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Metabolômica aplicada no estudo de arboviroses emergentes causadas por mosquistos Aedes aegypti: uma revisão
Traduzido por Camila Amato Montalbano
(Este texto trata-se apenas de uma tradução fidedigna ao artigo original com o intuito de ajudar estudantes e pesquisadores que possuem dificuldade com a língua inglesa.)
Dados do artigo original em inglês e autores:
 Metabolomics applied in the study of emerging arboviruses caused by Aedes aegypti mosquitoes: A review
Estéfane da Cruz Nunes; Gisele André Baptista Canuto
Electrophoresis 2020, 41, 2102–2113
Departamento de Química Analítica, Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, Salvador, BA, Brazil
Received May 21, 2020
Revised July 22, 2020
Accepted September 1, 2020
Resumo
Arbovírus, como chikungunya, dengue, febre amarela e zika, causados ​​pela picada do mosquito Aedes aegypti, têm sido um problema frequente de saúde pública, com alta incidência de surtos em países tropicais e subtropicais. Essas doenças são facilmente confundidas com outras de sintomatologia semelhante à gripe e apresentam sintomas muito próximos, difíceis de distinguir e tratar adequadamente. Os efeitos que essas infecções causam no organismo são fundamentalmente derivados de processos metabólicos complexos. Uma área proeminente da ciência que investiga
as mudanças no metabolismo de organismos complexos é a metabolômica. Metabolômica mede os metabólitos produzidos ou alterados em organismos biológicos, por meio do uso de plataformas analíticas robustas, como técnicas de separação hifenizadas com espectrometria de massa, combinado com bioinformática. Este artigo de revisão apresenta uma visão geral dos conceitos básicos de fluxo de trabalho metabolômica e avanços neste campo, e compila pesquisas artigos que usam essa abordagem ômica para estudar esses arbovírus. Neste contexto, a metabolômica é aplicada para pesquisar novas terapias, entender os mecanismos de replicação viral, e acessar as interações vírus-hospedeiro.
Introdução
Ciências ômicas, como genômica, transcriptômica, proteômica, e a metabolômica, ocupam um nicho importante na compreensão da biologia do sistema. O termo metabolômica, a abrangente análise de metabólitos produzidos ou alterados no organismos, surgiram em meados dos anos 2000, permitindo a compreensão do fenótipo [1]. O metaboloma, conjunto de todos os metabólitos, aparece como um instantâneo do produto final do metabolismo
e, consequentemente, amplifica o transcriptoma e o genoma e as suas alterações. Duas estratégias são aplicadas nos estudos de metabolômica: a abordagem global (untargeted), uma semiquantitativa ou análise qualitativa usada quando o objetivo é uma visão geral de metabolismo, sem conhecimento prévio; e o alvo (targeted) abordagem caracterizada pela determinação quantitativa de alguns metabólitos ou classes químicas específicas, selecionados com base no conhecimento prévio do organismo estudado [2,3].
Para realizar um estudo metabolômico, algumas etapas, como o tipo de amostra biológica, coleta e armazenamento deve ser definido com a questão biológica. A próxima etapa é a preparação da amostra, que está intimamente relacionada com a abordagem metabolômica, o tipo de biofluido e a técnica analítica selecionada [3]. Com base na abordagem metabolômica, a preparação da amostra pode ser mínima. Métodos não direcionados podem incluir ruptura da membrana celular ou tecidual, precipitação de proteínas (usando solventes orgânicos) ou seleção de metabólitos polares e não polares usando extração líquido-líquido (LLE). Para a abordagem direcionada, procedimentos de extração mais seletivos por LLE sucessivos, combinados ou não com SPE (solid-phase extraction), são frequentemente aplicados. Independentemente da abordagem, as perdas de analito devido a degradação, evaporação e ativação enzimática devem ser evitados. Para tanto, controle de temperatura, trabalhando com solventes frios, e realizando o processo de banho de gelo, parece para ser uma estratégia útil para aplicar nos procedimentos de preparação da amostra [4,5]. A análise das amostras biológicas, que pode incluir biofluidos (como urina, sangue, saliva, líquido cefalorraquidiano, etc.), células ou tecidos, são comumente realizado por NMR e MS. MS geralmente é combinado com técnicas de separação, como a cromatografia gasosa (GC, do inglês, gas chromatography), a cromatografia líquida de alta eficiência (LC, do inglês, liquid chromatography) e a eletroforese capilar (CE, do inglês, capillary electrophoresis)[6,7].
Devido à limitação intrínseca da técnica, o uso de GC-MS torna-se interessante para a análise de compostos termicamente estáveis e metabólitos voláteis. Para aumentar a cobertura de metabólitos, etapas de derivatização, incluindo reações de oximação e sililação, podem ser realizado para detectar metabólitos relativamente polares tais como aminoácidos, açúcares, aminas, ácidos orgânicos, etc. [8]. Por outro lado, a análise LC-MS permite a determinação de metabólitos dentro de uma ampla gama de polaridades, devido à grande diversidade de colunas cromatográficas. A análise de metabólitos de baixa e média polaridade são realizados por inversão em colunas de fase (RPLC-MS reversed-phase liquid chromatography) e os compostos de alta polaridade são determinados em separações de interação hidrofílica (HILIC-MS- Hydrophilic interaction chromatography). A análise metabolômica por CE-MS é adequada quando deseja-se acessar metabólitos iônicos ou ionizáveis. CE tem um mecanismo de separação substancialmente diferente de GC e LC, fornecendo informações adicionais para técnicas cromatográficas [9,10]. Devido às diferentes propriedades físico-químicas e a ampla faixa de concentração dos metabólitos presente em organismos biológicos, mais de uma técnica é recomendada, especialmente para os de abordagem não direcionados [11]. A complementaridade na informação fornecido pelas diferentes técnicas analíticas permite confirmar resultados e aumenta o mapeamento de rotas bioquímicas, enriquecendo os estudos, e proporcionando uma completo visão biológica integrada do sistema estudado.
A capacidade de demonstrar a alta qualidade dos dados obtido a partir da análise metabolômica é essencial uma vez que impactos no aumento ou diminuição dos metabólitos são necessários para compreender as relações intrincadas entre organismos [12]. A variabilidade analítica é um fator que pode influenciar a diferença biológica medida, e é necessário para garantir a confiabilidade dos procedimentos aplicados e os dados adquiridos. A validação de um método analítico é usado para confirmar que o procedimento é adequado para seu uso pretendido. Metabolômica compreende a análise de um grande quantidade e variedade de metabólitos presentes no complexo das amostras. Idealmente, o desempenho do método deve ser avaliado para cada metabolito individualmente. Em análises direcionadas, a determinação das figuras de mérito do método analítico e a preparação da amostra é geralmente aplicada. Assim, linearidade, seletividade, exatidão e precisão são avaliadas, usando padrões analíticos autênticos ou rotulados com isótopos compostos. Para análises não direcionadas (untargeted), no entanto, uma validação completa torna-se impraticável devido ao grande número de analitos que se pretendem determinar, a falta de certificados e material de referência, e a indisponibilidade de analíticos padrões. Ao contrário das avaliações analíticas (targeted), aplicadas a análises, não há diretriz ou protocolo para metabolômica untargeted [13]. Para garantir a qualidade e monitorar a variabilidade de analítos, as amostras de controle de qualidade (QC) são analisadas durante a sequência do lote. QCs são misturas de pequenas alíquotas iguais de todas as amostras utilizadas no estudo e atestam o desempenho e estabilidade da técnica analítica. Trabalhos recentes têm mostrado uma abordagem interessante com base em medidas de controle de qualidade para monitorar o desvio do sinal. A análise da diluição em série do QC agrupado, QCs externos (usando materiaisde referência), e o uso de padrões autênticos (como padrões internos) foram aplicados para o plano de fundo e remoção de sinal espúrio, para melhorar identificação do metabólito, para atestar a precisão da metodologia (por testes de recuperação), linearidade e precisão, e diferenciar a importância entre métodos e mudanças biológicas, reduzindo falsas descobertas [14-16].
Os dados gerados pelas diferentes plataformas estão sujeitos ao processamento, usando software apropriado para converter sinais analíticos complexos em dados de características moleculares matriz. Em geral, os métodos envolvem a detecção e deconvolução de sinais, alinhamento, agrupamento e filtragem de ruído. Software, como XCMS, MzMine, MetAlign [17–19], Mass Profiler Professional (Agilent Tech.), MassLynx (Waters Corp.), etc. são aplicados para tais fins. Os dados gerados na metabolômica global são extensos, fornecendo milhares de sinais, que podem ser identificados após análise estatística. Portanto, é necessário aplicar métodos precisos de filtragem e remover ruído e artefatos [20]. Ferramentas Quimiométricas são aplicadas para verificar a diferenciação entre os grupos estudados. A análise estatística compreende métodos multivariados de regressão, como o diretor não supervisionado: Método de Análise de Componentes Principais (PCA- Principal Component Analysis) ou o supervisionado: Análise Parcial Discriminante de Mínimos Quadrados (PLS-DA -Partial least Squares-Discriminant Analysis) e métodos de projeções Ortogonal para Análise Discriminante de Estruturas Latentes (OPLS-DA- Latent Structures-Discriminant Analysis) [21]. Análise univariada, baseada em falso Testes de taxa de descoberta (FDR- False
Discovery Rate), análise de variância (ANOVA), O teste t de Student ou o teste U de Mann-Whitney complementam os métodos estatísticos aplicados à metabolômica [21-23]. Para identificação de metabólitos, a Metabolomics Standards Initiative (MSI) definiu quatro níveis de confiança, em que nível 1 refere-se à identificação com base em duas ou mais propriedades como tempo / índice de retenção, m / z, fragmentação de MS. Além disso, a anotação putativa para metabólitos e classes (níveis 2 e 3, respectivamente) e compostos desconhecidos (nível 4) são relatados [24]. Até agora, a identificação de metabólitos é um dos grandes desafios do fluxo de trabalho da metabolômica. Em geral, os compostos são identificados por pesquisa m / z em bancos de dados públicos, como The Human Metabolome Database (HMDB) e Metlin. Idealmente, a confirmação da identidade do composto químico deve ser realizado com base na análise de padrões analíticos autênticos. Apesar de todo os esforços do pesquisador, centenas de sinais analíticos não são facilmente identificados (compostos ou classes desconhecidas de lipídios, por exemplo), seja pela limitação de bancos de dados, falta de tecnologia para análise ou indisponibilidade de padrões. Para contornar esse problema, algumas pesquisas estão desenvolvendo ferramentas de previsão, com base na modelagem de fragmentação, melhorando a identificação de compostos [25]. A interpretação biológica é finalmente alcançada pela associação de metabólitos alterados e vias metabólicas [3].
As etapas do fluxo de trabalho da metabolômica são críticas, pois refletirão nos resultados obtidos e, consequentemente, na interpretação biológica [26]. A Figura 1 apresenta um resumo das etapas do fluxo de trabalho que devem ser realizadas durante o desenvolvimento de um estudo metabolômico. É importante enfatizar que o desenvolvimento de metodologias em ciências ômicas, incluindo na metabolômica, requer um projeto cuidadoso dos experimentos (amostragem adequada, poder de estudo) e meticulosa execução de todas as etapas do workflow. Estimativa de estudo, poder e planejar um projeto experimental adequado é difícil, especialmente em estudos não direcionados, que são hipóteses gratuitamente. Em que, torna-se difícil estimar os efeitos observados ou metabólitos que são alterados no organismo biológico. Alguns trabalhos têm como foco o desenvolvimento de algoritmos e equações para estimar o tamanho da amostra e o poder das análises estatísticas, como uma simulação de uma abordagem multivariada [27], e cálculos de tamanho de amostra pelo MetSizeR [28] e MetaboAnalyst [29]. A aplicação correta das metodologias resumidas nesta introdução irá reduzir preconceito e falsas descobertas, revelando as relações intrincadas entre organismos estudados [30].
Novos avanços no campo da metabolômica estão focados em melhorar tecnologias analíticas e computacionais, principalmente o processamento de dados. Nesse sentido, machine learning (ML) surge como uma ferramenta importante para obter insights sobre mecanismos biológicos. ML foi inicialmente definido como "um campo de estudo
que dá aos computadores a capacidade de aprender sem ser explicitamente programado ”[31], e é considerada uma forma de inteligência. Na biologia do sistema, o ML usa dados complexos experimentais (o big data) para desenvolver algoritmos capazes de classificar ou prever modelos que discriminam os estudados em grupos ou amostras [32]. ML tem sido usado em metabolômica para fluxo de trabalho de processamento de dados, atribuição de pico de espectros de NMR e MS, seleção de recursos e integração de dados ômicos e foram revisados ​​recentemente [32–34]. Assim, haverá um enriquecimento sobre a descoberta de uma nova compreensão biológica combinando os resultados produzidos nas análises metabolômica aos métodos de ML. Assim, a abordagem de ML torna-se uma ferramenta fascinante para fazer previsões sobre o fenótipo de um organismo, que é o objetivo da metabolômica.
As aplicações da metabolômica vêm se expandindo em diversas áreas do conhecimento. Eles podem ser úteis em muitas circunstâncias como pavimentação do caminho para a descoberta de biomarcadores, pesquisando e entendendo os tratamentos e testando novos abordagens dietéticas, níveis de estresse e efeitos ambientais. Aplicações importantes estão concentradas no entendimento do mecanismo fisiopatológico de várias doenças, incluindo os arbovírus chikungunya vírus (CHIKV), dengue vírus (DENV), vírus da febre amarela (YFV) e vírus zika (ZIKV),
e são o foco desta revisão.
2 Arboviruses
Os arbovírus são um conjunto de doenças virais transmitidas por um grupo de insetos conhecidos como artrópodes, muitas vezes mosquitos e carrapatos. O termo arbovírus (um acrônimo para o vírus transmitido por artrópodes) inclui algumas famílias de vírus, como Flaviviridae, Togaviridae e Bunyaviridae, responsável por causar várias doenças como ZIKV, dengue (DENV), encefalite japonesa (JEV), chikungunya (CHIKV),Vírus do Nilo Ocidental (WNV), YFV e outros [35].
Entre as doenças causadas por arbovírus, CHIKV,DENV, YFV e ZIKV se disseminaram rapidamente em todo o mundo, custando milhões de vidas anualmente. Uma característica comum dessas doenças é a transmissão por mosquitos do gênero Aedes, principalmente Aedes aegypti, e, mais recentemente, o Aedes albopictus para infecções por CHIKV e DENV [36, 37]. A transmissão desses vírus ocorre entre vertebrados que são suscetíveis hospedeiros (mamífero, réptil ou anfíbio) e um vetor (o mosquito), que carrega e transmite o vírus. Ao picar uma pessoa infectada, o vírus se multiplica no intestino do mosquito e é distribuído para várias partes do corpo via hemolinfa (sangue de artrópode), atingindo glândulas salivares [38].
A ocorrência desses arbovírus emergentes é esporádica até a ocorrência de grandes epidemias em vários países, principalmente na África, Ásia e América Latina, com altas taxas de mortalidade. DENV é o arbovírus mais frequente em todo o mundo [39], afetando cerca de 390 milhões por ano [40]. CHIKV teve seu principal surto no início de 2000 [41], e apenas em 2020, mais mais de 50.000 casos foram notificados no Brasil [42]. Surtos para ZIKV ocorreu na década de 1960 a 1980, na África e na Ásia, mas apenas entre 2015 e 2016, esta infecção ganhou destaque em todo o mundo, durante o surto no Brasil [43]. YF afetacerca de 80 a 200 mil pessoas em todo o mundo [44]. A propagação
dessas infecções tem sido associada ao rápido e desordenado crescimento populacional, falta de saneamento e falta de controle do transmissor. Além disso, o aumento da mobilidade humana contribuiu para a expansão geográfica do mosquito vetor.
DENV possui quatro sorotipos distintos (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4) sorológica e geneticamente diversos, que incluem duas síndromes conhecidas como febre dengue (DF) e febre hemorrágica da dengue (DHF) [36]. Infecção por ZIKV tem causado grande preocupação na comunidade médica desde que é cientificamente comprovado que o ZIKV pode causar microcefalia nos fetos durante a gravidez [45, 46] e outros distúrbios neurológicos, que estão sendo estudados [47]. Adicionalmente, CHIKV e ZIKV foram associados a síndrome de Guillain – Barré [48, 49]. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), os sintomas desses arbovírus se sobrepõem, incluindo febre, dor de cabeça, dor nas articulações e erupção cutânea, o que o torna desafiador diagnosticá-los e diferenciá-los. A Tabela 1 acima compara os sintomas mais comuns e as possíveis complicações associadas a essas quatro infecções [36, 43, 50, 51].
O tratamento dessas doenças carece de medicamentos disponíveis devido ao mal-entendido do mecanismo molecular da biologia do vírus e a ausência de um modelo animal para testes pré-clínicos. Em geral, cuidados paliativos com analgésicos e antiinflamatórios são usados ​​para dor e artralgia em Pacientes com CHIKV [48, 52, 53]. Além disso, para DENV, alguns antivirais e corticosteroides foram testados [39]. YF é o único arbovírus com uma vacina consolidada para prevenção: a vacina de vírus vivo atenuado de YFV (YFV-17D) [44, 54]. Até o momento não há uma vacina para CHIKV e ZIKV. O DENV tem uma vacina, o CYD-TDV (vacina tetravalente atenuada viva), desenvolvida em 2015, o que não confere 100% de imunidade [55]. Alguns estudos indicam o risco de desenvolver dengue grave, dependendo da idade do paciente e sorotipo em indivíduos que foram imunizados com a vacina [36]. Não há compreensão quanto ao mecanismo de ação dessa vacina. Os pesquisadores encontraram taxas de imunogenicidade e anticorpos cerca de dez vezes maior em indivíduos que já haviam sido infectados com DENV, do que naqueles soronegativos [56]. Provas apontam que os anticorpos produzidos durante a primeira infecção por DENV podem se conectar ao vírus na segunda infecção, ajudando-o a invadir outras células do sistema imunológico e disseminando-se no organismo. Nesse sentido, a metabolômica combinada com outras ciências ômicas, como genômica e transcriptômica, poderiam ajudar a descobrir uma vacina segura e mais eficaz para o DENV, por meio de estudos focados no sistema imunológico de modelos in vitro e in vivo. Metabólitos principais, incluindo hormônios, citocinas e ácidos graxos (FAs), agem como sinalização celular e influenciam a resposta imune [57]. O estudo dos processos envolvidos na infecção pelo vírus pode contribuir fortemente para auxiliar na busca de caminhos-alvo para tratamentos eficazes e ação vacinal.
3 Metabolomics applications in arboviroses
Relatórios sobre estudos de metabolômica de doenças negligenciadas, incluindo DENV [58], bem como uma avaliação detalhada de mudanças no metabolismo de ZIKV, DENV e CHIKV em abordagens metabolômica e lipidômica [49], são encontradas na literatura. Essas análises e nossas experiências mostram que a metabolômica tornou-se uma área de referência para estudar a intrincada relação entre organismos biológicos e os mecanismos envolvidos em diferentes doenças, incluindo aquelas causada por arbovírus. Assim, aqui pretendemos compilar e discutir os trabalhos envolvendo abordagens metabolômica no estudo de infecções emergentes (DENV, CHIKV, YFV, e ZIKV), transmitidas por mosquitos A. aegypti. Uma compilação de percepções metabólicas para DENV e outras doenças negligenciadas priorizadas no Brasil já foi publicado em 2015 [59]. Nesse sentido, novas pesquisas envolvendo a infecção por DENV, publicadas nos anos seguintes, são descritos aqui.
A Tabela S1 em Informações suplementares resume os trabalhos de metabolômica, destacando a abordagem (direcionada- targeted ou não direcionada- untargeted), técnica analítica, tipo de amostra, e grupos estudados (amostragem), metabólitos alterados ou classes químicas e nível de identificação de MSI (a Sociedade de Metabolômica, do inglês, Metabolomics Society, criou em 2005, o Metabolomics Standards Initiative (MSI) <http://www.metabolomics-msi.org/>, que define uma padronização no procedimento adotado nos estudos e publicações de trabalhos em metabolômica). Em geral, nossa compilação demonstrou que a metabolômica não direcionada (untargeted) foi a principal abordagem usada para estudar arbovírus, compreendendo 73% das referências listadas nas informações suplementares da tabela S1. A abordagem direcionada (targeted), principalmente para a quantificação dos FAs, é aplicado em 15% dos trabalhos de pesquisa.
O uso de ambas as abordagens, direcionadas e não direcionadas, foi observada em apenas três estudos (12%) [60–62]. A avaliação em termos de abordagens indica como essas doenças são mal compreendidos, uma vez que a maioria dos estudos se concentra em uma primeira triagem metabólica, caracterização do metaboloma, e não no aprofundamento das rotas metabólicas e analíticas para quantificação de possíveis biomarcadores.
Diferentes técnicas analíticas, como NMR, GC-MS, LC-MS (HILIC-Hydrophilic interaction chromatography e RP-reversed-phase) e injeção direta de MS são usados. Determinar o metaboloma de organismos complexos é impraticável e, portanto, para aumentar o intervalo de detecção em termos físico-químicos, recomenda-se usar mais do que uma técnica analítica [10]. Curiosamente, mesmo a maioria dos estudos aqui use a abordagem untargeted, apenas quatro (15%) se aplicam multiplataforma [62–65]. O MS é a detecção mais aplicada técnica (77%), enquanto 1H NMR e GC-FID (chama detector de ionização) compreendem 19 e 4%, respectivamente. MS tem sido usado no modo de injeção direta, mas é principalmente acoplado com técnicas de separação como LC-MS. Os metabólitos detectados por HILIC-MS, que abrange compostos hidrofílicos, como aminoácidos e aminas, fornecem importantes percepções sobre as alterações do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e metabolismo de energia. As análises RPLC (Reversed Phase Liquid Chromatography) permitem a distinção de metabólitos médios e não polares, como derivados de lipídios (glicerolipídios, esfingolipídios, fosfolipídios, etc.), FAs e nucleotídeos. Estes são metabólitos essenciais para a manutenção celular e replicação viral, atuando como sinalizador em diversas vias e expressão gênica [49]. Abordagens lipidômicas utilizadas para entender DENV [66, 67] e ZIKV [68- 70] foram encontrados na literatura. Esses estudos apresentam informações importantes sobre o metabolismo dessas infecções, que complementam os estudos de metabolômica, mas não são listados na Tabela S1, pois eles não são o foco desta revisão.
Dengue tem sido, sem dúvida, o arbovírus mais investigado pela metabolômica. Em geral, os trabalhos têm foco na compreensão do mecanismo de infecção por esses arbovírus e diferenciação [61, 63, 71-75], replicação viral [76- 78], progressão e gravidade da doença [60, 79-85], associação com distúrbios neurológicos [65, 86] e novos propósitos para o diagnóstico [62, 64, 87-89]. A maioria desses estudos é realizada in vivo usando amostras de soro / plasma, urina, saliva e mosquitos (A. aegypti). Estudos com foco na elucidação da capacidade de infecção em células DENV [63, 77], YF [84] e ZIKV [65] em momentos diferentes, bem como a diferenciação de Infecção por ZIKV em células humanas e de mosquito (A. albopictus) [75], também foram encontrados.
Não há consenso na literatura especializada sobre o tamanho de amostra ideal para estudos de metabolômica. Alguns pesquisadores sugerem que os estudos-piloto que compreendem uma amostra igual ou maior a 20 fornecemuma boa análise de potência [27, 90]. No geral, estes as investigações compreendem projetos de estudo razoáveis ​​(n> 20), e apenas alguns trabalhos foram encontrados com um tamanho de amostra entre 10 e 17 (estudos piloto) [74, 89], conforme apresentado na Tabela S1. Apesar de trabalhar com grandes amostras de coorte, poucos estudos fornecem informações detalhadas sobre o desenho dos experimentos, aplicação de QC / QA (Quality Controle / Garantia de Qualidade) e validação de método [60, 61, 64, 65, 83, 84], de acordo com os protocolos MSI.
Não há protocolos adequados de preparação de amostra para metabolômica. Em trabalhos untargeted, precipitação de proteínas para plasma e soro, diluição da amostra (saliva e urina) e extração de metabólitos usando uma mistura de solventes orgânicos (metanol ou acetonitrila) e água foram encontrados. A preparação da amostra sem muitas etapas é consistente com a abordagem untargeted, com o objetivo de alcançar a maior cobertura possível do metaboloma. Além disso, solventes compatíveis com as fases móveis que constituem o analítico e métodos aplicados (a maioria para análise por RPLC-MS e HILIC-MS) são utilizados, bem como o uso de solventes deuterados para NMR. A Tabela 2 resume as preparações gerais da amostra de acordo com o tipo de amostra dessas obras untargeted.
Um trabalho target descreveu o desenvolvimento e validação de métodos analíticos para a determinação de esterificados FAs por GC-MS mostrando boa recuperação (92-101%) e precisão (<5,0%). Amostras de sangue foram extraídas com metanol / diclorometano (2: 1, v / v), seguido por transesterificação com KOH em metanol. Os autores afirmam que este método poderia ser usado para diagnosticar o estágio inicial de Dengue, quantificando 17 FAs (Fatty acids- ácidos graxos) em 59 min [80]. Um método para quantificação de ácidos siálicos por LC-MS, sem a necessidade de derivatização dos analitos, foi desenvolvido por Espinosa et al. Nesse trabalho, precipitação simples de proteínas das amostras de soro de ratos com foram realizadas com acetonitrila. Após a secagem, o extrato foi reconstituído na fase móvel, e o pH ajustado com acetato de amônio (pH 9,0) [79]. A grande vantagem deste método de extração simples é que não há necessidade de derivatização (adição de fluoróforo) nos analitos para análise de HPLC desde que a análise LC-MS com MRM forneceu a detecção precisa de ácidos siálicos e isômeros derivados. Outras investigações targeted estão se concentrando na compreensão da progressão da doença usando GC-FID (cromatografia gasosa com detetor de ionização de chamas) para determinar ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) [81], e GC-MS na caracterização de FAs em plaquetas de pacientes infectados com DENV [82]. FAs, aminoácidos e derivados do colesterol, não são voláteis no programa de temperaturas do GC, portanto, exigindo derivação. Este processo é comumente realizado após a extração de lipídios da matriz complexa usando o Método Bligh & Dyer [91], e então convertendo FA ou PUFAs em seus ésteres metílicos correspondentes. Villamor et al. utilizou boro/trifluoreto-metanol para derivatização de PUFAs no soro de amostras, seguido pela extração dos ésteres metílicos com hexano / solução com água (2: 1, v / v) [81]. Considerando que, Samadanam e colaboradores usaram metanol e ácido sulfúrico para esterificação e hexano para extinção e extração [82]. Ácidos e bases comumente catalisam a esterificação. Em geral, a catálise básica é mais rápido e completa em baixas temperaturas, enquanto catálise de ácido produz artefatos e causa mudanças na configuração de ligações duplas em moléculas [92]. BF3, por outro lado, embora amplamente aplicado como um catalisador para metilação, é prejudicial à saúde e tem vida útil limitada, além disso para também produzir artefatos derivados de FAs (ácidos graxos) [92, 93].
O mecanismo de evolução do DENV para formas mais graves, especialmente avaliando amostras de soro humano, tem sido o foco das investigações metabolômica [60, 81-84]. Contudo, compreender o metabolismo e função celular poderia ajudar no desenvolvimento de protótipos de novos medicamentos. Assim, no caso do acometimento do DENV-2 em fibroblastos de prepúcio humano (HFF), as células infectadas foram comparadas, em momentos diferentes, às células do grupo controle para avaliar o curso da infecção [63]. Apesar da dificuldade de encontrar um modelo animal apropriado para o estudo da doença, o modelo húmice (camundongos humanizados) foi utilizado por Cui et al. Depois de comparar as mudanças causadas pela infecção por DENV-2 com dados da literatura em humanos, os autores encontraram semelhanças das respostas do host [64]. Um dos desafios significativos no estudo desses arbovírus é a ausência de modelos animais para o estudo dessas doenças. Os resultados encontrados por Cui et al. abre um espaço para novas aplicações deste modelo, principalmente na busca de novos tratamentos ou no estudo de terapias de reposicionamento, tão urgentes para o tratamento dessas doenças emergentes.
Voge et al. contribuiu para a diferenciação de casos graves de dengue em pacientes de diferentes populações e idades, e caracterizou o metaboloma da infecção viral [84]. Usando abordagens direcionadas e não direcionadas, Cui e colaboradores demostraram a serotonina como um metabólito importante que diferencia DF e DHF em amostras de soro, sugerindo que a diminuição nos níveis deste metabólito pode ser utilizada como um marcador preditivo da gravidade do DENV [60]. Também, avaliaram mecanismos que contribuem para a transição de DF a DHF, em metabolômica não direcionada, demostrando mudanças em mais de 20 metabólitos em amostras de soro, entre os quais o aumento nos níveis de ácidos biliares chamou a atenção por contribuir para o aparecimento de doenças intestinais e disfunções hepáticas [83]. Uma vez que o fígado é um órgão centro envolvido no metabolismo lipídico, El-Bacha e colaboradores encontraram alterações metabólicas associadas nos níveis de VLDL / LDL (lipoproteínas de densidade muito baixa / lipoproteínas de baixa densidade), glutamina, e outros metabólitos para disfunção hepática em pacientes com infecções primárias e secundárias por DF e DHF [85]. Avaliar a recorrência da doença pode ser importante para finalidades de diagnóstico, especialmente porque sabemos que a recorrência da infecção DENV aumenta o grau de gravidade e reduz as taxas de recuperação dos pacientes. 
Estudos com foco convergente na diferenciação de doenças, principalmente para fins de diagnóstico usando amostras não invasivas, como urina, raramente são encontrados. A comparação entre indivíduos saudáveis ​​e infectados, por análise por NMR, encontrou 13 metabólitos up regulados ou down regulados associados com energia mitocondrial e metabolismo de β-oxidação [71]. Em trabalho anterior, o mesmo grupo de pesquisa demonstrou diferenças metabólicas significativas causadas pela infecção de acordo com o gênero, permitindo a modulação fatores de risco da infecção [72]. Um estudo recente pesquisou biomarcadores para diagnóstico de DENV através de um teste respiratório não invasivo. As amostras da expiração foram coletadas por um dispositivo de amostragem (BioVOC) e analisado por GC-MS. Seis compostos orgânicos voláteis (VOCs) foram considerados discriminantes entre saudáveis ​​e grupos infectados. Com base nesses resultados, os autores desenvolveram uma matriz de vários chips e sensores de gás quimiorresistivo, construídos sobre nanopartículas de metal capadas com ligante, para se tornar um possível teste respiratório para diagnóstico rápido de DENV [87]. Este interessante trabalho demonstra o grande potencial da metabolômica como uma ciência básica para o desenvolvimento de novos produtos e sua aplicação em medicina de precisão.
O efeito da microbiota intestinal de A. aegypti na restauração e a inibição da atividade de DENV é conhecida, provavelmente devido a produção de metabólitos secundários pela população de bactérias e fungos [94]. Com base nisso, a avaliação do ambiente metabólicoinduzido durante a replicação do vírus no mosquito foi realizada pela primeira vez por análise untargeted de tecido do intestino médio do mosquito após infecção. Os resultados apontaram para aumentos nos níveis de alguns ácidos graxos, glicerofosfolipídios, e esfingolipídios, sugerindo várias fontes de produção de energia para replicação viral [76]. Recentemente, Vial et al. realizaram um estudo integrativo metabolômico e lipidômico para avaliar os estágios do ciclo de vida de DENV em células e mosquitos em diferentes tempos de infecção (Fig. 2A). Os resultados demonstram como o vírus modifica o metabolismo do mosquito para facilitar sua replicação. Diferentes classes de metabólitos foram associadas a infecção (Fig. 2B), e um mecanismo para reconfigurar o conteúdo de aminofosfolipídios foi descrito como um possível alvo para intervenção de transmissão de doenças [77].
Figura 2. Metabolômica no estudo de infecções por DENV em mosquitos. (A) Estratégia esquemática do projeto experimental. (B) Metabólito
alterações em diferentes tempos de infecção nas células, intestino médio e mosquito inteiro. Adaptado de [77]. Permissão de direitos autorais de acordo com Termos de atribuição Creative Commons (CC BY).
Em relação à diferenciação entre DENV e outros infecções virais, poucos estudos são encontrados na literatura [61,73, 74]. Cui et al. investigou as diferenças entre o metabolismo de DENV e infecção por influenza (IVI). O estudo avaliou indivíduos saudáveis ​​e pacientes com diagnóstico de DENV ou IVI por abordagens untargeteds e targeteds. Os resultados demonstraram diferenças entre infecções por DENV e IVI, em que as respostas do hospedeiro são mais suaves e mais persistentes em pacientes com IVI do que DENV. Diminuições significativas na serotonina, ácidos biliares e níveis de biliverdina foram destacados em pacientes positivos para DENV [61]. Em outra pesquisa integrativa, por metabolômica, proteômica e transcriptômica, Shrinet et al. estudaram o estresse oxidativo para combater a infecção por CHIKV e DENV em amostras de hemolinfa de A. aegypti. O projeto experimental abrange amostras mono e co-infectadas (DENV / CHIKV) em momentos diferentes após a infecção. Adicionalmente, a informação em bancos de dados públicos foi usada para entender o metabolismo afetado no mosquito por DENV e infecções por CHIKV. Principais vias metabólicas perturbadas incluem as vias de fosforilação oxidativa, nas quais a taurina e as vias de hipotaurina mostraram diferenças significativas em Infecções por CHIKV e glicólise / gliconeogênese em DENV [73]. Um trabalho anterior envolvendo o estudo de DENV / CHIKV mono e coinfecções, também foi publicado pelo mesmo grupo de pesquisa, no qual investigaram as diferenças em padrões metabólicos com base na infecção, idade e sintomas dos pacientes. O metabolismo da glicina, serina e treonina, junto com a galactose, foram as vias metabólicas mais afetadas pelas doenças. Um destaque, relacionado ao envolvimento ósseo-articular, foi a regulação positiva da hipoxantina em pacientes com CHIKV. A hipoxantina, com xantina e ácidos úrico, estão associados com processos inflamatórios, especialmente aqueles que envolvem artrite. Este trabalho traz a possibilidade de desenvolver novos ferramentas para diagnóstico e diferenciação de CHIKV e DENV [74]. Além dos dois estudos abordados aqui, nenhum estudo envolvendo análise metabolômica, exclusivamente para infecção por CHIKV, foi encontrado na literatura.
As investigações metabolômicas de YF e ZIKV são escassas (Tabela S1). Para ZIKV, existe um interesse crescente, principalmente devido ao recente surto no Brasil em 2015 e o aparecimento de casos de microcefalia. Para YF, acreditamos que a escassez de obras é uma consequência da vacina eficaz e métodos de prevenção consolidados. Alguns artigos foram encontrados para a metabolômica de YF. O primeiro focado no desenvolvimento de uma abordagem de rede de previsão, usando dados obtidos de metabolômica não direcionada, de células dendríticas infectadas com YFV. Neste trabalho, os autores desenvolveram um algoritmo capaz de acelerar a identificação do metabólito no fluxo de trabalho da metabolômica e a correlação com as vias metabólicas [95]. Mais recentemente, por meio de integração entre análise de transcriptômica e metabolômica, a base molecular dos sintomas de infecção por YF foi avaliada antes e após imunização com YF17D, por Chan et al. Esse foi o único trabalho focado no estudo de arbovírus que usou CE-MS na análise metabolômica não direcionada. A análise de metabólitos polares por CE-MS mostrou alterações em níveis de citrato, isocitrato e malato, metabólitos importantes de o ciclo TCA. Os resultados integrados das plataformas ômicas sugerem que vias metabólicas específicas e a resposta ao estresse pode servir como alvos terapêuticos para sintomas de YFV e outras infecções semelhantes, causadas por um flavivírus [62].
Nosso grupo de pesquisa e colaboradores têm se dedicado para estudos exploratórios de metabolômica para entender os mecanismos de infecção pelo ZIKV em pacientes adultos, e alterações metabólicas causadas em recém-nascidos com diagnóstico de ZIKV (manuscritos em preparação). Até agora, seis estudos foram encontrados usando metabolômica não direcionada [65, 75, 78, 86, 88, 89] envolvido na infecção por ZIKV e consequente dano neurológico. O primeiro estudo foi publicado em 2017 por pesquisadores da Rede Zika-UNICAMP, da Universidade Estadual de Campinas (Brasil) e colaboradores. Nesta investigação, alterações foram encontradas em metabólitos envolvidos nas células de processos de sinalização (fosfatidilinositol), replicação viral (angiotensina), e receptores de membrana viral associados com síndrome de Guillain-Barré (gangliosídeos) [78]. Esses pesquisadores têm contribuído significativamente para o entendimento de arbovírus, com estudos lipidômicos no ZIKV [70] e DENV [66], mencionado acima. Este grupo de rede também possui o objetivo de desenvolver uma metodologia de triagem para o diagnóstico de zika.
Dados metabolômicos da análise de MS foram combinados com modelo de predição de ML para desenvolver um algoritmo para diagnóstico rápido de ZIKV. Usando o método da Floresta Aleatória, uma assinatura espectral foi obtida com 42 características (m / z relação massa-carga) (Fig. 3), de 10.000 m/z identificados por paciente em perfis de amostras de soro de indivíduos saudáveis ​​e positivos para ZIKV. Curiosamente, foi possível diferenciar os pacientes após a fase aguda da doença (30 dias após a infecção). Os resultados fornecidos pelo algoritmo estavam de acordo com aqueles obtidos por RT-PCR (polimerase de transcrição reversa reação em cadeia), um método convencional de diagnóstico. De acordo com os autores, este método pode ser uma ferramenta poderosa para Diagnóstico ZIKV e a criação de um grande banco de dados fornecendo informações patológicas e epidemiológicas preditivas da doença [88]. ML com Regressão Logística e Os algoritmos Suporte da Vector Machine também foram usados ​​em um processo preliminar estudo para diferenciar o ZIKV de pacientes saudáveis. O método desenvolvido obteve 98% de precisão na classificação da amostra [89].
Figura 3. Características mais discriminantes na escala de assinatura espectral, comparação de controle (vermelho) e ZIKV positivo (azul). M / z realçado de verde representam marcadores de ZIKV. Adaptado de [88]. Permissão de direitos autorais de acordo com os termos de atribuição Creative Commons (CC BY).
Na busca pela compreensão da síndrome congênita do Zika e microcefalia, um estudo recente avaliou bebês e amostras de saliva cujas mães foram infectadas pelo ZIKV. Derivados de prostaglandinas e hepoxilina foram identificados como possíveis biomarcadores anti-inflamatórios, e os autores correlacionaram microcefalia como um produto da resposta imune do hospedeiro [86]. Diop et al. avaliou células da microglia após tempos diferentes da infecção por ZIKV, em que glicerofosfolipídios, amino ácidos e vias do ácido linoléico foram destacados. Elesdescobriram que as células da microglia secretam algumas citocinas as quais são metabólitos pró-inflamatórios associados com a indução de neuroinflamação por ZIKV [65].
Um estudo pioneiro, usando análise de fluxo metabólico, para mapear vias alteradas devido à glicose avaliaram a diferença em Infecção por ZIKV em células hospedeiras e mosquitos vetores. De acordo com os autores, um mecanismo de reprogramação diferenciado da morte celular entre humanos e A. aegypti desempenha um papel importante na replicação viral e morte celular [75].
4 Concluding Remarks
A metabolômica é um importante aliado no estudo do metabolismo de organismos complexos e é uma área multidisciplinar da ciência na qual os metabólitos devem ser identificados de forma confiável de modo que as interpretações biológicas reflitam o fenótipo do organismo estudado. Metabolômica tem sido uma ferramenta crescente para investigação de arbovírus transmitidos por A. aegypti, especialmente no estudo do DENV e, mais recentemente, do ZIKV. O trabalho envolvendo o estudo do CHIKV e do YFV ainda é limitado. LC-MS é a técnica analítica mais amplamente utilizada no estudo desses arbovírus, dada sua versatilidade de cromatografia e colunas disponíveis. CE-MS tem potencial proeminente para aplicação em estudos de metabolômica, tanto para a determinação de compostos altamente polares e, como demonstrado recentemente, para expandir a cobertura do metaboloma, detecção de lipídios iônicos não polares e derivados [96, 97]. Estudos de metabolômica indicam mudanças importantes na energia do metabolismo associadas às relações vírus-hospedeiro, lipídios nas mudanças da replicação viral e a presença de biomarcadores relacionadas a sintomas e consequências de doenças como alterações neurológicas causadas pelo ZIKV, por exemplo. Apesar de resultados interessantes da compreensão biológica desses arbovírus, falta planejamento dos experimentos de metabolômica de acordo com as recomendações do MSI. Pesquisadores possuem uma grande preocupação em responder à alguma questão biológica, mas pouca para desenvolvimentos analíticos, especialmente na preparação de amostras e identificação de metabólitos. Isso é evidenciado pelo grande número de obras cujas identificações compreendendo os níveis 2 a 4 do MSI (Tabela S1). Assim, há necessidade de melhorias e adoção de protocolos MSI para aumentar o nível de confiabilidade dos resultados obtidos e, consequentemente, das hipóteses explicadas biologicamente. Alguns métodos analíticos para determinar biomarcadores foram desenvolvidos e estratégias baseadas em inteligência tem sido usada para construir bancos de dados para diagnóstico de doenças. A busca por novas terapias tem sido pouco explorada, embora exista uma demanda urgente por essas doenças que não têm tratamentos especializados. Assim, observamos uma lacuna importante com novas oportunidades para investigação pela metabolômica. Outro nicho importante para ser explorado é a diferenciação do diagnóstico entre esses arbovírus e outras doenças virais, para uso de abordagens mais eficazes de tratamento, aumentando as taxas de cura destes doenças.
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