnósticos.
1.2. Metabolômica
As análises metabolômicas de vírus apresentam desafios únicos, uma vez que esses patógenos carecem de um
metabolismo independente e deve, em vez disso, comandar os recursos do hospedeiro [16,17,29]. Arbovírus induzem
respostas fortes do hospedeiro, e o grande número de células infectadas por vírus torna-se aberrante níveis de metabólitos. A metabolômica é uma ferramenta poderosa para estudar infecções naturais in situ, pois fornece um meio para investigar grandes mudanças durante a infecção humana, sem a necessidade de um sistema-modelo. Os estudos de metabolômica muitas vezes visam identificar biomarcadores, que são compostos correlacionados a um
estado ou condição de doença particular. Umabioassinatura, ou assinatura metabólica, é um conjunto de biomarcadores que distingue uma doença particular do estado saudável ou doenças relacionadas. 
Dependendo dos motivos e objetivos finais, os estudos de metabolômica geralmente seguem o mesmo fluxo de trabalho e pode ser dividido em duas categorias principais: estudos não direcionados (untargeted) e estudos direcionados (targeted)(Figura 1). Estudos não direcionados são baseados em descobertas e buscam um quadro amplo e abrangente de metabólitos presentes em um sistema em um determinado momento, incluindo metabólitos identificados e desconhecidos. Em contraste, os estudos direcionados visam validar e quantificar metabólitos predefinidos específicos, assim requerendo mais conhecimento prévio[1]. Um projeto experimental cuidadoso é necessário para ambos os e estudos. A preparação da amostra antes da análise varia de acordo com o tipo de amostra e requer premeditação para efetivamente interromper a atividade enzimática, prevenir a perda ou degradação de metabólitos, e extraia metabólitos de forma otimizada. Os procedimentos para extração de metabólitos foram abrangentes detalhado em outros trabalhos [30–33].
Figura 1. Estudos de metabolômica do fluxo de trabalho. Amostras usadas para análises metabolômicas, a maioria comumente soro ou urina, devem ser cuidadosamente coletados, armazenados e caracterizados para confirmar estado de infecção e associação ao grupo. Os metabólitos são então extintos e extraídos para análises de ressonância magnética (NMR) ou espectrometria de massa (MS). Técnicas comuns de MS incluem espectrometria de massa de injeção direta (DIMS), espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) e cromatografia gasosa - espectrometria de massa (GC-MS). Métodos analíticos geram dados que devem ser alinhados, extraídos, corrigidos e filtrados para obter características moleculares. Identificação de metabólitos e análises de vias fornecem informações sobre as vias perturbadas durante um estado de doença. Análise Estatística, como análise de componente principal (PCA) e análise discriminativa de mínimos quadrados parciais (PLS-DA), diferenciam e classificam ainda mais as amostras e identificam potenciais candidatos a biomarcadores. Uma vez elucidados vias e potenciais biomarcadores, verificações secundárias, como análises, são frequentemente realizadas para confirmar e investigar mais as conexões biológicas, modos de ação, ou potencial terapêutico de biomarcadores identificados.
Os métodos de preparação e extração da amostra dependem da escolha do método analítico. Por exemplo, a lipidômica, um subtipo de metabolômica com foco em espécies de lipídeos, muitas vezes requer extração especializada e técnicas analíticas. Metabólitos são mais frequentemente analisados ​​usando espectroscopia de ressonância magnética (NMR) ou técnicas baseadas em MS. Espectroscopia de NMR, com base em excitar as transições entre os estados de rotação dos núcleos magnéticos [34]: é rápido, quantitativo e altamente reproduzível em uma variedade de sistemas [35–37]. As vantagens adicionais da espectroscopia de NMR incluem preparação mínima de amostra, métodos não destrutivos e a capacidade de realizar uma detecção abrangente de metabólitos com uma única medição [35]. Apesar de muitas vantagens, a espectroscopia de NMR tem várias limitações, como sua baixa sensibilidade e seletividade em comparação aos métodos baseados em MS [38], bem como uma capacidade limitada para abordagens direcionadas com as técnicas atuais [35]. Proton NMR (1H NMR) é um dos métodos espectroscópicos de NMR mais comuns devido ao curto tempo analítico e sensibilidade relativamente alta em comparação com outros métodos de NMR [39].
MS é uma abordagem comum para estudos direcionados e não direcionados, apresentando maior sensibilidade e seletividade, bem como a capacidade de detectar mais metabólitos em uma única execução do que NMR espectroscopia [35]. Injeção direta (também chamada de infusão) MS (DIMS) é de alto rendimento como amostras são injetados diretamente em um espectrômetro de massa, reduzindo o tempo de análise e o viés [40]. Limitações de DIMS incluem supressão de íons e formação de resíduos dentro do instrumento, embora ensaios adicionais de MS possam superar essas limitações [41,42]. Para melhorar a resolução, o MS é frequentemente combinado com um método de separação cromatográfica, como cromatografia líquida (LC) ou cromatografia gasosa (GC) para separar os componentes da mistura e simplificar a identificação do metabólito [38]. LC-MS e GC-MS geralmente requerem uma preparação de amostra mais trabalhosa do que DIMS ou NMR e incluem adaptações para compostos que são difíceis de ionizar [38]. GC-MS só pode analisar compostos voláteis e frequentemente requer derivatização de metabólitos [43]. LC-MS é capaz de separar e detectar uma grande variedade de moléculas e, portanto, geralmente bem adequado para análises globais de moléculas biológicas. A maioria método LC-MS comum é LC-MS de fase reversa (RPLC-MS), que é adepto de separar a maioria compostos semipolares, mas não é adequado para moléculas altamente polares ou iônicas [35,44]. Contudo, técnicas como cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) podem aumentar a sensibilidade para analisar metabólitos polares [45]. Experimentos direcionados podem incluir monitoramento de múltiplas reações (MRM), que detecta e quantifica analitos de uma massa específica [46] e incorpora curvas padrão para quantificar metabólitos e confirmar entidades por meio de comparação com padrões. Métodos Alvo (targeted) detalhados foram revisados ​​anteriormente em outros trabalhos[1,47,48].
Após a aquisição de dados, os dados espectrais são pré-processados ​​de acordo com o método analítico, e as características moleculares são então extraídas e identificadas. Análises estatísticas de dados metabolômicos são realizados para avaliar as diferenças entre os grupos de amostra, identificar metabólitos diferenciais e classificar as amostras com base nesses metabólitos. As análises estatísticas normalmente incluem ambas abordagens não supervisionados, como análises de agrupamento e análise de componentes principais (PCA), que procuram compreender a variação e as tendências nos dados e abordagens supervisionadas e análises quadradas discriminantes (PLS-DA), que podem identificar biomarcadores e prever ou classificar amostra de membros do grupo [49]. Uma vez que os biomarcadores putativos tenham sido identificados e estatísticos e análises de significância foram realizadas, interpretações funcionais elucidam conexões biológicas entre metabólitos e identificam vias metabólicas perturbadas. Ferramentas de análise destas vias pertubadas incluem MetaboAnalyst [50], Mummichog [51], Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [52], e MetaCyc [53], entre outros [54]. Esforços para a compreensão biológica de dados da metabolômica requerem que características moleculares sejam identificadas como metabólitos por meio de sondagem de bancos de dados existentes, como como METLIN [55], o Human Metabolome Database (HMDB) [56-58], MassBank [59] e LIPID MAPS [60]. Identificar vias perturbadas e metabólitos específicos pode ser desafiador, particularmente ao realizar análises untargeted, portanto, uma verificação adicional, geralmente por MS em tandem, é necessária. Explicações biológicas para os resultados fornecem confiança adicional aos resultados da metabolômica. Ferramentas adicionais de software para processamento e análise de dados metabolômicos são detalhadas em outros trabalhos [61-66].
Embora nenhuma plataforma ou metodologia analítica seja capaz de detectar e quantificar todos os componentes de uma amostra, algumas plataformas são mais adequadas para certos metabólitos, tipos de amostra, ou resultados de estudo desejados. Independentemente da abordagem escolhida, é crucial minimizar a variação em cada etapa do fluxo de trabalho. Estabelecer e seguir procedimentos operacionais padrões reduz viés na preparação e processamento da amostra [67].A variação nas amostras biológicas é generalizada e enquanto algumas variáveis, como idade e sexo do paciente, produzem diferenças reais e interessantes em dados metabolômicos, algumas variáveis, como tempo de amostragem do paciente, dieta e medicamentos, produzem artefatos irrelevantes que podem afetar fortemente os dados e distorcer os resultados. Para dar conta da última variação, é necessário "normalizar" os dados, removendo efetivamente vieses desnecessários, preservando a autêntica variação biológica. Embora não haja um método de normalização padrão, a maioria dos métodos se enquadra em duas categorias amplas: normalização por meio da inclusão de padrões para controles de qualidade interno e/ou externo [68] que são executados e processados ​​junto com outras amostras, e normalização por escala de dados e métodos estatísticos [69-73]. Além disso, os estudos metabolômicos normalizam os dados comparando os grupos de interesse para um grupo de controle. Os grupos devem ter números de amostra suficientes para compensar variação individual e descobrir metabólitos que separam grupos legitimamente. 
A padronização nos resultados dos relatórios é outro fator crítico para uma interpretação precisa dos dados metabolômicos. A Metabolomics Standards Initiative (MSI), criada para orientar analíticas técnicas e práticas de relatório, é um excelente passo em direção à padronização dos métodos da metabolômica [74]. No entanto, o MSI não é abrangente e exigirá atualizações adicionais à medida que o campo progride [74].
A interpretação dos dados metabolômicos requer, como em todas as etapas do fluxo de trabalho, discrição aguda e atenção aos detalhes. Idealmente, as identidades dos metabólitos são confirmadas, muitas vezes por MS em tandem (MS / MS) [75]. Devem ser usadas técnicas ortogonais para validar a abundância de metabólitos. Muitos dos mesmos metabólitos são perturbados por doenças não relacionadas devido às vias comuns do hospedeiro alteradas por diferentes patógenos. No entanto, os níveis de metabólitos sobrepostos muitas vezes diferem durante o curso de infecção e requerem investigação mais aprofundada para compreender os processos de infecção e sua progressão.
2. DENV
Os DENVs estão entre os arbovírus mais importantes do ponto de vista clínico, pois infectam 390 milhões de pessoas por ano e causa cerca de 9.000 mortes em todo o mundo [12,76]. DENVs têm quatro sorotipos, numerados um a quatro. A infecção com um sorotipo não fornece imunidade à infecção com outros sorotipos. As doenças causadas por esses vírus variam de infecção assintomática a letal. Dengue (DF) é uma doença febril aguda de cinco a sete dias caracterizada por dores de cabeça, bem como articulações, músculos e dor óssea [77]. A maioria dos pacientes se recupera do DF. A infecção subsequente com um segundo sorotipo pode resultar em uma forma mais grave da doença, a Febre Hemorrágica da Dengue (FHD), que é caracterizada por vazamento de plasma nas cavidades pleural e abdominal [77]. Embora classificado como doenças diferentes, A DHF mimetiza os sintomas do DF no início da infecção [77]. O pior subconjunto de casos de dengue hemorrágica é denominado Síndrome do Choque da Dengue (DSS- Dengue Shock Syndrome), na qual o paciente desenvolve hemorragia e hipotensão profunda. Pacientes com DHF / DSS grau IV têm pressão arterial e pulso indetectáveis ​​e estão em sério risco de morrer [77]. Essas categorias de doenças são baseadas nos critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS) 1997, que foram aprimorados em 2011 [77,78]. Embora a DHF possa ser causada por infecção primária, a DHF e DSS são principalmente devido ao aumento dependente de anticorpos da entrada viral durante o período secundário infecção [14,77].
2.1. A infecção com DENVs altera a composição da membrana celular (glicerofosfolipídios e esfingolipídios)
Os DENVs induzem alterações em muitos lipídios do hospedeiro, incluindo ácidos graxos, glicerolipídios, glicerofosfolipídios e esfingolipídios. Um ácido graxo é um ácido carboxílico com uma cadeia alifática de carbonos que é tipicamente não ramificada e tem 4-28 carbonos de comprimento [79]. As cadeias de carbono podem ser insaturadas (contendo ligações duplas) ou saturado (sem ligações duplas). Os ácidos graxos podem existir livres ou esterificados em moléculas maiores (Figura 2).
Figura 2. Estruturas lipídicas. As convenções de nomenclatura LIPID MAPS indicam "átomos de carbono": "ligações duplas" (localização e conformação de ligações duplas) [80]. Fosfatidilcolina (PC) é composta por duas caudas lipídicas esterificado em glicerol 3-fosfato com um grupo de cabeça de colina. Os carbonos estereoespecíficos do glicerol são numerados sn-1, sn-2 e sn-3 [81]. Fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS) e os fosfatidilinositol (PI) têm a mesma estrutura, mas com grupos principais alternativos. Ceramida (Cer) contém um esqueleto esfingosina e um grupo ácido graxo. Esfingomielina é Cer com uma fosfocolina ou grupo cabeça fosfoetanolamina. O "d" no nome indica que estes têm 1,3-dihidroxi espingardas de esfingosina. 
Fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS) e esfingomielina (SM) são os principais componentes das membranas celulares (abreviaturas listadas na Tabela 1) [82]. PC, PE, PI e PS são glicerofosfolipídios com um 3- esqueleto de fosfoglicerol esterificado a um par de ácidos graxos com o sítio sn-2 enriquecido em insaturações com ácidos graxos [81,83,84]. Dentro dessas classes de moléculas, as espécies variam de acordo com o comprimento e a saturação de suas caudas ácidas gordurosas. As caudas lipídicas podem ser ligadas por éter em vez da ligação éster prototípica. Os lisofosfolipídios (LPL) são variantes dos glicerofosfolipídios que possuem uma cadeia de ácidos graxos hidrolisados, geralmente pela fosfolipase A2, então apenas um permanece.
Estudos metabolômicos em pacientes com dengue revelaram alterações nos glicerofosfolipídios e esfingolípidos (Tabela 2). O primeiro estudo metabolômico em soros humanos de pacientes infectado com DENV1-3 identificou níveis diminuídos de PC, lisofosfatidilcolinas (LPC) e lisofosfatidiletanolaminas (LPE) e níveis aumentados de SM (d18: 1/18: 1 (9Z)) em relação aos pacientes saudáveis do grupo controle [20]. Níveis aumentados de SM correlacionados com contagens de linfócitos e níveis de LPE diminuídos positivamente correlacionada com a contagem de plaquetas. O tempo dessas mudanças conectou SM elevado com resposta inicial do hospedeiro enquanto os níveis aumentados de LPE se correlacionam com respostas posteriores e, portanto, esses lipídios podem ter potencial como biomarcadores prognósticos [20]. Khedr et al. [85] também encontraram quatro dos mesmos LPCs diminuídos de forma semelhante durante a infecção com DENVs em soros adultos em relação aos controles saudáveis. LPCs também demonstrou ter potencial prognóstico em uma coorte de crianças na Nicarágua com DENV2 [22]. Neste estudo, os pacientes que tiveram DHF apresentaram níveis mais elevados de LPCs do que os controles sem dengue [22]. LPCs foram associadas ao aumento da permeabilidade endotelial, uma marca registrada de DHF / DSS [77,86]. A forma cônica de LPCs induz curvatura positiva da membrana, o que pode ser crucial para a funcionalidade do envelope de vírion ou formação de esférulas de replicação, visto que ambos são altamente curvos [87]. Outro trabalho identificou sete glicerofosfolipídios, incluindo PSs, PEs e LPEs que previram o início de DHF em adultos em Singapura [23]. Destas três classes, apenas os LPEs foram consistentemente diminuídos em pacientes com DHF; PSs e PEs foram aumentados ou diminuídos de acordo com sua acila graxa particular composição. Esses estudos demonstraram que os glicerofosfolipídios têm um potencial considerável como biomarcadores prognósticos que predizem a probabilidade de um paciente ter DHF.
Tabela 2. Metabólitos selecionados de publicações sobre infecções humanas com vírus da dengue (DENVs). Os metabólitos geralmente aumentadosna doença estão em vermelho, diminuídos os metabólitos estão em azul. Os metabólitos pretos têm resultados mistos na publicação correspondente. Se não for especificado, LC foi de fase reversa. Amino padrão de uma letra abreviaturas ácidas são usadas.
Os glicerofosfolipídios também podem diferenciar doenças virais. Khedr et al. [85] usou LC-MS / MS quantificar glicerofosfolipídios em soros de controles saudáveis ​​e pacientes com diagnóstico de DF, hepatite B ou hepatite C. Os autores atribuíram a diminuição de IPs e PE em pacientes DF comparados com controles saudáveis ​​para a ativação da fosfolipase A2 por DENVs, que os converteria em lisofosfatidilinositóis (LPI) e LPE [85,91]. Na verdade, a infecção por vírus aumentou a quantidade de LPI (16: 0), um produto potencial da atividade da fosfolipase A2 nos IPs. PSs e LPCs também foram menos abundante durante DF do que em controles saudáveis ​​[85]. Os níveis de vários PCs, PE (38: 4) e PS (36: 2) eram mais elevados e os níveis de LPCs foram mais baixos em pacientes com DF do que aqueles de pacientes com hepatite B ou C, diferenciando assim essas doenças virais [85].
Outro grupo, Melo et al. [89], encontraram sete PCs que estavam elevados no soro de infectados com DENV4 em pacientes no Brasil (dentro de quatro dias do início dos sintomas) em relação a controles saudáveis ​​usando DIMS e MS / MS. Devido a alguns dos PCs terem acilos graxos ligados a éter, os autores especularam que três dos PCs são precursores do fator de ativação plaquetária, que tem sido associado à trombocitopenia e permeabilidade vascular durante a infecção por DENV2 [89,92]. Alternativamente, os PCs podem contribuir para a formação das membranas esféricas virais [89]. 
Cui et al. [93] usaram metabolômica para validar um modelo de camundongo humanizado para infecção por DENV2 (Tabela 3). Eles descobriram que os SMs estavam elevados no soro dentro de sete dias da inoculação de DENV2, enquanto os glicerofosfolipídios, incluindo PE, LPE e PC, principalmente, diminuíram consistentemente como resulta em soros humanos do mesmo grupo [20,93]. Este estudo enfatizou o valor da metabolômica para avaliar amplamente um sistema modelo e compará-lo com a infecção humana [93].
Tabela 3. Metabólitos selecionados de artigos sobre infecção com DENVs em sistemas modelo e mosquitos. Os metabólitos geralmente aumentados na doença estão em vermelho, diminuídos os metabólitos estão em azul. Os metabólitos pretos têm resultados mistos na publicação correspondente. Se não for especificado, LC foi de fase reversa. Amino padrão de uma letra abreviaturas ácidas são usadas.
2.2. Os níveis de ácidos graxos são influenciados pela infecção com DENVs
Os glicerofosfolipídios fornecem um reservatório para ácidos graxos insaturados e o ciclo das Terras controla o equilíbrio de ácidos graxos livres e sua incorporação em glicerofosfolipídios [98]. Fosfolipase A2 cliva o grupo acil graxo do carbono sn-2 dos glicerofosfolipídios, liberando o ácido graxo que é frequentemente insaturado, como ácido araquidônico (AA), ácido docosahexaenóico (DHA) e ácido eicosapentaenoico (EPA) (Figura 3) [81,83,84]. Acilos graxos insaturados incorporados em glicerofosfolipídios influenciam as propriedades da membrana [83].
Figura 3. Metabolismo dos ácidos graxos. Os ácidos graxos são liberados dos glicerofosfolipídeos pelas fosfolipases produzindo lisofosfolipídios (LPL). Os ácidos graxos são então conjugados à coenzima A (CoA). A gordura acil é ligado a carnitina para transporte para a matriz mitocondrial, onde podem sofrer-oxidação gerando acetil-CoA. O acetil-CoA pode entrar no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) par gerar NADH que irá produzir trifosfato de adenosina (ATP) durante a fosforilação oxidativa, ou o acetil-CoA pode ser usado para construir novos ácidos graxos e glicerofosfolipídios. Os ácidos graxos podem também pode ser usado para remodelar glicerofosfolipídios no ciclo das Terras sem ser degradado [98].
No soro de pessoas com DF em Cingapura, AA, um ácido graxo pró-inflamatório, estava elevado durante as fases febril e defervescente [20]. AA compreende até 25% dos acilos graxos glicerofosfolipídios na célula [81]. Eicosanóides produzidos a partir de AA podem ser pró e antiinflamatórios e mediar a resposta geral [84,99]. Portanto, AA pode contribuir para os sintomas de DF e limitar multiplicação viral. Em contraste, o aumento das moléculas antiinflamatórias durante a fase febril de DF, incluindo DHA, inosina e cortisol, são provavelmente a parte amenizante da inflamação, embora esses metabólitos possam auxiliar na persistência viral [20]. Este estudo também detectou ácido -linolênico elevado (ALA), um ácido graxo dietético e um precursor do DHA, em soros humanos durante a infecção com DENV1-3 [20]. Voge et al. [22] descobriram que AA, DHA e ALA poderiam prever DHF, pois os níveis eram mais elevados em pacientes com DHF do que aqueles com DF em sua coorte de crianças na Nicarágua. Tanto Cui et al. [20,25] e Voge et al. [22] encontraram DHA aumentado em DF em adulto em comparação com controles saudáveis, mas diminuiu substancialmente DHA em adultos DHF / DSS em comparação com DF, um resultado marcadamente diferente do que o aumento de DHA encontrado em crianças na Nicarágua com dengue hemorrágica. Cui et al. [93] também encontraram aumento de AA, DHA e outros ácidos graxos no soro de camundongos humanizados infectados com DENV2. Esses estudos relacionam o metabolismo dos ácidos graxos aos sintomas induzidos por DENVs, o que implica que essa via pode ser um potencial alvo terapêutico.
2.3. A infecção com DENVs altera a utilização de glicerolipídeo
Os glicerolipídios podem ter um, dois ou três grupos acil graxos esterificados em uma estrutura de glicerol e são denominados mono-, di- e triacilgliceróis (ou triglicerídeos). O uso de glicerolipídeo é alterado em humanos durante a infecção com DENVs [24,88,89]. Níveis aumentados de quatro triacilgliceróis diferenciados em Pacientes infectados com DENV4 no Brasil durante doença febril ocorre em relação aos controles saudáveis ​​[89]. Esses glicerolipídios podem ser mobilizados para fornecer energia para a replicação viral ou acetil-coenzima A (acetil-CoA) para biossíntese de ácidos graxos novos [89]. Para estudar as alterações na composição de ácidos graxos contendo moléculas de acila durante o DF, Khedr et al. [88] usaram lipidômica GC-MS direcionada para analisar acilos graxos esterificados no Sangue. No soro, os acilos graxos esterificados são encontrados principalmente em ésteres de colesterol, triacilgliceróis e glicerofosfolipídios [100]. O sangue de pacientes com DF apresentou uma super reduzida da maioria dos acilos graxos targeted, em comparação com o sangue de controles saudáveis, consistente com glicerofosfolipídios séricos reduzidos observado durante a infecção por DENVs em Cui et al. [20] e Voge et al. [22,88]. Os acilos graxos testados por Khedr et al. [88] foram quimicamente derivados de lipídios no sangue total, ao contrário dos ácidos graxos livres que Cui et al. [20] e Voge et al. [22] testado em soros humanos. Este trabalho foi estendido por Villamor et al. [24], que analisou os níveis da maioria dos mesmos ácidos graxos quimicamente derivados de moléculas lipídicas maiores usando metabolômica de GC-MS direcionada para diferenciar prognosticamente DHF / DSS de DF. Os soros usados ​​foram coletados de pacientes com dengue colombianos dentro de 96 horas após o início da febre. Villamor et al. [24] descobriram que níveis elevados de DHA e AA e níveis mais baixos de DGLA e o ácido pentadecanóico em relação aos ácidos graxos totais indicou que o paciente provavelmente tinha DHF / DSS em vez de DF. Porque inibe a biossíntese inflamatória de eicosanóides, Villamor et al. [24] propôs DGLA como um potencial terapêutico contra DENVs. Este trabalho ajudou a quantificar as mudanças nos acilos graxos poliinsaturado que pode ser responsável por mediar as respostas inflamatórias durante a dengue grave.
2.4. Metabólitos associados à b-oxidação são perturbadosdurante a infecção com DENVs
Os ácidos graxos de ambos os glicerofosfolipídios e glicerolipídios podem sofrer oxidação para produzir acetil-CoA, que pode ser usado para a síntese de ácido graxo de novo, ou eles podem entrar no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) para gerar dinucleotídeo adenina nicotinamida reduzido (NADH), flavina reduzida dinucleotídeo de adenina (FADH2) e trifosfato de guanosina (GTP) [101]. O NADH passa por fosforilação oxidativa para gerar trifosfato de adenosina (ATP). Acilcarnitinas são intermediários para o transporte de ácidos graxos para oxidação na mitocôndria, e têm um grupo acil graxo esterificado à carnitina [101].
O soro humano continha níveis elevados de acilcarnitina durante as fases febril e defervescente de DF [20]. Cui et al. [20] sugeriram que esta β-oxidação aberrante indicava disfunção hepática. Em relação à Acilcarnitina, os níveis foram mais baixos em pacientes com DHF do que em pacientes com DF, o que pode sugerir perturbação diferencial de -oxidação na dengue grave versus leve [20,25]. Os ácidos biliares foram elevados durante o período defervescente fase da DF em relação aos controles saudáveis, implicando em danos ao fígado, e foram cinco vezes maiores na DHF do que em pacientes com DF [20,25,102]. Os ácidos biliares elevados foram significativamente correlacionados com os elevados níveis de aspartato transaminase e alanina transaminase no sangue, consistentes com inchaço do fígado e danos em DF e potencial insuficiência hepática em DHF [25,103]. Da mesma forma, ácidos biliares, transaminases hepáticas e metabólitos envolvidos na oxidação de ácidos graxos foram elevados no soro de camundongos humanizados infectados com DENV2, indicando dano ao fígado [93].
Outros pesquisadores descobriram outras moléculas que sugerem oxidação aberrante e função hepática. Em um estudo no Brasil usando 1H NMR para testar soros de pacientes com DF ou DHF, lipoproteína de densidade muito baixa e lipoproteína de baixa densidade (VLDL / LDL) foram mais baixos em todos os estados de dengue do que durante a doença não dengue, talvez devido à disfunção hepática e -oxidação alterada [21]. De apoio esta hipótese, níveis aumentados de acetato, que se correlacionam com doença hepática [104], ocorreram em pacientes com DHF em relação a pacientes não-controle da dengue [21]. O acetato livre, produzido principalmente pela flora intestinal, é ligado ao CoA no fígado pela acetil-CoA sintetase como uma alternativa ao piruvato para o ciclo do TCA ou síntese de ácidos graxos. Na urina de homens com DF cinco a sete dias após o início dos sintomas, acetoacetato, um corpo cetônico, foi aumentado [21]. Este nível elevado de acetoacetato foi provavelmente produzido no fígado na β-oxidação, sugerindo que o acetoacetato está sendo usado para transportar energia através do corpo no lugar de glicose, como ocorre durante o jejum [105]. O aumento do acetoacetato na urina sugere desregulação do armazenamento de energia fundamental e vias de uso durante a infecção DENV3.
Esses estudos demonstraram β-oxidação perturbada na dengue, o que implica disfunção no fígado. Foi observado na literatura que a infecção com DENVs pode causar inchaço do fígado e níveis elevados de transaminases hepáticas [77,78], mas uma série de metabólitos relacionados ao fígado encontrados por diferentes estudos implicam em mais disfunção do que é geralmente reconhecido. Em ratos, Chang et al. (2017) demonstraram que a fibrose hepática alterou o ciclo de TCA, bem como triptofano, glicerofosfolipídeo e metabolismo de esfingolipídios [106]. Essas mesmas vias também foram alteradas em humanos e camundongos infectados por DENVs, sugerindo que os DENVs induzem danos ao fígado [20–23,25,27,85,90,93,95,96]. Níveis de ácidos biliares, acilcarnitinas e acetato também foram aumentados no soro de humanos infectados com DENVs, sugerindo de forma semelhante lesão hepática [20,21,25]. Confirmando a ligação entre danos ao fígado e certos metabólitos, Cui et al. [25,93] encontraram transaminases hepáticas elevadas correlacionadas com ácidos biliares elevados. A aceitação de que os DENVs causam danos ao fígado está ganhando força [107,108], embora a sensibilidade de os achados metabolômicos anteriores sugerem dano mais do que anteriormente fora demonstrado.
2.5 O uso de aminoácidos é redistribuído pela infecção com DENVs
Os aminoácidos fazem mais do que compreender os blocos de construção das proteínas; eles também são importantes fontes de carbono e nitrogênio e são precursores de muitos outros metabólitos, incluindo serotonina e NAD + [101]. A serotonina é importante como neurotransmissor e para aumentar a coagulação do sangue, enquanto O NAD + é necessário para a fosforilação oxidativa, a via primária para a geração de ATP [101,109]. O catabolismo de aminoácidos pode gerar ATP [101].
Embora 95% do triptofano seja convertido em NAD + pela via da quinurenina, também pode ser convertido em serotonina ou catabolizado em piruvato e acetil-CoA para entrar no ciclo de TCA [101,110,111]. Os níveis de triptofano e quinurenina foram alterados durante a infecção com DENVs em modelos de cultura de células e soros humanos, sugerindo que esses vírus alteram as respostas inflamatórias, uma vez que esta via afeta e é influenciado pela inflamação [20,23,95,96,111]. A infecção por DENV3 aumentou os níveis de triptofano e O DENV4 alterou os níveis de quinurenina na média de células humanas infectadas [95]. Apesar de não estar destacado por Fontaine et al. [96], a tabela suplementar de sua publicação indica que a via da quinurenina tinha um maior aumento de qualquer metabólito detectado 24 horas após a infecção (hpi) (100 vezes) e 48 hpi (49 vezes), durante a infecção por DENV2 de células primárias humanas, enquanto os níveis de triptofano foram diminuiu significativamente. Com base em sua análise de MS de soros humanos, Cui et al. [23] propôs que produtos do metabolismo do triptofano foram prognósticos para DHF. Os autores compararam os níveis de vários metabólitos durante a fase febril da infecção de DENV com ensaios de citocinas e registros médicos para diferenciar os pacientes que desenvolveram DHF daqueles que curaram-se da DF [23]. Pacientes DF tinham menor serotonina e níveis mais elevados de quinurenina do que os controles saudáveis, enquanto os pacientes com DHF tinham níveis ainda mais baixos níveis de serotonina e níveis mais elevados ainda de quinurenina do que pacientes com DF dentro de 96 horas do início da febre [23]. Os níveis elevados de serotonina em pacientes com DHF em comparação com pacientes com DF persistiram durante a defervescência / fase crítica cinco a sete dias após o início da febre [25]. Serotonina plasmática, que é um pool separado daquele do sistema nervoso central, reside nos grânulos das plaquetas e aumenta agregação plaquetária quando liberada [109]. Assim, Cui et al. [23] postulou que a redução da serotonina é devido à redução das plaquetas durante a trombocitopenia característica da DHF. Reduzida contagem de plaquetas e os níveis plasmáticos de serotonina podem ser detectados antes que os pacientes se tornem críticos [23,77].
Tanto os níveis de serotonina quanto os de interferon-ϒ são usados ​​para um teste de prognóstico, Cui et al. [23] alcançou um poder preditivo precoce de sensibilidade de 77,8% e especificidade de 95,8% na diferenciação de DHF de DF em as amostras utilizadas neste estudo. Embora os papéis do metabolismo do triptofano na doença da dengue ainda não estejam bem elucidados, as abordagens metabolômicas indicam que essas vias podem desempenhar um papel importante papéis na replicação e patogênese do vírus, que podem ser explorados para desenvolver um ensaio de prognóstico.
A prolina e a glutamina também são aminoácidos potencialmente prognósticos. Voge et al. [22] identificaram prolina para prever a progressão para DHF durante a fase febril da infecção por DENV-2 em crianças em Nicarágua. Os níveis de glutamina são influenciados nas células e no soro humano pela infecção por DENVs [21,26,96]. A glutamina éo aminoácido livre mais abundante no plasma [112]. Além de seu papel óbvio na síntese de proteínas, é uma importante fonte de carbono, nitrogênio e energia para a síntese de lipídios, o ciclo do TCA e outros processos anabólicos [112]. Níveis elevados de glutamina foram associados à produção de citocinas inflamatórias, um aspecto fundamental da DHF / DSS responsável pelo aumento gravidade da doença [77,113]. Por causa de seu papel em vários processos metabólicos, o uso de glutamina é provável alterado pelo vírus para otimizar o equilíbrio de diferentes metabólitos de glutamina úteis para a replicação viral. Os níveis de glutamina e glutamato foram maiores em células humanas primárias infectadas com DENV2 do que em simulações infectados em todos os momentos [96]. A remoção da glutamina exógena reduziu o vírus infeccioso em 60% [96]. A glutamina pode repor os intermediários do ciclo do TCA durante a infecção [96]. Em soros humanos, Os níveis de glutamina diminuíram com o aumento da gravidade da dengue, indicando que ela pode ser catabolizada por energia ou metabolismo do carbono durante a infecção viral [21].
Em soros humanos cinco a sete dias após o início da febre, os níveis de fenilalanina eram mais elevados e os níveis de ácido úricos foram mais baixos em DHF do que em DF, possivelmente devido a maior dano oxidativo em DHF [25]. A sinalização do óxido Nítrico, uma parte do estresse oxidativo que ajuda a ativar monócitos, pode ser uma resposta imune do hospedeiro na tentativa de restringir a replicação de DENVs, mas também está correlacionada à redução da agregação plaquetária e DSS [114]. A conversão de fenilalanina em tirosina depende do cofator tetrahidrobiopterina, que é oxidado durante o estresse oxidativo, causando um acúmulo de fenilalanina. Níveis diminuídos de ácido úrico, um importante antioxidante no sangue, pode permitir o dano oxidativo relatado anteriormente durante a infecção com DENVs [114]. Assim, Cui et al. [25] propôs que a administração de ácido úrico poderia diminuir o dano oxidativo da infecção viral e aliviar a DHF, um valioso potencial terapêutico técnica. Shahfiza et al. [90] observaram níveis aumentados de 4-hidroxifenilpiruvato, um produto do metabolismo da fenilalanina e da tirosina, na urina de homens com DF no quinto/sétimo dias após o início dos sintomas em comparação com controles saudáveis. Isso sugere que a tirosina foi processado em 4-hidroxifenilpiruvato. Pacientes DF também tiveram um aumento na valerilglicina em seus urina [90]. Embora pouco se saiba sobre o metabolismo da valerilglicina, aumentos em outras acilglicinas na urina indicam desregulação do metabolismo de aminoácidos ou ácidos graxos [115]. Tal como acontece com os humanos, Cui et al. [93] também encontraram moléculas relacionadas ao metabolismo de fenilalanina, triptofano, lisina, arginina e prolina vias elevadas no soro de camundongos humanizados infectados com DENV2 dentro de sete dias após a infecção (dpi).
Muitos aminoácidos e seus metabólitos foram implicados na infecção por DENVs. Diversos, incluindo prolina, serotonina e quinurenina, podem ser prognósticos úteis para diferenciar pacientes propensos a declinar rumo a DHF e quem vai precisar de intervenção médica extra daqueles que vão se recuperar do DF [22,23].
2.6. DENVs afetam vias adicionais
Alterações induzidas pela infecção com DENVs foram observadas em muitos outros processos metabólicos, vias relacionadas à transferência de energia e anabolismo biossintético, incluindo nucleotídeos e vitaminas Metabolismo de D, o ciclo do TCA e glicólise. Cui et al. [20,93] demonstrado em soros humanos e soros de camundongos humanizados que os distúrbios metabólicos induzidos por DENVs são maiores no início da infecção, e lentamente retornar a níveis saudáveis ​​ao longo do tempo, com amostras defervescentes caindo em relação aos saudáveis demonstradas por PCA. Os padrões dessas alterações refletem o curso da infecção, indicando que os DENVs não induzem perturbações generalizadas e de longa duração no metabolismo do hospedeiro.
Vários estudos avaliaram a capacidade da metabolômica em diferenciar os sorotipos de DENV. Com cuidado experimentos controlados de cultura de células, todos os quatro sorotipos foram diferenciados [94,95]. Cui et al. [20] não conseguiram identificar metabólito em soros humanos que diferenciam DENV1 e DENV3 [20]; talvez porque estes são os serotipos mais intimamente relacionados, ou porque as técnicas aplicadas não tinham a sensibilidade necessária para esta tarefa [9,14,116]. No entanto, Voge et al. [22] encontraram 25 metabólitos que sorotipos DENV1 e DENV2 possuíam diferenciados em soros humanos, e Villamor et al. [24] encontraram alguns acilos gordurosos que variaram entre os diferentes sorotipos durante as infecções humanas.
A glicólise é um processo fundamental do metabolismo celular e foi considerada alterada pelo DENV2 em fibroblastos de prepúcio humano por LC-MS e GC-MS em ​​células lisadas por Fontaine et al. [96]. Níveis de glicose 6-fosfato e frutose 6-fosfato, que são intermediários da glicólise, foram significativamente aumentados nas células infectadas em 24 e 48 hpi, enquanto os níveis de metabólitos da glicólise a jusante, fosfoenolpiruvato e 3-fosfoglicerato, foram elevados em 10 hpi, mas diminuíram em 48 hpi quando em comparação com os níveis nas células não infectadas. Esses achados podem sugerir que a glicólise elevada produtos da cascata durante a infecção inicial e retarda depois, de modo que os produtos intermediários se acumulem durante as fases posteriores da infecção. Estudos de inibição determinaram que a glicólise é necessária para replicação da DENV2, como a retenção de glicose do meio ou a inibição da glicólise, redução da replicação do vírus cerca de 100 vezes [96]. Fontaine et al. [96] hipotetizou que a glicólise é necessária para a biossíntese de lipídios induzido por DENVs para formar esférulas de replicação ou talvez outros requisitos replicativos, como geração de ATP. Ao utilizar a glicólise, os DENVs podem economizar ácidos graxos para a síntese de membrana, em vez do que usá-los para β-oxidação.
Shahfiza et al. [90] descobriram que o ciclo do TCA, que está adiante da glicólise, foi perturbado por infecção com DENVs. Os níveis de succinato e citrato diminuíram na urina de homens infectados do quinto ao sétimo dia após o início dos sintomas em comparação com controles saudáveis, indicando que esta via fundamental para alimentar o corpo é perturbada pela infecção [90]. Os autores sugeriram estes e 11 outros metabólitos que identificaram como alterados na urina de homens infectados por DENVs são moléculas diagnósticas potenciais [90].
Outros metabólitos alterados pela infecção com DENVs incluem vitamina D3, purinas e pirimidinas. Níveis reduzidos de 1,25-dihidroxivitamina D3, a versão biologicamente ativa da vitamina D3, correlacionados com DHF / DSS em comparação com DF e doença não dengue na coorte da Nicarágua analisada por Voge et al. [22]. Embora principalmente associada à regulação do cálcio, a vitamina D3 também pode influenciar a barreira vascular e imunorregulação [117]. Assim, reduziu a produção de 1,25-dihidroxivitamina D3 pode ser parcialmente responsável pelos sintomas de DHF / DSS [22]. Cui et al. [93] encontraram purina e pirimidinas elevadas no soro de camundongos humanizados infectados com DENV em 7 dpi, talvez para gerar ribonucleotídeos para a replicação do genoma viral.
Mais de uma dúzia de artigos iluminaram as alterações metabólicas causadas pela infecção com DENVs em sistemas modelo e humanos, implicando mudanças de lipídios e ácidos graxos, bem como mudanças na glicólise, o ciclo do TCA, a oxidação, o metabolismo dos aminoácidos e muitas outras vias afetadas. Estes estudos são valiosos, pois sugerem metabólitos para ensaios diagnósticos e prognósticos, propostas terapêuticas como ácido úrico e DGLA, e interações vírus-hospedeiro elucidadas [24,25,90].
3. CHIKV vs DENVs
CHIKV é um alfavírus da família Togaviridae, mas compartilha aspectos epidemiológicos e ecológicoscaracterísticas com os flavivírus DENV1-4 e ZIKV, pois eles têm faixas geográficas sobrepostas e são transmitidos pelos mesmos vetores do Aedes [9]. A transmissão local de CHIKV foi documentada nos cinco continentes, e há um risco substancial de o CHIKV se espalhar para a Austrália [118]. Febre chikungunya, que afetou milhões de pessoas nas últimas duas décadas, é uma doença febril aguda com artralgia que pode persistir por meses ou anos mesmo após cessar a febre [9]. Identificação metabólica características que distinguem o CHIKV de outras doenças tropicais podem melhorar substancialmente os diagnósticos para populações em risco de contrair esta e outras doenças clinicamente semelhantes. 
Para diferenciar as alterações metabólicas induzidas pelo CHIKV dos DENVs, Shrinet et al. [26] analisaram soros de pacientes na Índia infectados com CHIKV, DENVs ou co-infectados com ambos usando RMN de 1H (Tabela 4). Shrinet et al. [26] encontraram alterações no metabolismo da glicina, serina, treonina e galactose, bem como o ciclo do TCA, em pacientes com CHIKV em relação aos controles saudáveis. Alterações no ciclo do TCA são esperadas, dados os altos requisitos de energia do CHIKV para multiplicação rápida e geração de blocos de construção biossintéticos para lipídios, proteínas e RNA. Os autores encontraram estatísticas que levam correlação entre dano articular e níveis elevados de hipoxantina e ácido 4-hidroxifenilpirúvico durante a infecção por CHIKV, consistente com seu envolvimento relatado com artrite [26.119.120]. Essa descoberta fornece evidências de características moleculares conservadas entre artralgia induzida por CHIKV e artrite reumatóide. Quanto à infecção por CHIKV, metabolismo de glicina, serina, treonina e galactose também foram alteradas em pacientes infectados com DENVs e em pacientes co-infectados com CHIKV e DENVs versus controles saudáveis. Observou-se que os níveis de glutamina aumentam apenas nas coinfecções, que pode ser devido à seleção estatística de metabólitos, já que outro trabalho descobriu os níveis de glutamina alterado pela infecção apenas com DENVs [21,26,96]. Vários biomarcadores diferenciaram infecções por CHIKV de infecções com DENVs, incluindo sorbitol, ácido 2-cetobutírico e sarcosina [26]. Sorbitol era elevado em pacientes com CHIKV em relação aos controles saudáveis, mas não foi detectado em pacientes com dengue, e foi observada em um nível intermediário em pacientes co-infectados. Sorbitol é um intermediário no açúcar metabolismo e, portanto, alterações específicas do vírus sugerem que CHIKV e DENVs causam diferentes alterações no metabolismo do carbono.
Tabela 4. Metabólitos selecionados de artigos sobre o vírus chikungunya (CHIKV), o vírus do Nilo Ocidental (WNV) e o vírus Zika (ZIKV). Metabólitos geralmente aumentados na doença estão em vermelho, os metabólitos diminuídos estão em azul. Os metabólitos pretos têm resultados mistos na publicação correspondente. Se não for especificado, LC foi de fase reversa. Padrão abreviações de aminoácidos de uma única letra são usadas.
4. ZIKV
O ZIKV é um flavivírus emergente que recentemente se expandiu do sudeste da Ásia para as Américas. Com apenas 13 casos adquiridos naturalmente relatados entre a descoberta do ZIKV em humanos em 1953 um surto nas ilhas Yap na Micronésia em 2007, a recente expansão do ZIKV foi surpreendente [13] Também surpreendente foi a descoberta de que o ZIKV pode ser transmitido sexualmente, embora seja principalmente vetorizado por mosquitos Aedes [7.125.126]. ZIKV geralmente não causa sintomas ou apenas um leve quadro febril com erupção cutânea, mas pode causar doenças graves, como microcefalia durante o desenvolvimento fetal ou distúrbio autoimune paralítico, síndrome de Guillain-Barre [126].
Melo et al. [27,28] investigaram metabólitos únicos no soro humano usando DIMS. Eles selecionaram metabólitos que foram detectados no soro de pacientes infectados com ZIKV, mas não foram detectados em pacientes não portadores de ZIKV nem detectados em controles saudáveis. Eles encontraram níveis aumentados de fosfatos de P (PIPs), que são PI com um fosfato adicional na metade do açúcar, e angiotensinas. Ambos os PIP e as angiotensinas contribue para a sinalização mTOR para prevenir a autofagia. Como os DENVs, o ZIKV induzautofagia, presumivelmente para aumentar a β-oxidação e auxiliar na multiplicação viral [127,128]. Os hospedeiros podem aumentar as angiotensinas e PIPs para restringir a autofagia e privar o ZIKV dos nutrientes que ele obteria da β-oxidação. No entanto, as proteínas ZIKV NS4A e NS4B inibem a via de sinalização mTOR que é estimulada por PIPs e angiotensinas, permitindo assim a autofagia e tornando esta defesa potencial do hospedeiro ineficaz [127]. Melo et al. [27,28] também identificaram um aumento no gangliósido GM2, um esfingolipídeo, em pacientes infectados com ZIKV em relação aos seus pacientes controle não infectados com ZIKV. Gangliosídeos, que aumentam a flexibilidade da membrana e são fundamentais para a ancoragem e replicação do DENV-2, também podem ancorar os complexos de replicação do ZIKV [129]. Os autores sugerem que, uma vez que o sistema imunológico do hospedeiro ataca gangliosídeos neuronais na síndrome Guillain-Barre [130], gangliosídeo GM2 podem estar associados a esta complicação grave do ZIKV [27]. As moléculas identificadas no estudo de Melo et al. [27,28] não foram identificados como alterados por infecção por DENVs ou CHIKV em outros estudos, embora uma comparação direta não seja aconselhável e inapropriadas para o ZIKV com outros flavivírus, pois ainda não fora incluído em um estudo compreensivo.
5. Conclusões
Os estudos discutidos cobriram três arbovírus das famílias Flaviviridae e Togaviridae. e demonstraram sua influência em inúmeras vias, incluindo o ciclo do TCA, gorduras metabolismo de ácidos, dano oxidativo, metabolismo de aminoácidos, glicólise, interações do sistema imunológico, sinalização mTOR, autofagia e outros. A quantidade de dados coletados em apenas um estudo de metabolômica é difícil de compilar e entender; ao revisar os artigos acima, necessariamente negligenciamos para incorporar todas as informações apresentadas. Esta revisão pretende ser uma visão geral ampla para orientar os leitores para papéis que irão beneficiá-los mais.
Existem lacunas substanciais em nosso conhecimento sobre as alterações metabólicas dos arbovírus. Enquanto a manipulação de membranas hospedeiras pelo vírus do Nilo Ocidental (WNV) foi estudado em cultura de células, dados metabolômicos sobre pacientes infectados pelo WNV ainda faltam [121–123,131]. Arbovírus da ordem Bunyavirales e da família Reoviridae também é uma área que pode se beneficiar da investigação metabolômica.
5.1. Resumo das vias comuns entre os arbovírus
Ambos os togavírus e flavivírus dependem de glicólise elevada ou β-oxidação de ácidos graxos para produzir a energia de que precisam para se multiplicar [20,21,89,90,93,95–97,132]. DENVs induzem autofagia e up regulation da β-oxidação para energia, na forma de ATP, ou para os produtos químicos que podem ser usados em processos anabólicos [21,89,128]. Produtos de β-oxidação, incluindo acetil-CoA, podem ser usados para fazer ácidos graxos e glicerofosfolipídios necessários que compõem as novas membranas que os flavivírus induzem a abrigar seus complexos de replicação. Na verdade, os níveis de ácidos graxos são alterados por infecção por flavivírus e, ao inibir sua síntese de novo, diminui a produção de WNV e DENVs [18,19,122]. Esses novos ácidos graxos podem ter funções independentes ou podem ser esterificados em glicerofosfolipídios para contribuir para a arquitetura da membrana.
As membranas são importantes para cada parte dos ciclos de vida de flavivírus e togavírus, incluindo entrada replicação, montagem e saída [14.133]. A replicação ocorre em vesículas ligadas à membrana para proteger produtos intermediários da fita dupla de RNA vulneráveis à vigilância do hospedeiro. Montagem de virions ocorre e membranas que facilitam o brotamento da célula.Devido à necessidade de membranas em ciclos de vida de arbovírus, glicerofosfolipídeos são elevados pela infecção por flavivírus em humanos e células de mosquito e geralmente reduzidas no soro do hospedeiro, provavelmente devido à utilização intracelular do glicerofosfolipídios esgotando-os do soro [11,19,20,22,88,93,97,121,123,124]. Os níveis intracelulares de glicerofosfolipídeos de membrana mais abundante, PC, aumentaram durante a infecção com DENVs, WNV e ZIKV [19.82.121.124]. Infecção por flavivírus em humanos, camundongos humanizados e a cultura de células frequentemente altera os níveis de glicerofosfolipídios que curvam as membranas ou controlam a fluidez da membrana, como PI, PE, LPL e esfingolipídeos, consistente com a necessidade de membranas curvas e flexíveis para esférulas de replicação e envelopes de vírion [11,20,22,27,28,85,87,93,121,123,134]. Esfingolipídeo e a produção de LPL também é importante para a multiplicação viral, assim se inibidas suas conversões metabólicas há diminuição da multiplicação de flavivírus [97,121,123].
Uma classe de glicerofosfolipídios que curvam a membrana são os LPLs, que são produzidos pela remoção de um grupo acil graxo de PC, PE, PI, PS ou ácido fosfatídico. Atividade da fosfolipase A2, que é elevada no soro humano durante a infecção com DENVs [91], produz LPLs por clivagem de acilos graxos sn-2, produzindo assim ácidos graxos livres e LPLs [81,83,84]. O sn-2 dos LPLs são enriquecidos em ácidos graxos insaturados, incluindo AA, DHA e ALA [81,83,84], que foram elevados no soro de pacientes que desenvolveram DHF, sugerindo que a atividade da fosfolipase A2 é alta em pacientes com DHF [22,24]. Liberação de ácidos graxos poliinsaturados de seu reservatório de glicerofosfolipídios permite a produção de moléculas de sinalização pró e anti-inflamatórias, como prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos, lipoxinas e resolvinas [83,84]. Assim, a produção de LPLs por flavivírus para membranas curvas também pode desencadeiam algumas das respostas inflamatórias que caracterizam sua infecção. 
Estudos de metabolômica de arbovírus demonstraram aspectos conservados de togavírus e flavivírus na manipulação do metabolismo do hospedeiro, especialmente do metabolismo dos ácidos graxos e glicerofosfolipídeos, mas também demonstraram que bioassinaturas metabólicas únicas de diferentes vírus tornam possível diferenciar diversas infecções virais. Alterações no metabolismo humano induzidas por infecção com DENVs foram comparados às alterações causadas pelo vírus da gripe [135], vírus da hepatite B e da hepatite C [85], e CHIKV [26].
5.2 Pontos fortes das análises metabolômica
As técnicas metabolômicas permitem medições sensíveis e precisas de muitos metabólitos, relacionados a uma ampla variedade de processos moleculares simultaneamente. Quando Birungi et al. [95] analisou Metabólitos extracelulares gerados por DENVs em cultura de células humanas usando DIMS e 1H NMR, ambos técnicas identificaram consistentemente tendências nos níveis de aminoácidos, ácidos dicarboxílicos, ácidos graxos, e outros metabólitos relacionados ao TCA, demonstrando que diferentes abordagens para metabolômica podem obter resultados comparáveis.
Um dos principais pontos fortes da metabolômica é a capacidade de avaliar perturbações em estados fisiológicos durante a infecção humana para compreender as interações vírus-hospedeiro em humanos. Bioassinaturas metabólicas induzidas por arbovírus identificadas em muitos dos estudos discutidos têm potencial para uso em novos ensaios de diagnóstico [20–22,26,27,85,88,90]. Os métodos metabolômicos para detecção de vírus são ortogonais para PCR e sorologia (Tabela 5). As alterações metabólicas tendem a ocorrer mais rapidamente do que as sorológicas e podem ser detectadas após o tempo limitado em que o RNA viral pode ser detectado por PCR no soro. As alterações metabólicas induzidas pela infecção tendem a voltar ao normal após o patógeno ser eliminado, permitindo que os metabólitos diferenciem a infecção recente de uma infecção anterior com o mesmo sorotipo de vírus. Como tal, os ensaios metabólicos podem complementar o genômico atual e ensaios sorológicos. Além disso, a sensibilidade das técnicas metabolômicas permite que os pesquisadores identifiquem as alterações metabólicas que sinalizam a progressão da doença [21-24]. A sorologia e a PCR não podem fornecer dados prognósticos, mas vários estudos metabolômicos identificaram marcadores prognósticos de DHF [21–24]. Isso sugere que muitos desses biomarcadores de metabólitos servem como um sistema de alarme para doenças específicas e seus estados, ilustrando o potencial da metabolômica em melhor compreensão dessas doenças. O máximo objetivo desta abordagem é identificar o estado da doença dentro dos dias 1-3 do início da febre e fornecer um caminho para a intervenção precoce da doença, monitoramento da progressão ou resolução e recorrência, se houver. Os dados metabolômicos também podem ser usados ​​para avaliar a eficácia da intervenção terapêutica, fornecendo monitoramento molecular detalhado dos estados da doença e variações da homeostase [20].
Tabela 5. Comparação de perfis metabólicos, PCR e técnicas de sorologia para avaliar a infecção por arbovírus.
Além da descoberta científica, a metabolômica também pode ser usada para avaliar modelos animais ou projetos experimentais. Em 2017, Cui et al. [93] usou LC-MS e LC-MS / MS para validar um modelo de camundongo humanizado para dengue, pois faltam modelos animais que recapitulem os sintomas da dengue. Os animais foram camundongos NSG extremamente imunodeficientes semeados com células de fígado fetal humano CD34 + para produzir plaquetas, monócitos e hepatócitos humanos [136]. Cui et al. [20,93] identificaram muitas das alterações características moleculares em camundongos que fazem parte das mesmas vias metabólicas que foram alteradas em soros humanos de seu estudo anterior, ajudando a validar os camundongos humanizados como um modelo para infecção humana com DENVs.
5.3 Explicação do porquê da variação nos estudos de metabolômica
Os estudos de metabolômica podem variar em muitos aspectos que podem levar a diferentes estatisticamente significantes e mudanças nos níveis de metabólitos. Inconsistências entre os estudos podem surgir de diferenças na amostra, tempos de coleta e métodos de preparação, controles, genótipos de vírus, populações de hospedeiros (incluindo genética e dieta) ou sistemas modelo, estados de doença, métodos de coleta de dados e métodos analíticos.
Embora alguns grupos possam relatar diferenças significativas nos níveis de metabólitos diferentes da geral tendência mencionada em outros estudos, isso não é motivo de alarme, mas sim sugere que seus dados podem resultar especificamente de seu conjunto de amostras e métodos analíticos. Portanto, é difícil construir um perfil generalizável das alterações metabólicas induzidas por qualquer vírus. Por exemplo, Cui et al. [20] e Voge et al. [22] ambos identificaram LPC (16: 0), LPC (18: 1), ALA, AA e DHA como metabólitos alterados em soros humanos por infecções com DENVs, mas estudos em populações da Nicarágua, México e Cingapura não apresentaram tendências consistentes nesses metabólitos. Diferenças nas técnicas, especialmente em cromatografia (RPLC e GC versus HILIC) podem ser parcialmente responsável, bem como diferenças em grupos de controle (controle saudável versus dengue). Villamor et al. [24] observou que os níveis de DHA foram relacionados ao sorotipo DENV, potencialmente explicando a variação nas tendências de DHA em diferentes estudos, locais e pacientes. Além disso, o DHA é derivado de ALA, um elemento ácido graxo ômega-3 essencial, que é obtido principalmente da dieta [83]. Consequentemente, diferenças regionais e individuais em consumo são prováveis.
É importante ter em mente que diferentes tipos de amostra refletem diferentes aspectos do metabolismo. A célula lesada é diferente do meio celular. O meio está esgotado ou enriquecido com metabólitos não apenas de acordo com as mudançasno metabolismo, mas também de acordo com a capacidade das células de absorver, reter ou excretar metabólitos. Da mesma forma, os soros humanos estão sujeitos a limitações de transporte de metabólitos e podem não refletir abundâncias de moléculas dentro das células, o que pode explicar por que os glicerofosfolipídios eram geralmente elevados em célula lesado, mas diminuído no soro humano durante a infecção por flavivírus [11,19,20,22, 88,93,97,121,123,124].
A variação entre os estudos enfatiza que as bioassinaturas metabolômicas melhor descrevem as amostras usadas ​​para construí-los, então os pesquisadores devem selecionar amostras para melhor representar as populações e responder as questões postas no início do estudo. Um conjunto padrão de métodos para coletar, caracterizar e relatar amostras irá reduzir a variabilidade entre os estudos e melhorar a generalização da mesma forma que padronizar coleta de amostra e processamento dentro de um experimento reduz a variabilidade. Apesar das diferentes descobertas, os estudos discutidos nesta revisão demonstram a capacidade da metabolômica de diferenciar doenças condições e prever a gravidade da doença. Meta-análises de muitos papers ou grandes conjuntos de amostras retirados de diversas populações provavelmente irão melhorar a generalização da metabolômica para diagnosticar clinicamente doenças virais.
5.4 Perspectivas
A metabolômica fornece uma visão sobre muitos aspectos das interações vírus-hospedeiro, confirmando e fornecendo mais detalhes sobre as descobertas anteriores, incluindo energia viral e requisitos de membrana, papéis de metabólitos na infecção viral e associações metabólicas com sintomas clínicos, estados de doença, e progressão da doença. A capacidade de vigiar amplamente os metabólitos em soros humanos é distintamente útil uma vez que fornece uma avaliação extensa, porém detalhada, do estado fisiológico e pode ser usado para avaliar intervenções durante a infecção. A metabolômica identificou muitos biomarcadores de doenças para possíveis diagnósticos e tratamentos terapêuticos futuros. No entanto, existem várias advertências e desafios para estudos metabolômicos [137]. Há uma grande variação interlaboratorial na coleta de amostras, processamento e análise. Identificar metabólitos desconhecidos e distinguir variações biológicas confusas são difíceis. Além disso, é difícil obter grandes coortes de amostras independentes que representem pacientes de populações inteiras. O desenvolvimento de bioassinaturas é caro e estabelece o significado biológico de biomarcadores é um desafio. Finalmente, quando a metabolômica é traduzida em testes de diagnóstico, eles enfrentam adoção lenta pela comunidade médica [137]. Para ajudar a superar esses desafios, grupos de controle e amostras bem caracterizadas são essenciais. Para minimizar a variabilidade na amostra coleta, é ideal coletar um grande número de amostras prospectivas, em vez de retrospectivas, para controlar melhor as condições de manuseio e levar em consideração a variabilidade do paciente. Amostras mal categorizadas podem invalidar resultados e interpretação, portanto, os métodos usados ​​para caracterizar as amostras, como o de laboratório os testes (PCR, sorologia, etc.) e a coleta de dados do paciente devem ser rigorosos. Isso é importante para entender se idade, sexo, localização geográfica ou outros fatores, como o uso de drogas específicas, estão dirigindo as diferenças observadas. É crucial confirmar as identidades e quantidades de metabólitos com vários métodos de coleta de dados para minimizar as desvantagens das abordagens individuais e garantir os dados robustez. O caminho desde a descoberta de metabólitos como biomarcadores até um ensaio clínico estabelecido foi estabelecido em pesquisas sobre autismo, triagem neonatal e pré-eclâmpsia [6,138,139].
Os ensaios MRM estão atualmente disponíveis nos EUA, como laboratórios estaduais que realizam triagem são equipados com esta tecnologia. Para expandir para regiões sem capacidade MRM, alternativas devem ser desenvolvidas como técnicas de baixo custo para a detecção de metabólitos que compreendem uma bioassinatura. Esses podem ser baseados em anticorpos ou produtos químicos e podem ser semelhantes a ELISA ou testes baseados em papel. Os desafios no desenvolvimento de testes clínicos baseados no metabolismo para doenças infecciosas podem ser superados seguindo o caminho definido por outros campos. Além disso, muitas dessas vias metabólicas alteradas por infecção viral também são alteradas em condições de doenças humanas, como diabetes, síndromes metabólicas e cânceres e, portanto, têm inibidores / medicamentos já desenvolvidos e no mercado. Seguindo detecção precoce de biomarcadores, vias metabólicas podem ser manipuladas e podem ser utilizadas aquelas já desenvolvidas e compostos testados podem ser reutilizados como antivirais. Conforme ilustrado nesta revisão, a metabolômica tem o potencial de expandir nossa compreensão das infecções virais a níveis incomparáveis. Em andamento trabalho combinando metabolômica, genômica e proteômica em uma ampla abordagem de biologia de sistemas aumentará a força de todas as três abordagens, assim como expandirá o campo do imunometabolismo para ligar as alterações metabólicas discutidas às respostas imunes envolvidas em doenças arbovirais. Como tecnologias e métodos metabolômicos melhoram, as técnicas metabolômicas provavelmente se tornarão uniformes, sendo mais valiosas para aumentar nossa compreensão de uma infinidade de doenças, síndromes e enfermidades com componentes metabólicos.
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