Relatório das aulas práticas de Bioquímica Clínica 2°bim

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CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVEL
BACHARELADO EM BIOMEDICINA
Christyan Richetti Santos
RELATÓRIO DAS AULAS PRÁTICAS DA DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA II
Cascavel
2020
1. INTRODUÇÃO
 Segundo Motta (2003), a bioquímica clínica, também denominada química clínica, fisiológica ou patológica, consiste em uma ciência que estuda a química e a patologia, responsável por investigar materiais orgânicos, como: sangue e urina, refletindo alterações metabólicas responsáveis pelo desenvolvimento de doenças.
 Estabelecer valores de referência em amostras orgânicas é de suma importância, pois eles servirão como parâmetros para avaliar as alterações funcionais do indivíduo, propiciando a conduta mais adequada de tratamento e prognóstico (MOTTA, 2003).
 A bioquímica clínica propicia a análise de amostras como: urina, sangue, líquor, sêmen, líquidos pleurais, sinovial, ascítico, secreções em geral; em que se pode mensurar valores de analitos importantes para controle e manutenção da homeostasia (MOTTA, 2003).
 De acordo com Wallach (2000), múltiplos exames estão inseridos no campo da bioquímica clínica, tais como: avaliação de proteínas; aminoácidos; enzimas; lipídeos; minerais; eletrólitos; aspectos bioquímicos da hematologia, como o ferro sérico; hormônios; marcadores tumorais; líquidos orgânicos; substâncias do sistema hepatobiliar; dentre outros analitos, que podem ser analisados quantitativamente e/ou qualitativamente.
 Na maioria das mensurações laboratoriais, os resultados variam de um laboratório para outro, portanto deve-se estar atento às variações que se aplicam ao paciente em particular: idade, sexo, altura, estado fisiológico (ex: gravidez, lactação) (WALLACH, 2000).
 Atualmente, as investigações bioquímicas estão presentes em todos os ramos da medicina, isso se deve principalmente às informações sobre exames e doenças que são extensamente atualizadas, incluindo novas tecnologias como: anticorpos monoclonais, reação em cadeia da polimerase, citometria de fluxo, dentre outras técnicas modernas que melhoram a precisão e a capacidade diagnóstica (WALLACH, 2000).
2. DESENVOLVIMENTO 
2.1. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ALT
Método: Cinético UV
Significado clínico: A alanina aminotransferase (ALT) é uma enzima encontrada predominantemente no fígado, em concentração moderada nos rins e em menores quantidades no coração e nos músculos esqueléticos. Na célula hepática, a ALT localiza-se no citoplasma (90%) e na mitocôndria (10%).
 Qualquer lesão (injúria) tissular ou doença afetando o parênquima hepático liberará uma maior quantidade da enzima para a corrente sanguínea, elevando os níveis séricos da ALT. 
 Em geral, as causas mais comuns de elevação dos valores de ALT no sangue ocorrem por disfunção hepática. Desta maneira, a ALT além de ser sensível é também bastante específica para o diagnóstico de doença hepatocelular. 
 Convém ressaltar que uma lesão tecidual nos rins, coração e nos músculos esqueléticos também provoca uma maior liberação de ALT para a corrente sanguínea, elevando seus níveis séricos. Assim, diante de um quadro clínico de miosite ou de uma rabdomiólise grave, os valores de ALT podem elevar-se tanto quanto na hepatite virótica aguda. 
 Na hepatite virótica, na mononucleose infecciosa e na lesão hepatocelular induzida por drogas, o grau e a frequência da elevação dos níveis de ALT são praticamente os mesmos da AST. 
 Já nos casos de cirrose ativa, hepatopatia alcoólica aguda, congestão hepática passiva, obstrução dos ductos biliares extra-hepáticos e tumor de fígado com metástase, os níveis de ALT encontram-se frequentemente menos elevados do que os da AST. 
 A relação AST/ALT (Índice DeRitis) tem sido empregada algumas vezes para auxiliar no diagnóstico diferencial das hepatopatias. Na hepatite virótica aguda, a relação AST/ALT é sempre menor que 1, enquanto que nas outras doenças hepatocelulares (cirrose, hepatites crônicas, etc) é sempre > 1.
Fundamento: A ALT catalisa a transferência do grupo amina da alanina para o cetoglutarato com formação de glutamato e piruvato. O piruvato é reduzido a lactato por ação da lactato desidrogenase (LDH), enquanto que a + coenzima NADH é oxidada a NAD. A atividade enzimática da ALT na amostra é calculada com base na redução da absorbância em 340 nm, + quando o NADH se transforma em NAD.
Amostra: Soro ou plasma (EDTA ou Heparina). 
- O analito é estável por 4 dias entre 2-8 ºC; 
- Não utilizar amostras hemolisadas.
Interferências: A bilirrubina até 19 mg/dL, lipemia (triglicérides até 650 mg/dL) e hemólise (hemoglobina até 180 mg/dL) não produzem interferências significativas. 
 Amostras fortemente lipêmicas e ictéricas apresentam absorbância elevada em 340 nm. 
 Quando a atividade enzimática nessas amostras estiver muito aumentada, pode ocorrer consumo muito rápido do substrato sem ocorrer uma diminuição significativa da absorbância. 
 Portanto, quando obtiver valores baixos de ALT nessas amostras, repetir a dosagem diluindo o soro com solução de NaCl 150 mmol/L (0,85%). 
Materiais necessários: kit ALT-PP Analisa®, soro controles normal e patológico, espectrofotômetro, tubos de ensaio, micropipetas, ponteiras, banho-maria e papel absorvente.
Procedimento do teste: 
Preparo do Reagente de Trabalho:
 De acordo com o consumo, misturar suavemente os reagentes 1 e 2 na seguinte proporção: 4 mL de Tampão (1) para 1 mL de Coenzima (2); misturamos 3,2 mL de tampão para 0,8 mL de coenzima. O Reagente de Trabalho é estável por 14 dias entre 2-8°C. 
- Pipetar em tubo de ensaio: 1000 µL do reagente de trabalho e 100 μL da amostra;
- Homogeneizar, inserir imediatamente a amostra no espectrofotômetro termostatizado à 37 ºC;
- Após 1 minuto, fazer a leitura da absorbância inicial;
- Fazer novas leituras de absorbância, após exatamente 1, 2 e 3 minutos;
- As diferenças entre as absorbâncias devem ser praticamente iguais, indicando a linearidade do método;
- Calcular o decréscimo de absorbância médio por minuto (ΔA/minuto). 
***Absorbância inicial inferior à 0,800 indica que a amostra tem uma atividade enzimática alta. Neste caso, diluir a amostra e repetir o ensaio. 
Resultados: Considerando que o coeficiente de absorção milimolar do NADH em 340 nm é 6,3, deduz-se a seguinte fórmula para calcular a concentração catalítica: 
U/L de ALT em 340 nm = ΔA/minuto x 1746 
Onde: ΔA/min = Variação média da absorbância por minuto.
 O fator 1746 é calculado com base nas condições da reação cinética contínua. Esse fator deve ser recalculado sempre que se fizer qualquer modificação nos parâmetros da reação. Ver método para cálculo do fator.
Cálculo do Fator:
Vt = volume total do ensaio = 1,1 mL 
Va = volume da amostra = 0,1 mL 
1000 = conversão de U/mL para U/L 
d = espessura da cubeta, caminho óptico = 1 cm 
e = Absortividade milimolar do NADH em 340 nm = 6,3 
ΔA/minuto x 1746
SCN = 0,023 x 1746
SCN = 40,158 U/L
ΔA/minuto x 1746
SCP = 0,061 x 1746
SCP = 106,506 U/L
ΔA/minuto x 1746
A = 0,013 x 1746
A = 22,698 U/L
Linearidade: a reação é linear até 400 U/L. 
Valores de referência: 
Homens: 11 - 45 U/L 
Mulheres: 10 - 37 U/L
SCN = 40 U/L, podendo variar de 32 à 48.
SCP = 119 U/L, podendo variar de 95 à 143.
 O SNC e SNP encontram-se dentro dos limites propostos. O resultado da amostra também encontra-se dentro dos valores de referência. 
2.2. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE GAMA-GLUTAMILTRANSFERASE (GAMA-GT)
Método: Cinético-colorimétrico 
Significado clínico: A Gama GT é uma enzima encontrada em concentração relativamente alta nos rins, pâncreas, fígado e próstata. É um sensível indicador de doenças inflamatórias e de lesão hepática, estando significativamente elevada nas doenças obstrutivas hepatobiliares. A Gama GT tem maior especificidade que a fosfatase alcalina (ALP) e a TGO (AST) para avaliar doença hepática porque ela não se eleva na doença óssea como a ALP e nem nas doenças do músculoesquelético como a transaminase oxalacética (TGO). A determinação da Gama GT serve para diferenciar colestases mecânica e viral das induzidas por drogas. Nas duas primeiras, a Gama GT e ALP estão igualmente elevadas. Nas colestases induzidas por drogas os valores da Gama GT são muito mais altos. Os níveis de Gama GT encontram-se altos em pacientes que fazem uso prolongado de drogas que induzem o sistema microssomal hepático como o fenobarbital, fenitoína, entre outras. Valores elevados de Gama GT em pacientes anictéricos com câncer são um seguro indicador de metástases hepáticas. A Gama GT é muito sensível na seleção de alcoólatras. No alcoolismo crônico, os níveis séricos da Gama GT diminuem com a retirada do álcool e se elevam com a exposição ao mesmo. Com base nesta observação, a dosagem da Gama GT é utilizada nos centros de tratamentos de alcoólatras para documentar o sucesso da terapia e identificar os pacientes que retomaram ao alcoolismo após a alta.
Fundamento: A gama-glutamiltransferase (gama-GT) catalisa a transferência do grupamento gama-glutamil da gama-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida para a glicilglicina liberando gama-glutamilglicilglicina e p-nitroanilina. A p-nitroanilina apresenta elevada absorção em 405 nm e a quantidade liberada é diretamente proporcional à atividade da gamaGT na amostra. A atividade catalítica é determinada a partir da velocidade de formação da pnitroanilina.
Amostra: Soro ou plasma (EDTA). O analito é estável por 5 dias entre 2-8 ºC.
Interferências: Amostras hemolisadas, lipêmicas e ictéricas.
Materiais necessários: kit gama-GT-PP Analisa®, soro controles normal e patológico, espectrofotômetro, tubos de ensaio, micropipetas, ponteiras, e papel absorvente.
Procedimento do teste:
Preparo do Reagente de Trabalho De acordo com o consumo, misturar suavemente os reagentes 1 e 2 na seguinte proporção: 4 volumes de Tampão (1) mais 1 volume de Substrato (2). O Reagente de Trabalho é estável por 21 dias entre 2-8°C.
- Pipetar em tubo de ensaio:
	Reagente de trabalho
	1000 μL
	Amostra
	50 μL
1. Homogeneizar, inserir imediatamente a amostra no espectrofotômetro termostatizado a 37 ºC. 
2. Após 1 minuto, fazer a leitura da absorbância inicial. - Fazer novas leituras de absorbância, após exatamente 1, 2 e 3 minutos. 
3. As diferenças entre as absorbâncias devem ser praticamente iguais, indicando a linearidade do método.
4. Calcular o decréscimo de absorbância médio por minuto (ΔA/minuto).
Resultados:
Considerando que o coeficiente de absorção milimolar da p-nitroanilina é 8,235 em 405 nm, deduz-se a seguinte fórmula para calcular a atividade catalítica: U/Lde Gama GT = ΔA/min médio x 2550 Onde: ΔA/min = Variação média da absorbância por minuto.
Cálculo atividade catalítica:
Vt = volume total do ensaio = 1,050 µL
Va = volume da amostra = 50 µL
1000 = conversão de U/mL para U/L 
d = espessura da cubeta, caminho óptico = 1 cm 
Valor de referência SCN:
No momento em que passamos o SCN no equipamento ele apresentou erro, portanto, não possuímos este resultado.
Valor de referência SCP:
Linearidade: A reação é linear até 700 U/L.
Valores de referência: 
Homens: < 60 U/L 
Mulheres: < 40 U/L
2.3. DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE URÉIA
Método: Enzimático-colorimétrico
Significado clínico: A determinação de ureia é comumente usada para avaliar a função renal, principalmente em pacientes renais crônicos, atualmente sua dosagem sanguínea é um complemento a dosagem de creatinina na avaliação da função renal.
 Sua determinação no sangue se dá pelo fato da ureia ser principalmente excretada na urina, assim nos rins ela é filtrada e direcionada a bexiga para excreção, mas em caso de falha renal, a mesma é absorvida novamente pela corrente sanguínea e permanece no organismo, sendo notada suas elevadas concentrações em quadros renais graves. 
 A ureia é produto da amônia gerada no metabolismo das proteínas, essa amônia é convertida em ureia no fígado, portanto se o paciente tiver baixas concentrações de ureia e altas concentrações de amônia no organismo temos um quadro de hiperamonemia, onde podemos considerar um problema hepático.
Fundamento: A ureia é hidrolisada pela urease em íons amônia e CO2. Em meio alcalino, os íons amônia reagem com salicilato e hipoclorito de sódio, sob ação da catalisadora de nitroprussiato de sódio, para formar indofenol. A absorbância do complexo azul formado, medida em 600 nm, é diretamente proporcional à concentração de ureia na amostra analisada.
Amostra: Soro ou plasma e urina.
Interferências: Amostras com valores de Hb acima de 80mg/dL e de triglicérides acima de 900mg/dL produzem resultados falsamente elevados que não podem ser minimizados com o uso do branco de amostra.
Materiais necessários: Kit ureia-PP Analisa, soro controle normal e patológico, espectrofotômetro, tubos de ensaio, micropipetas, banho-maria e papel absorvente.
Procedimento do teste: 
1- Identificar os tubos de ensaio com branco, padrão, soro controle normal, soro controle patológico e amostras;
2- Pipetar urease tamponada em todos os tubos (1mL);
3- Pipetar solução padrão, soros controles e amostras nos respectivos tubos;
4- Homogeneizar e incubar os tubos por 5’ à 37ºC;
5- Adicional 1mL de oxidante de uso em cada tubo;
6- Homogeneizar e incubar os tubos por 5’ à 37ºC;
7- Fazer as leituras em espectrofotômetro em 600nm, zerando o aparelho com o branco.
Resultados: 
Os resultados são aplicados na seguinte formula, realizando calculo por regra de três. 
Concentração do Padrão (70mg/dL) – Absorbância do Padrão (0,754)
Concentração da Amostra – Absorbância da Amostra
Absorbâncias obtidas:
SCN: 0,428
SCP: 1,851
Amostra 1: 0,282
Amostra 2: 0,583
SCN 70 -------- 0,754	 SCP 	 70 --------- 0,754
	 X --------- 0,428	 X --------- 1,851
 X = 39,7347			 	 X = 171,8435
Amostra 1 	 70 -------- 0,754 	 Amostra 2 70 --------- 0,754
		 X --------- 0,282				 X -------- 0,583 	
 X = 26,1803 X = 54,1246
 Sendo X a concentração da amostra. Todas as amostras e o SCN apresentaram resultados dentro dos valores de referência, o SNP apresentou resultado acima do recomendado pela bula, o motivo mais provável para tal desvio foi o de que foi o único tubo pipetado por analista distinto e o mesmo não foi “seco” por fora no momento da pipetagem.
Linearidade: A reação é linear até 300mg/dL
Valores de referência: 
Adultos: 15 à 45 mg/dL
Idade de 1 dia a 12 meses: 2 à 34 mg/dL
De 1 a 13 anos: 8 à 36 mg/dL
2.4. DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE CLEAREANCE DE CREATININA
Método: Cinético-colorimétrico
Significado clínico: A creatinina, composto muito difundível, elimina-se do organis- mo quase exclusivamente por filtração renal. Sua determina- ção em soro, assim como o clearance de creatinina endógena constituem parâmetros importantes para o diagnóstico das diversas afeções renais. No entanto, as dificuldades práticas inerentes à determinação do clearance (coleta de urina em crianças, etc.) favorece a difusão da determinação de creati- nina sérica como índice de funcionamento renal.
Fundamento: A creatinina e os interferentes presentes na amostra reagem com o picrato em meio alcalino originando um complexo colorido. Mede-se a velocidade de formação desse complexo em períodos iniciais curtos, evitando-se assim a interferência de outros compostos. Uma primeira leitura é realizada aos 30 segundos iniciais da reação para eliminar o efeito dos interferentes de reação rápida. Aos 90 segundos de reação é realizada uma segunda leitura, antes que os interferentes de reação lenta possam ter efeitos significativos. Dessa forma, isola- se a formação do complexo creatinina-quelante e a determinação colorimétrica do produto final torna-se livre de interferentes, referindo-se exclusivamente à creatininapresente no teste. Os principais interferentes são representados pela glicose, frutose, ácido úrico, ácido ascórbico, corpos cetônicos e proteínas plasmáticas.
Amostra: Soro, plasma, urina e líquido amniótico.
- O análogo no soro ou plasma é estável por 7 dias entre 2-8°C;
- Anticoagulantes como heparina, EDTA, oxalato, citrato e fluoreto não interferem.
Interferências: Amostras com valores de bilirrubina acima de 5 mg/dL produzem resultados falsamente diminuídos. Amostras com valores de triglicérides entre 900 e 1800 mg/dL produzem resultados falsamente elevados que podem ser eliminadas através o procedimento com desproteinização. Quando a taxa de triglicérides estiver entre 1800 e 3500 mg/dL, diluir a amostra a 1/2 com solução de NaCl 150 mmol/L (0,85%) e seguir o procedimento com desproteinização. Multiplicar o resultado final por 2.
Materiais necessários: kit creatinina-PP Analisa, soro controles normal e patológico, espectrofotômetro, tubos de ensaio, micropipetas, ponteiras, banho maria e papel absorvente.
Procedimento do teste: 
Preparo do reagente de trabalho:
De acordo com o consumo, misturar 1 volume de Ácido Pícrico (2) com 4 volumes de Tampão (3). Estável por 15 dias entre 2-8°C em frasco plástico bem vedado. A deterioração do Reagente de Trabalho é indicada quando sua absorbância lida contra a água em 510 nm for superior a 0,200.
ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE CREATININA NO SORO:
1) Identificar tubos de ensaio para amostras de soro como BRANCO, PADRÃO, SORO CONTROLE NORMAL, SORO CONTROLE PATOLÓGICO E AMOSTRAS;
2) Pipetar 1 mL do reagente de trabalho em cada tubo (exceto branco, pipetar água destilada) e colocar em banho-maria à 37°C;
3) Pipetar 100 μL de padrão, soro controle ou amostras e inserir imediatamente no espectrofotômetro termostatizado à 37°C;
4) Fazer a 1° leitura da absorbância em 510 nm aos 30 segundos e a 2° aos 90 segundos;
5) Calcular o ΔA/min.
ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE CREATININA NA URINA:
Preparo Da Amostra:
1) Instruir o paciente para coletar corretamente a urina no período 24 horas;
2) Homogeneizar bem a amostra de urina;
3) Centrifugar (2000 rpm por 10 min) e diluir a urina a 1:25 (0,2 mL de urina + 4,8 mL de água destilada ou deionizada).
Dosagem e Cálculos:
Seguir a mesma metodologia para a dosagem no soro. Multiplicar o valor obtido por 25.
CT em mg/dL= valor obtido na dosagem x 25
- Como a metodologia obedece à lei de Lambert-Beer, pode-se efetuar os cálculos através do Fator de Calibração (FC).
ΔP= (A90 - A30) Padrão
ΔT= (A90 - A30) Teste
CP = Concentração do Padrão = 4,0 mg/dL
CT = Concentração do Teste em mg/dL
FC = CP ÷ ΔP
CT = FC x ΔT
DEPURAÇÃO (CLEARANCE) DE CREATININA:
- Amostra de urina: urina de 24 horas
- Amostra de soro: obtido em qualquer momento do período de coleta da urina.
Realizar a dosagem de creatinina nas duas amostras conforme metodologia descrita previamente.
Clearance de creatinina: U x V x 1,73 / S x A
U = creatinina na urina (mg/dL)
S = creatinina no soro (mg/dL)
V = volume minuto (volume de urina colhido/ tempo de colheita em minutos) A = área de superfície corporal do paciente (conforme nomograma)
1,73 = área de superfície corporal média
Resultados: 
O paciente apresentava as seguintes características:
Sexo: masculino
Idade: 81 anos
Peso: 99 Kg
Altura: 1,95 cm
Área corporal: 2,3 m2
Urina total: 2,900 ml
Tempo de colheita: 24 horas (1440 minutos)
Valores obtidos através das leituras em espectrofotômetro:
P Abs. 30 seg.: 0,108 – Δ: 0,062
SCN Abs. 30 seg.: 0,157 – Δ: 0,023
SCP Abs. 30 seg.: 0,367 – Δ: 0,091
Amostra Abs. 30 seg.: 0,130 – Δ: 0,013
Urina Abs. 30 seg.: 0,175 – Δ: 0,013
Cálculos: 
Fator de calibração:
FC = CP ÷ ΔP
FC = 4 ÷ 0,062 = 64,5161
SCN = 64,5161 x 0,023 = 1,4839
SCP = 64,5161 x 0,091 = 5,8710 
Amostra = 64,5161 x 0,013 = 0,8387
Urina = 64,5161 x 0,013 = 0,8387 x 25 = 20,9675
Clearance de creatinina:
U x V x 1,73 / S x A
20,9675 x 2,0139 x 1,73 / 0,8387 x 2,3
73,0518 / 1,9290 = 37,8703 
· O valor obtido em SCN encontra-se dentro do limite (1,19 – 1,52); 
· O valor obtido em SCP encontra-se acima do recomendado pela bula (3,91 – 5,21);
· O resultado do soro apresentou valor inferior aos valores de referências (0,9 – 1,3);
· O resultado do clearance da creatinina apresentou alteração. 
Linearidade: A reação é linear até 12mg/dL.
Valores de referência: 
Soro ou Plasma
Homens: 0,9 a 1,3 mg/dL
Mulheres: 0,6 a 1,1 mg/dL
Clareamento (clearance) da creatinina
Homens: 97 à 137 mL/minuto/1,73 m2 
Mulheres: 88 à 128 mL/minuto/1,73 m2
2.5. DETERMINAÇÃO DE CÁLCIO
Método: Colorimétrico – Cresolftaleína 
Significado clínico: A dosagem de cálcio no soro é empregada para avaliar a função da paratireóide e o metabolismo do cálcio, uma vez que o cálcio sérico é mantido dentro dos limites fisiológicos pela ação combinada do paratormônio (PTH) e vitamina D através de seus efeitos sobre os ossos, intestinos e rins. Cerca de metade do cálcio total encontra-se no sangue em sua forma livre (ionizado) e a outra metade combinada com proteínas, principalmente com a albumina. A dosagem do cálcio avalia as duas formas, livre e combinado. O cálcio ionizado pode ser determinado através de técnicas de eletrodo íon-seletivo ou pode ser calculado através de fórmula específica. A vantagem de se dosar o cálcio ionizado é evitar a interferência dos níveis de albumina. 
Valores Aumentados: A hipercalcemia ocorre no hiperparatireoidismo, neoplasmas com metástase óssea, alguns casos de câncer de pulmão, rins, bexiga sem envolvimento ósseo, hipervitaminose D, sarcoidose, mieloma múltiplo quando as proteínas estão elevadas, acromegalia, doença de Paget. A hipercalcemia está associada ao uso de drogas como os tiazídicos, vitaminas Ae D, antiácidos alcalinos e carbonato de lítio. 
Valores Diminuídos: As causas mais comuns de hipocalcemia são: hipoparatireoidismo idiopático ou cirúrgico; pseudo hipoparatireoidismo; insuficiência renal; deficiência de vitamina D; doença gastro-intestinal que interfere com a absorção de vitamina D ou cálcio (esprue, esteatorréia); nefrose ou outras condições com baixos níveis de proteínas séricas; pancreatite aguda; deficiência de magnésio.
Fundamento: O cálcio presente na amostra reage com a o-cresolftaleína complexona em meio alcalino, formando um complexo de cor violeta que é quantificado fotometricamente em 570 nm. A hidroxiquinoleína presente no reativo evita a interferência do magnésio.
Amostra: Soro, plasma (heparina) e urina. 
 O analito no soro ou plasma é estável por 6 dias entre 2-8 °C. Devido ao aumento da permeabilidade das hemácias ao cálcio, separar o soro ou plasma até uma hora após a coleta.
Interferências: Os anticoagulantes quelantes de cálcio (EDTA, oxalato, fluoreto,citrato) interferem, fornecendo resultados falsamente diminuídos. 
 A hemólise (hemoglobina até 180 mg/dlL), a bilirrubina até 38 mg/dL e a lipemia (triglicérides até 900 mg/dL) não produzem interferências significativas. 
 Amostras com triglicérides acima de 900 mg/dL produzem resultados falsamente elevados por interferência fotométrica.
Materiais necessários: kit Cálcio-PP Analisa, soro controles normal e patológico, espectrofotômetro, tubos de ensaio, micropipetas, ponteiras, papel absorvente e cronômetro. 
Procedimento do teste: 
Preparo do Reagente de Trabalho:
- De acordo com o consumo, misturar os reagentes 2 e 3 na seguinte proporção: 3 volumes de Tampão (2) mais 1 volume de Cresolftaleína (3);
- O Reagente de Trabalho é estável por 8 horas entre 15-25 °C;
- A sua coloração é violeta com absorbância próxima de 0,500, fato que não compromete o seu desempenho.
Técnica de Análise:
1- Identificar 2 cubetas do fotômetro com "Teste" e "Padrão" e pipetar em cada uma 1000 µLde Reagente de Trabalho;
2- Selecionar o comprimento de onda no aparelho 570 nm (550 a 590 nm);
3- Acertar o Zero de absorbância com a cubeta Padrão contendo 1000 µL de Reagente de Trabalho;
4- Adicionar à cubeta Padrão 20 µLde Padrão (1);
5- Misturar bem e fazer a leitura fotométrica do Padrão (AP);
6- Acertar o Zerode absorbância com a cubeta Teste contendo 1000 µL de Reagente de Trabalho;
7- Adicionar à cubeta Teste 20 µLde amostra a ser analisada;
8- Misturar bem e fazer a leitura fotométrica do Teste (AT).
Resultados:
Como a metodologia obedece a Lei de Lambert-Beer, pode-se efetuar os cálculos através do Fator de Calibração (FC).
CP = Concentração do Padrão 
CT = Concentração do Teste
AP = Absorbância do Padrão 
AT = Absorbância do Teste
FC = CP ÷ AP
CT (mg/dL) = FC x AT
Exemplo:
CP = 10,0 mg/dL 
Se AP = 1,342 
Se AT = 1,326
FC = CP ÷ AP = 10 ÷ 1,342 = 7,5
CT (mg/dL) = FC x AT = 7,5 x 1,326 = 9,9 mg/dL
Análise:
B = 0,360
P = 1,285
SCN = 1,301
A = 0,690
FC = CP ÷ AP 
FC = 10 ÷ 1,285
FC = 7,7821
CT = FC x AT 
SCN = 7,7821 x 1,301 = 10,1245 mg/dL
A = 7,7821 x 0,690 = 5,3696 mg/dL
Cálcio Ionizado (CaI):
Ca = Cálcio (mg/dL) 
P = Proteína total (g/dL) 
A = Albumina (g/dL)
- Albumina:
B = 0,115
P = 0,244
SCN = 0,142
A = 0,297
3,8 g/dL ---------------- 0,244 
SCN -------------------- 0,142 SCN = 2,2114 mg/dL
3,8 g/dL ---------------- 0,244 
A ------------------------- 0,297 A = 4,6254 mg/dL
- Proteínas:
B = 0,173
P = 0,265
SCN = 0,310
A = 0,439
4 g/dL ------------------ 0,265 
SCN -------------------- 0,310 SCN = 4,6792 mg/dL
4 g/dL ------------------ 0,265 
A ------------------------ 0,439 A = 6,6264 mg/dL
Cal (mg/dL) = 6 x 5,3696 – ( (0,19 x 6,6264) + 4,6254) / 3
 32,2176 – (1,2590 + 4,6254) / 3
 32,2176 – (5,8844 / 3)
 32,2176 – 1,9614
 30,2562 
 30,2562 / (0,19 x 6,6264) + 4,6254 + 6
 30,2562 / 1,2578 + 4,6254 + 6
 30,2562 / 11,8832
CaI = 2,5461 mg/dL
Linearidade: A reação é linear até 16,0 mg/dL. 
 Para valores maiores diluir a amostra com solução de NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar nova determinação e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição.
Valores de referência: 
SCN = 9,55 mg/dL, podendo variar de 8,12 a 11,0 mg/dL.
SCP = 12,8 mg/dL, podendo variar de 10,9 a 14,8 mg/dL.
2.6. DETERMINAÇÃO DE BILIRRUBINAS
Método: Colorimétrico - Dicloroanilina
Significado clínico: O metabolismo da bilirrubina inicia-se com a degradação das hemácias no sistema retículo-endotelial em que a hemoglobina liberada é degradada em moléculas de globina e heme. O grupo heme é então catabolizado para formar biliverdina, que é posteriormente transformado em bilirrubina. A bilirrubina é, portanto, um composto tetrapirrólico formado no SRE através da degradação da hemoglobina. Esta forma de bilirrubina, denominada de bilirrubina não conjugada ou indireta circula na corrente sanguínea ligada à albumina. No fígado, essa bilirrubina indireta (não conjugada) é conjugada com o glicuronídeo, resultando na bilirrubina conjugada ou direta que é excretada do fígado para a bile e, através do ducto biliar comum atinge o segmento duodenal do intestino delgado. A icterícia compreende a coloração visível dos tecidos pela bile e geralmente ocorre quando os níveis de bilirrubina atingem taxas acima de 2,5 mg/dL. As causas mais comuns de aumento da bilirrubina direta são as doenças hepatocelulares e as obstruções das vias biliares. Valores altos de bilirrubina indireta ocorrem nas seguintes situações: - Quando há um aumento na produção de bilirrubina como nas diversas causas de hemólise. - Quando há uma diminuição no transporte da bilirrubina por ação de medicamentos e anticorpos. - Por defeito na captação da bilirrubina (deficiência ou bloqueio das lingandinas). - Por defeito na conjugação da bilirrubina (icterícia fisiológica do recém-nascido, doença de Gilbert, etc).
Fundamento: 
Bilirrubina Direta - BD: A amostra é solubilizada em meio ácido e a bilirrubina direta (BD) reage com a dicloroanilina diazotada formando azobilirrubina, cuja intensidade de cor é diretamente proporcional à concentração de bilirrubina direta da amostra analisada. 
Bilirrubina Total - BT: A bilirrubina indireta (não conjugada) é desligada da albumina e solubilizada por ação do acelerador, sendo dosada juntamente com a bilirrubina direta por formação de azobilirrubina na reação com a dicloroanilina diazotada. A intensidade de cor formada é diretamente proporcional à concentração de bilirrubina total da amostra analisada. Por diferença entre BT e BD tem-se o valor da bilirrubina indireta (BI).
Amostra: SORO ou PLASMA (EDTA e heparina). 
Não usar amostras hemolisadas. Quando protegido da luz o analito é estável 4 dias entre 2 -8 ºC.
Interferências: A hemólise interfere nos resultados. Valores de triglicérides até 1500 mg/dL não produzem interferências significativas na bilirrubina total e valores até 1000 mg/dL na bilirrubina direta.
Materiais necessários:
· Espectrofotômetro (leitura entre 530 e 550 nm); 
· Banho-maria ou termostatizador com temperatura regulada em 37 ºC; 
· Tubos e pipetas; 
· Cronômetro.
Procedimento do teste: 
A- Condições de Reação Leitura: 
Comprimento de onda 546 nm (530 a 550 nm).
Tipo de Reação: Ponto final.
Notas 
1. Para a calibração das dosagens de bilirrubina total e direta, utilizar o produto Calibrador Cat. 410 da Gold Analisa. 
2. Fator de Calibração esperado para BD: 13,5 - 16,5. 
3. Fator de Calibração esperado para BT: 25,7 - 35,0. 
4. Ver o preparo do Calibrador nas Instruções de Uso do produto. As concentrações de bilirrubina total e bilirrubina direta vêm estipuladas em uma tabela anexa às Instruções de Uso do Calibrador - Cat. 410. 
5. As técnicas de análise apresentadas (BD e BT) são aplicáveis nos equipamentos semi-automáticos e espectrofotômetros. No site Gold Analisa estão disponíveis protocolos para analisadores automáticos e alguns semi-automáticos.
B- Técnica de Análise da Bilirrubina Direta – BD
1- Identificar 4 tubos de ensaio e proceder:
2- Homogeneizar e incubar em banho-maria a 37 ºC por 5 minutos.
3- Adicionar aos tubos:
4- Homogeneizar e incubar em banho-maria a 37 ºC por 5 minutos.
5- Ler a absorbância do Branco Calibrador (Branco Calib.), Calibrador, Branco Teste e Teste em 546 nm (530 a 550 nm), acertando o Zero com água deionizada. A cor é estável por 30 minutos.
Resultados:
Bilirrubina direta:
Pad – Bco Pad = 0,036
SCN – Bco SCN = 0,069
SCP – Bco SCP = 0,245
A – Bco A = 0,089
Bilirrubina total:
Pad – Bco Pad = 0,302
SCN – Bco SCN = 0,031
SCP – Bco SCP = 0,185
A – Bco A = 0,067
Linearidade: A reação é linear até 25,0 mg/dL. Para valores maiores, diluir a amostra com solução de NaCl 150 mmol/L (0,85%) e realizar uma nova determinação. Multiplicar o valor obtido pelo fator de diluição empregado.
Valores de referência: 
1- Adultos, adolescentes e crianças
 Bilirrubina Total: até 1,2 mg/dL
 Bilirrubina Direta até 0,4 mg/dL
2- Recém-nascidos - Bilirrubina Direta: até 0,4 mg/dL
3- Recém-nascidos - Bilirrubina Total
 1 dia: até 5,1 mg/dL
 1 a 2 dias: até 7,2 mg/dL
 3 a 5 dias: até 10,3 mg/dL
2.7. DETERMINAÇÃO
Método: 
Significado clínico: 
Fundamento: 
Amostra: 
Interferências: 
Materiais necessários: 
Procedimento do teste: 
Resultados:
Linearidade: 
Valores de referência: 
2.8. DETERMINAÇÃO
Método: 
Significado clínico: 
Fundamento: 
Amostra: 
Interferências: 
Materiais necessários: 
Procedimento do teste: 
Resultados:
Linearidade: 
Valores de referência: 
3. CONCLUSÃO 
 Podemos concluir que a bioquímica clínica é uma grande aliada da medicina na prevenção, no diagnóstico e no tratamento de enfermidades, oferecendo dados relevantes acerca da saúde do paciente, através de exames laboratoriais. Dessa maneira, torna-se uma das disciplinas mais importantes na formação acadêmica de um biomédico. 
4. REFERÊNCIAS
ALT – PP. Kit para determinação da alanina aminotransferase (ALT) por metodologia cinética-UV. Cat. 422, MS 80022230086. Gold Analisa Diagnóstica Ltda. Farmacêutica responsável:Ludmilla Parreiras Campos, CRF-MG: 25481. Belo Horizonte - MG. Edição: 08/12. Bula de Kit. Disponível em: http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7B3F64B228-7274-45C7-82A8-4CB15A582DD1%7D_alt_pp.PDF Acesso em: 07 de setembro de 2020.
CÁLCIO – PP. Kit para determinação do cálcio por metodologia colorimétrica. Cat. 448, MS 80022230080. Gold Analisa Diagnóstica Ltda. Farmacêutica responsável: Ludmilla Parreiras Campos, CRF-MG: 25481. Belo Horizonte - MG. Edição: 08/12. Bula de Kit. Disponível em: http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7B8AA386BC-48CD-45B3-9108-E26684199360%7D_calcio_pp.PDF Acesso em: 26 de outubro de 2020.
CREATININA – PP. Kit para determinação da creatinina por metodologia cinética-colorimétrica. Cat. 435, MS 80022230066. Gold Analisa Diagnóstica Ltda. Farmacêutica responsável: Ludmilla Parreiras Campos, CRF-MG: 25481. Belo Horizonte - MG. Edição: 08/12. Bula de Kit. Disponível em: http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7BD654D0FA-389C-4C01-9EA2-53CE2E8D0973%7D_creatinina_pp.PDF Acesso em: 22 de setembro de 2020.
GAMA GT – PP. Kit para determinação da gama-glutamiltransferase (Gama GT) por metodologia cinética-colorimétrica. Cat. 461, MS 80022230076. Gold Analisa Diagnóstica Ltda. Farmacêutica responsável: Ludmilla Parreiras Campos, CRF-MG: 25481. Belo Horizonte - MG. Edição: 08/12. Bula de Kit. Disponível em: http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7BD6E1739B-8D9C-4092-ACE1-311DCF5651CC%7D_gama_gt_pp.PDF Acesso em: 20 de setembro de 2020.
MOTTA, Valter T. Bioquímica Clínica para o Laboratório: Princípios e Interpretações. 4ªed. Porto Alegre: Editora Médica Missau; São Paulo: Robe editorial, EDUCS – Caxias do Sul, 2003.
URÉIA – PP. Kit para determinação da uréia por metodologia enzimática-colorimétrica. Cat. 427, MS 80022230063. Gold Analisa Diagnóstica Ltda. Farmacêutica responsável: Ludmilla Parreiras Campos, CRF-MG: 25481. Belo Horizonte - MG. Edição: 08/12. Bula de Kit. Disponível em: http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7B8E5B47D6-7A25-4ADE-90F0-B8A7C9443D1A%7D_UREIA_PP.PDF Acesso em: 21 de setembro de 2020.
WALLACH, Jacques. Interpretação de Exames Laboratoriais. 7ª.ed. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 2000.