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Técnicas moleculares do 
Laboratório de Biologia Molecular 
MSc. Daniele Portela de Oliveira 
Prof. Sandra Aidar de Queiroz 
INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) 
 
Gregor Mendel (1865) 
‘leis da hereditariedade’ 
Gregor Mendel (1865) 
Foco  Gene como unidade fundamental de variação biológica 
Redescobriram os trabalhos de Mendel e 
formularam as leis da hereditariedade 
INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) 
 
Hugo De Vries et al. (1900) 
Friedrich Miescher (1868) 
Publicou uma nova substância no material 
nuclear de células chamada de nucleína 
Walther Flemming (1882) 
Descobriu o processo de mitose e o comportamento dos 
cromossomos durante a divisão celular. 
 
Phoebus Aaron Theodor Levene (1909) 
Teoria do tetranucleotídeo – repetições monótonas dos 
nucleotídeos. Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) e Timina (T). 
INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) 
 
Wilhelm L. Johannsen (1909) 
Chamou de gene a unidade descrita por 
Mendel. Unidade de transferência de 
hereditariedade. 
 
Thomas Hunt Morgan (1911) 
 
INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) 
 
Demonstrou que os genes estão arranjados de forma linear nos 
cromossomos. 
 
Frederick Griffith (1928) 
Evidências sobre o papel do DNA 
 
Oswald T. Avery (1944)(esq.) e seus colaboradores Colin 
MacLeod e Maclyn McCarty demonstraram o princípio 
transformante proposto por 
Frederick Griffith em 1928. 
INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) 
 
INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) 
 
Linus Pauiling com modelos da 
estrutura alfa hélice de proteínas, 
também se dedicou a resolver a 
estrutura do DNA 
INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência) 
 
Crick  Físico e Biólogo. Estudou a estrutura cristalina da 
hemoglobina 
Watson  Biólogo com tese em Zoologia. Estou o efeito do 
raio X na multiplicação de vírus que infectam bactérias 
(Copenhagen). 
 Conheceu Wilkins em Napóles  mudou sua 
pesquisa para difração de DNA 
 1° Watson e Crick – a hélice de DNA era composta 
por 3 cadeia de nucleotídeos. 
Peter  Filho de Linus Pauling foi fazer doutorado com 
Kendrew. 
 2° Watson e Crick perceberam o erro na molécula 
através do artigo de Pauling e corrigiram. Concluíram que 
os fosfatos estavam do lado de fora da hélice. 
Conversas entre Wilkins, Franklin, Watson e Crick 
concluíram finalmente a estrutura do DNA 
 
Crick, Watson e Wilkins (1962) Prêmio Nobel de Medicina 
ou Fisiologia – Estrutura do DNA 
WATSON E CRICK (1953) – DNA 
Elucidaram o código universal genético 
Watson e Crick(1953) 
 
Estudos de migração, seleção e deriva genética 
http://qnint.sbq.org.br/qni/visualizarTema.php?idTema=33 
Polimorfismo 
Definição: 
Formas alternativas de um 
mesmo segmento de DNA. 
Resultado de uma mutação 
(evento). 
 1% na população 
A B 
Tipos de polimorfismos (marcadores) 
A) Variação no número de cópias (mini e 
microssatélites): sequências adjacentes que se 
repetem em número variado. 
– NÃO OCORRE EM ÉXON 
– Mini x Micro  Tamanho da sequência repetitiva 
(Tandem) 
– Não alteram a proteína 
 
B) SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) 
– Substituição de um único nucleotídeo 
– A forma de polimorfismo mais abundante no 
genoma 
– Ocorre em qualquer região 
– Éxon  PODE alterar a sequência de aa na proteína 
(mutação não sinônimo) 
– Anemia falciforme, BLAD, K-caseína(BB) 
 
 
Tipos de polimorfismos (marcadores) 
C) Indel 
– In/Del: Inserção/deleção 
– Éxon  Efeito deletério por inviabilizar a proteína 
Tipos de polimorfismos (marcadores) 
C) Indel 
Sequência ampla 
Utilização dos marcadores 
• Mecanismos de herança mendeliana 
– Humanos, bovinos e suínos 
– Doenças hereditárias 
 
• Mecanismos relacionados a características 
complexas (Georges e Anderson, 2003) 
– Essas características são controladas por muitos 
genes, que podem resultar em complexas 
interações alélicas e interações não-alélicas, e são 
influenciadas pelo ambiente. 
 
Marcadores moleculares 
• Sequenciamento do genoma 
 Bibliotecas virtuais de várias espécies 
 NCBI-GenBank 
Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 
 Seleciona  Nucleotide (All databases) 
 Busca  Sequência e/ou espécie 
 
• Emprego dos QTL 
– Seleção Assistida por marcadores (MAS) 
– Eliminar animais portadores de alelos deletérios 
– Exemplo: mutação responsável pela síndrome do 
estresse dos suínos (gene PSS) 
– Exemplo: (BLAD) mutação no gene que codifica a 
proteína CD18, responsável pela síndrome de 
deficiência de adesão dos leucócitos (Hol) 
– Exemplo: mutação relacionada a sindactilia dos 
bovinos 
Marcadores moleculares 
• Desvantagens do uso da MAS para 
características quantitativas 
– Emprego do genótipo de um marcador 
– Conduz a rápida fixação de um alelo selecionado 
– Desconsidera o efeito poligênico 
Marcadores moleculares 
• Vantagens do uso da MAS 
– Características com baixa herdabilidade e difícil 
mensuração 
– Estudos de expressão gênica  RNA 
– Teste de paternidade  DNA-fingerprint 
– Variabilidade genética  + 2 alelos 
– Parâmetros populacionais  Endogamia 
 
Marcadores moleculares 
Extração de DNA 
• Qualquer procedimento laboratorial envolvendo 
análise de DNA ou RNA tem que passar pelo 
processo de extração 
• Em geral, baseia-se em 4 etapas básicas (protocolos 
de extração) 
– Etapas: 
 
 
1. Lise das membranas lipídicas 
2. Purificação do DNA 
3. Precipitação do DNA 
4. Reidratação do DNA 
1. Lise das membranas lipídicas 
a) Membranas: fosfolipídios + proteínas 
b) Rompimento da membrana celular e dos 
compartimentos membranosos (organelas) 
c) Provocada por uma solução detergente 
 
 
Extração de DNA 
2) Purificação do DNA 
a) Remoção de componentes celulares como 
proteínas, organelas e restos celulares 
b) Proteinase K  Desnaturação das proteínas 
c) Fenol  Remove proteínas e outros 
contaminantes da solução aquosa 
d) Clorofórmio  ajuda a desnaturar proteínas e 
remover o fenol residual 
e) NaCL2  ajuda a manter a proteínas dissolvidas 
no líquido extraído, impedem que precipitem 
Extração de DNA 
3) Precipitação do DNA 
a) DNA é solúvel em água, mas 
insolúvel em álcool 
a) Usa-se etanol para precipitar o DNA 
b) Quanto mais gelado o etanol menos 
solúvel o DNA vai estar 
b) Retira-se o álcool para formação 
do pellet 
Extração de DNA 
4) Reidratação do DNA 
a) Após a retirada do álcool, o DNA precisa se 
solubilizar em algum solvente: Água ultra-pura ou 
uma solução Tampão 
a) Este solvente servirá para armazenamento do DNA 
extraído 
b) Deve ser livre de contaminantes e enzimas capazes de 
destruir o DNA 
b) Armazenar o DNA a - 20 º C 
Extração de DNA 
Como PCR funciona? 
Objetivo 
• Multiplicar um trecho específico do DNA. 
 
Como funciona? 
• Alternando a temperatura do ensaio 
Replicação do DNA 
http://www.youtube.com/watch?v=DjNGgte52lI 
Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) 
• PCR -> Polymerase Chain Reaction 
 
 Multiplicação “in vitro” de um trecho específico 
de DNA (gene ou parte dele, regiões supervariáveis) 
resultando na produção de milhares de cópias da 
sequência desejada sem o uso de um organismo vivo. 
 
Breve Histórico 
• Saiki, et al. (1985) desenvolveu a técnica 
 
• Kary Mullis (1987) inovou 
 
 Gene β-globina humana 
 Nobel de Química em 1993 
 Perkin-Elmer 
 
 Roche Molecular System 
• Conceito de primer de PCR 
 
• Taq -> DNA polimerase termoestávelisolada da 
bactéria de fontes termais Thermus aquaticus 
 Temperatura de até 117° 
• 1989 -> DNA Thermal Cycler 
(primeiro Termociclador automático) 
Breve Histórico 
Como PCR funciona? 
a) desnaturação das cadeias do DNA genômico 
b) anelamento (annealinng) dos primers, usados para 
delimitar a sequência a ser amplificada 
c) temperatura ótima específica da enzima: 72ºC 
d) reinício do ciclo 
Como PCR funciona? 
Como PCR funciona? 
• A quantidade final de DNA segue uma função 
exponencial: 
 
N = N0 . 2n 
N -> Número final de cadeias de DNA 
N0 -> Número inicial de DNA molde (template) 
n -> Número de repetições do ciclo 
Componentes da PCR 
DNA molde 
Primer 
GoTaq (Promega) 
H2O 
Extraído de uma amostra (sangue, pelo, sêmen) 
ou de um RNA, convertida para cDNA. 
Sequência de DNA que serve como ponto de início 
de replicação. Forward e Reverse. 
Taq + Tampão + MgCL2 + dNTP’s 
 Água ultra pura e livre de cargas elétricas (H2O 
miliQ 
Componentes da PCR 
Tipos de reações de PCR 
RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction) 
• Parte de uma amostra de RNA. Primer inespecífico. 
• É fundamental nos estudos de expressão gênica. 
 
Multiplex PCR 
• Mais de um segmento genômico é amplificado 
numa única reação, cada um com seu par de 
primers específico. 
• Testes de paternidade. 
45309.....TAAAGGCAGGAGTAATAAAGTATGTTA
CCAAGAAATGTAAGTTTCAGATGTTTAATGACTCATT
GTTATCTTCTCACTATTAATTTAGGATGTCTAAACAA
GGACGGACAATCATCTTCTCCATTCATCAGCCTCGTT
ATTCCATCTTCAAGTTGTTTGATAGCCTCACCTTGTT
GGCCTCGGGAAGACTCATGTTCCACGGGCCTGCTCAG
GAGGCCTTGGGGTACTTTGGAGCCATAGGTATGGTTG
CCTTTTTTGTGCTGTAAGATCCTTCATTAATAGTATC
CTAAAGGAGAACAAAGGAGTCACTTGGAGCACTGTTT
GATCTTTGAGTAGATATACATATATCACAGTTTCCAC
TGCTCCGAAACATCTTCGGTTAGTTTGGTGTTA... 
Primers – exon 9 
Desenho de Primers 
FORWARD 5’ 3’ 
REVERSE 3’ 5’ GAAGCCAATCAAACCACAAT 
Otimizando o PCR 
• Concentração de Mg2+ na reação 
 Cofator da enzima Tht (Thermus thermophillus) 
Polimerase 
 
• Temperatura de anelamento dos primers 
 Gradientes de temperatura no termociclador 
 
 
Gradiente  definição da temperatura de anelamento 
48,3 49,4 50,5 51,6 52,7 53,8 54,9 56 
Otimizando o PCR 
Eletroforese em Gel 
• Função: Separar e as vezes purificar macromoléculas – 
proteínas e ácidos nucléicos – diferentes tamanhos, cargas ou 
conformação. 
 
• Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, 
migram para o pólo positivo ou negativo. 
– Proteínas (carga líquida negativa ou positiva) e DNA 
sempre negativa (fosfato) 
• Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel. O gel é 
submerso em um tampão que possui íons para a corrente 
passar e também para manter o pH mais ou menos constante. 
 
 
Eletroforese em Gel 
Eletroforese em Gel 
• Gel composto de agarose ou poliacrilamida 
• Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha. 
 Usada em concentrações de 0,5 a 2% 
 Fácil de preparar 
 Não-tóxico 
 Ampla capacidade de separação de fragmentos 
 Baixa resolução 
 
Eletroforese em Gel 
• Gel composto de agarose ou poliacrilamida 
• Poliacrilamida é um polímero de ligação cruzada de acrilamida. 
 Usada em concentrações de 3,5 a 20%. 
 Difíceis de preparar. Precisam ser montados em placas de 
vidro 
 Acrilamida é um potente neurotóxico 
 Baixa capacidade de separação de fragmentos 
 Alta resolução 
Gel de Poliacrilamida 
Visualização da PCR 
• O tampão da amostra possui uma mistura de corantes: 
 Azul de Bromofenol (Corante) 
 Xileno-Cianol e Glicose (aumentam a viscosidade) 
Foto de Gel de Poliacrilamida Foto de Gel de Agarose 
Polimorfismos de comprimento 
de fragmentos de restrição - RFLP 
• Variação individual no número e no tamanho dos 
fragmentos formados pela digestão do DNA com 
uma enzima de restrição. 
 
• Resultante de mutações pontuais, que eliminam ou 
criam sítios de restrição para determinada enzima 
 
• Podem originar eventos de inserção ou de deleção 
entre dois sítios de restrição adjacentes. 
Polimorfismos de comprimento 
de fragmentos de restrição - RFLP 
• Dois indivíduos distintos que têm o DNA extraído e submetido 
a clivagem por enzima de restrição; 
 
• Após a extração, o DNA dos indivíduos é tratado com enzima 
de restrição, que o corta em um grande número de pontos 
(sítios de restrição), gerando uma enorme quantidade de 
fragmentos; 
 
• As diferenças na sequência de DNA dos indivíduos resulta na 
clivagem de fragmentos de tamanhos distintos, que são 
separados através de eletroforese em gel de agarose. 
Polimorfismos de comprimento 
de fragmentos de restrição - RFLP 
Técnica de RFLP 
Consiste na identificação por hibridização do DNA 
1- Extração do DNA 
2- Digestão por enzimas de restrição 
3- Separação dos fragmentos (eletroforese) 
4- Transferência do DNA para membrana de nylon 
(Botstein et al., 1980) 
5- Hibridação (fragmentos x sondas marcadas) 
6- Autoradiografia (exposição da membrana a 
filme de raio X ou compostos luminescentes 
7- Análise da segregação 
 
Técnica de RFLP 
(Botstein et al., 1980) 
Aplicações do RFLP 
• Diversidade genética 
• Construção de mapas de ligação e 
• Mapeamento de QTLs 
• Seleção assistida por marcadores (SAM) 
RFLP 
• Limitações 
 Passos intensivos de mão de obra 
 Inexistência de biblioteca de sondas disponível 
 
• Vantagens 
 Varredura em praticamente todo o genoma 
 Expressão co-dominante (hetero e homozigoto) 
 Alta repetibilidade e consistência 
 
Identificação de mistura de leite bovino em leite bubalino por PCR-
RFLP/Hae III da β-casein gene (exon VII) 
 
A –variante bovina 
B –variante bubalina 1 (Índia) 
C –variante bubalina 2 (Brasil) 
Extração de DNA feita a 
partir de queijo 
Otaviano et al, 2008 
Resultados de Genética Molecular 
Marcadores moleculares 
• Métodos de análise da estrutura e função do 
material genético, e de equipamentos de alta 
capacidade de processamento de amostras, 
métodos estatísticos e ferramentas de 
informática, resultando na ciência conhecida 
como genômica.