Métodos laboratoriais no diagnóstico, seguimento e complicações - doença infecciosa

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☆ Diagnóstico sorológico - HIV
Triagem → Máxima Sensibilidade + Confirmatório → Máxima Especificidade
Os testes Confirmatórios utilizam diferentes formatos e princípios. A combinação de 2 ou mais testes, formando um 
Fluxograma, tem como objetivo aumentar o Valor Preditivo Positivo (VPP).
2 testes rápidos (TR1 e TR2) realizados em sequência com amostras de sangue•
Um teste rápido utilizando fluido oral (TR1-FO) seguido por um teste rápido utilizando sangue (TR2)•
Baixa infraestrutura laboratorial | Mutirões
Imunoensaio de 4ª geração seguido de teste molecular como teste complementar•
Imunoensaio de 3ª geração seguido de teste molecular como teste complementar•
Banco de Sangue
Imunoensaio de 3ª geração seguido de Western Blot, imunoblot ou imunoblot rápido como teste complementar•
Imunoensaio de 4ª geração seguido de Western Blot, imunoblot ou imunoblot rápido como teste complementar•
Laboratório de Análises Clínicas
Marcadores da infecção por HIV
☆ IMUNOENSAIOS
Os IMUNOENSAIOS são métodos bioanalíticos que medem a presença ou concentração de analitos (amostra do paciente) 
através do uso de um anticorpo ou antígeno como agente de detecção.
As interações específicas que ocorrem durante a resposta imune possibilitaram o desenvolvimento dos Imunoensaios.
IMUNODIAGNÓSTICO → Diagnóstico laboratorial feito por meio de técnicas imunológicas
Os anticorpos são imunoglobulinas que se ligam de forma específica a antígenos, naturais e sintéticos:
proteínas; carboidratos; ácidos nucleicos; lipídeos; outras moléculas
O ELISA direto envolve a ligação do antígeno à fase sólida, seguida da utilização de um anticorpo marcado com enzima.➢
ELISAs indiretos também envolvem a ligação do antígeno a uma fase sólida, mas, neste caso, o anticorpo primário não está 
marcado. Um anticorpo secundário conjugado com enzima, dirigido para o primeiro anticorpo, é então adicionado. Este formato é
usado com mais frequência para a detecção de anticorpos específicos em soro.
➢
☆ IMUNODIAGNÓSTICO
Hipersensibilidade a determinados antígenos: reações intradérmicas e percutâneas;-
Presença de anticorpo ou antígeno no organismo do paciente: ensaios de imunoprecipitação, aglutinação e neutralização;-
Sinalizadores da interação antígeno-anticorpo (Ag-Ac) com ligantes conjugados: ensaios de imunofluorescência (Citometria de 
Fluxo), radioimunoensaio, imunoenzimáticos (ELISA; Western Blot), imunofluorimétricos e quimioluminescência.
-
➜ ANTÍGENOS → proteínas, carboidratos, ácidos nucleicos, lipídeos, outras moléculas.
Teste de ELISA (Imunoenzimático)⚫
"Permite a detecção de anticorpos (Ac) e antígenos (Ag) específicos no soro/plasma sanguíneo"
Aplicações: Doenças infecciosas; Detectar alergias; Doenças autoimunes
Fase de Incubação: Permite que ocorra a ligação antígeno/anticorpo•
Lavagem: Permite a retirada de excesso de anticorpo, e na ausência de ligação antígeno/anticorpo, mantém a reação limpa•
✻ Tipo I: 6 a 8 semanas 
Aula 3 - Métodos laboratoriais no diagnóstico, 
seguimento e complicações - doença infecciosa 
sexta-feira, 28 de fevereiro de 2020 16:17
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Fase de Incubação: Permite que ocorra a ligação antígeno/anticorpo•
Lavagem: Permite a retirada de excesso de anticorpo, e na ausência de ligação antígeno/anticorpo, mantém a reação limpa•
Placa sensibilizada com o antígeno de interesse;1.
Amostra do paciente é incubada na placa contendo o antígeno selecionado;2.
Caso o paciente possua anticorpo para aquele antígeno ocorrerá uma reação de antígeno/anticorpo, o anticorpo se ligará na fas e 
sólida, e após a lavagem ele permanecerá ligado. Caso não tenha anticorpo, para o antígeno selecionado, durante a fase de lav agem 
toda a amostra é retirada da placa;
3.
Na sequência, será adicionado o Anti-IgG ligado a uma enzima, esse Anti-IgG, se ligará no complexo Antígeno/anticorpo formado na 
etapa 3;
4.
Na etapa 5, ocorre uma cascata de ligação de: Antígeno + Anticorpo + Antígeno ligado a enzima;5.
Nesta etapa, será adicionado um substrato, alvo da enzima acoplada ao Anti -IgG. Se toda a reação anterior aconteceu, essa enzima 
irá degradar o substrato, gerando uma reação colorimétrica indicando a presença do anticorpo. Desta forma, quanto maior a 
intensidade da cor, maior a quantidade de anticorpo presente na amostra utilizada.
6.
↪E se fosse negativo? Toda reação que ocorre a partir da etapa 3 não aconteceria, e não haveria enzima para degradar o 
substrato, mantendo a solução incolor.
✻ Tipo III: 22-25 dias
Placa sensibilizada com o antígeno de interesse;7.
Amostra do paciente é incubada na placa contendo o antígeno selecionado;8.
Caso o paciente possua anticorpo para aquele antígeno ocorrerá uma reação de antígeno/anticorpo, o anticorpo se ligará a fase
sólida, e após a lavagem ele permanecerá ligado. Caso não tenha anticorpo, para o antígeno selecionado, durante a fase de lav agem 
toda a amostra é retirada da placa;
9.
Na sequência, será adicionado um conjunto de peptídeos síntéticos específicos para HIV, ligado a uma enzima,, se ligará no 
complexo Antígeno/anticorpo formado na etapa 3;
10.
Na etapa 5, ocorre uma cascata de ligação que recebe o nome de sanduíche de: Antígeno + Anticorpo + Antígeno ligado a enzima;11.
Nesta etapa, será adicionado um substrato, alvo da enzima acoplada ao Antígeno. Se toda a reação anterior aconteceu, essa enz ima 
irá degradar o substrato, gerando uma reação colorimétrica indicando a presença do anticorpo. Desta forma, quanto maior a 
intensidade da cor, maior a quantidade de anticorpo presente na amostra utilizada.
12.
✻ Tipo IV: 15 dias
Placa sensibilizada com o antígeno de interesse e anticorpo p24;1.
✻ Tipo I: 6 a 8 semanas 
✻ Tipo II: 28-30 dias
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Placa sensibilizada com o antígeno de interesse e anticorpo p24;1.
Amostra do paciente é incubada na placa contendo o antígeno e anticorpo selecionado;2.
Caso o paciente possua anticorpo para aquele antígeno, e a proteína para o anticorpo, ocorrerá uma reação, ocorrendo a ligaçã o do 
anticorpo e/ou proteína a fase sólida, e após a lavagem ele permanecerá ligado. Caso não tenha anticorpo/proteína, para o 
antígeno/anticorpo selecionado, durante a fase de lavagem toda a amostra é retirada da placa;
3.
Na sequência, será adicionado um conjunto de peptídeos síntéticos específicos para HIV, ligado a uma enzima e um anticorpo p2 4 
acoplado a uma enzima, se ligará formando um complexo;
4.
Na etapa 5, ocorre uma cascata de ligação que recebe o nome de sandwiche de: Antígeno + Anticorpo + Antígeno ligado a enzima/
Anticorpo+Proteína+Anticorpo;
5.
Nesta etapa, será adicionado um substrato, alvo da enzima acoplada ao Antígeno/anticorpo. Se toda a reação anterior aconteceu , 
essa enzima irá degradar o substrato, gerando uma reação colorimétrica indicando a presença do anticorpo/proteína. Desta form a, 
quanto maior a intensidade da cor, maior a quantidade de anticorpo presente na amostra utilizada.
6.
↪ E se fosse negativo? Toda reação que ocorre a partir da etapa 3 não aconteceria, e não haveria enzima para degradar o 
substrato, mantendo a solução incolor.
★ COVID 19
Os sintomas do Coronavírus (COVID-19) são principalmente respiratórios, semelhantes a um resfriado.
Dor de cabeça; Dificuldade de respirar; febre; tosse; coriza; dor de garganta
COMO É REALIZADO O DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL? RT-Qpcr
PCR → Amplificação de fragmentos de DNA específicos•
qPCR → Quantificação dos fragmentos amplificados•
 
 
Para o diagnóstico do COVID → tem que detectar os fragmentos do DNA do vírus
o primer é específico para o vírus
o primer se liga → polimerase vai e amplifica
quando o paciente é + → o número do DNA vai aumentando
Extração do RNA → RT-qPCR → Primer específico COVID-19 → Quantificação
a cada ciclo é contada quantas moléculasde DNA tem
Desnaturação →A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única.➢
Anelamento → Após a separação das fitas, os primers (uma fita de DNA específica para 
o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser 
amplificada. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam a fita.
➢
Extensão → Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases 
complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a duplicação da fita 
de DNA.
➢
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