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3 ESTUDO DIRIGIDO – FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA Bioquímica FF-II BQM103 Professora: Ana Paula Valente Monitora: Daniela A. Aluna: Riselly Fatima Lopes 1. Pois Keilin mostrou que em diferentes animais, os espectros de absorção dos citocromos eram os mesmos, e que separadamente esses animais também apresentavam o mesmo espectro para as hemoglobinas. Entretanto, comparativamente, os citocromos e hemoglobinas apresentavam espectros de absorção bem diferentes, provando se tratar, portanto, de compostos diferentes. Além disso, Keilin utilizou também animais sem sangue em seu experimento, e o mesmo padrão de citocromos se repetiu, comprovando de vez a hipótese de que a hemoglobina era a carreadora de elétrons. A confusão entre citocromos e hemoglobina deve-se a presença de ferro e enxofre na composição de ambas as substâncias, além de serem as únicas, até aquele momento, a apresentar bandas de absorção. 2. a. As bandas desaparecem, pois os citocromos são oxidados. b. As bandas vão aparecendo conforme os citocromos são reduzidos. c. As bandas vão desaparecendo conforme os citocromos são oxidados. d. As bandas ficam aparentes, mesmo na presença de oxigênio, pois o cianeto de potássio impede o transporte de elétrons até seu aceptor final. 3. Cianeto de potássio é um inibidor da enzima C oxidase que fica no citocromos C da cadeia fosforilativa que impede o transporte de elétrons para o citocromos a+a3 e a acepção final deles pelo oxigênio. Dessa forma, o último citocromo fica oxidado e os demais reduzidos. Não, ele não funciona como agente redutor, pois o cianeto não recebe os elétrons da cadeia fosforilativa, apenas inibe uma enzima desse processo, impedindo o fluxo normal dele. Nessas condições b, c1 e c ficam reduzidos e a+a3 fica oxidado, pois o cianeto impede o transporte de elétrons entre os citocromos c e a+a3. 4. No experimento está sendo fornecido como substrato à reação o piruvato, sinalizando que toda a produção de ATP ocorrida na presença desse piruvato vinha das etapas após as de geração dele na glicólise. A lavagem com solução salina servia para remover a glicose e outros intermediários da via glicolítica do músculo, afim de ter a certeza de que esse ATP produzido não teria interferência nenhuma da glicólise, 4 provando em definitivo que os processos não estão acoplados necessariamente a glicólise, mas sim a um intermediário, o piruvato. Outro experimento que poderia ser feito para reafirmar os resultados obtidos é a repetição desse mesmo processo descrito acima em tecidos provenientes de outros animais. 5. Os requisitos foram a presença de AMP (ou ADP), por ser um receptor de fosfato, de Pi livre (fosfato livre), para ser complexado ao AMP, e de lactato, para formar o piruvato e dar início ao ciclo que gerará ATP. Esperaremos encontrar uma baixa concentração de Pi livre, já que ele estará sendo complexado no AMP (ou ADP) para formar ATP. 6. O arsênio atua na inibição do complexo 1 da cadeia respiratória, impossibilitando, portanto, que o malato e o fumarato sejam efetivos dentro dela, já que eles têm seus elétrons carreados via NADH justamente para esse complexo. Por outro lado, é no complexo 2 da cadeia, a succinato desidrogenase, onde ocorre a síntese de succinato, e a entrega de seus elétrons carreados via FADH, ou seja, dentre os três substratos, o fato do succinato ser o único deles a não sentir efeito do veneno se deve ao fato dele ser um derivado do complexo 2, que não sofre qualquer efeito sob a ação de arsênio. 7. A ordem de acepção de elétrons pelos citocromos, do primeiro a ser reduzido, até o último, é: B ➔ C1➔ C ➔ A+A3. Em caso de oxidação a ordem é contrária, já que o citocromo A+A3 sempre será o primeiro a fornecer seu elétron ao oxigênio (aceptor final) e o citocromo B será o último. Sabendo que o NADH entrega seus elétrons ao complexo 1, e que CO, cianeto e NaN3 atuam inibindo a entrega desses elétrons ao complexo 4, entendemos porque as bandas b, c1 e c ficam escuras (reduzidas) e a produção de ATP zerada. II) No segundo caso, o veneno rotenona atua no complexo 1 e o NADH nem sequer entrega seus elétrons à cadeia. III) No terceiro caso, o veneno antimicina A inibe a transmissão de elétrons do complexo 2 ao 3, paralisando a via (geração de ATP) e deixando o citocromo c1 reduzido. IV) No quarto caso, vemos o veneno rotenona inibindo o complexo 1, contudo, aqui temos um FADH como substrato, e ele entrega seus elétrons ao complexo 2, portanto, os citocromos c1, c e a1+a3 seguem a geração de ATP normalmente, reduzindo e oxidando alternadamente. V) No quinto e último caso, o veneno ácido ascórbico impossibilita a passagem de elétrons do complexo 3 ao 4, restando a esse último apenas as sucessivas reduções e oxidações para gerar apenas 1 ATP. A capacidade de geração de ATPs pela cadeia respiratória a partir dos elétrons carreados pelo NADH é maior em relação aos ATPs gerados pelo FADH2. NADH é capaz de gerar 3 ATPs, enquanto o FADH2 apenas 2.
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