BACTÉRIAS - CULTURA E ANTIBIOGRAMA

Prévia do material em texto

Julia Paris Malaco – UCT14 
SP1 – cultura e antibiograma 
 
Microscopicamente as bactérias são 
diferenciadas de acordo com suas características 
morfológicas em cocos, bacilos, espirilos, 
espiroquetas. 
 
Os cocos são esféricos e podem formar diferentes 
arranjos como cocos em dupla são denominados 
diplococos; cocos em cadeia passam a ser 
chamados de estreptococos; quando arranjados 
em cachos, sa ̃o conhecidos como estafilococos; 
agrupados em quatro, formam tétrades; quando 
em grupo de oito cocos unidos de forma 
semelhante a um cubo, são denominados sarcina. 
 
Os bacilos são bactérias que possuem forma de 
bastonetes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Além da classificação morfológica em cocos, 
bacilos e espirilos, as bactérias são classificadas, 
de acordo com suas características tintoriais, em 
Gram-positivas e Gram-negativas, quando 
submetidas a ̀ coloração de Gram. 
 
Exemplos de patógenos 
 Cocos 
Gram positivas: streptococcus, staphylococcus, 
enterococcus 
Gram negativas: neisseria, moraxellas 
 
 Bacilos 
Gram positivas: listeria, clostridium 
Gram negativas: pseudômonas, haemophilus, 
enterobacterias, escheria colli, klebsiella 
pneumoniae 
 
O método de coloração de Gram e ́ feito a partir 
de um esfregaço bacteriano, fixado em calor e 
corado com cristal violeta, lugol, álcool e fucsina, 
respectivamente. 
 
 
 
No processo de coloração de Gram, o corante 
cristal violeta e o lugol são absorvidos de uma 
maneira idêntica nas bactérias Gram-positivas e 
Gram-negativas e, inicialmente, ambas adquirem 
tonalidade roxa, em razão dos complexos 
formados pela ação dessas duas substâncias no 
citoplasma das células. 
Após o tratamento com álcool, apresentam um 
comportamento diferente, no qual as 
Gramnegativas são descoradas por essa 
substância e as Gram-positivas permanecem com 
a coloração inicial. 
 
No final do processo de coloração de Gram, e ́ 
adicionada a fucsina, que age somente nas 
bactérias descoradas pelo a ́lcool na etapa 
anterior e que passam a adquirir a cor 
avermelhada. 
 
Assim, ao analisar no microscópio o esfregaço 
bacteriano corado pela coloração de Gram, 
podemos concluir que aquelas que apresentarem 
uma coloração roxa são denominadas de Gram-
positivas e aquelas com tonalidade avermelhada 
as Gram-negativas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Julia Paris Malaco – UCT14 
As bactérias apresentam várias estruturas internas 
e externas: parede celular, citoplasma, 
membrana citoplasmática, ribossomos, cápsula, 
fimbrias e DNA bacteriano. A cápsula, os flagelos 
e as fi ́mbrias estão presentes em apenas alguns 
gêneros e espécies 
 
A parede celular das bactérias Gram-positivas e 
Gram-negativas apresentam diferenças 
marcantes em sua estrutura e composição 
química e, de modo geral, conferem proteção a ̀ 
célula bacteriana. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A parede celular das bactérias Gram-positivas e ́ 
mais espessa, sendo composta por uma camada 
única quimicamente constituída por proteína 
denominada peptideoglicano e por ácidos 
teicoicos. 
Os ácidos teicoicos são divididos em dois tipos: 
 Os ácidos teicoicos de paredes, que estão 
ligados ao peptideoglicano, 
 Os ácidos lipoteicoicos (LTA), que estão 
ligados aos lipídeos da membrana plasmática; 
 
Em contraposição, as bactérias Gram-negativas 
são formadas por duplas camadas, sendo a 
primeira constituída de lipopolissacari ́deos, 
fosfolipídios e lipoproteína, e a outra camada fina 
de peptideoglicano. Entre a membrana externa e 
o peptideoglicano existe um espaço denominado 
espaço periplasma ́tico, que contém alta 
concentração de enzimas degradadoras, além 
das proteínas de transporte. Quimicamente, a 
membrana externa e ́ composta por uma dupla 
camada de lipídeos e lipopolissacari ́deos (LPS). O 
LPS e ́ constituído por um lipídeo A, que está ́ ligado 
ao antígeno O. 
Os lipopolissacari ́deos são endotoxinas que 
provocam diversas respostas fisiológicas no ser 
humano, como febre, isso em virtude de sua 
toxicidade. 
 
Bacterioscopia 
 
Preparações coradas; coloração de gram; 
sensibilidade menor; resultado parcial; auxilio 
medico na tomada de decisão antes do 
resultado da cultura. 
 
O diagnóstico laboratorial de doenças infecciosas 
envolve duas abordagens principais: uma consiste 
na abordagem bacteriológica, na qual o 
organismo é identificado por meio de técnicas de 
coloração e cultivo, e a outra consiste na 
abordagem imunológica (sorológica), na qual o 
organismo é identificado pela detecção de 
anticorpos contra o organismo no soro do 
paciente. 
 
Na abordagem bacteriológica de diagnóstico de 
doenças infecciosas, várias etapas importantes 
antecedem o trabalho laboratorial propriamente 
dito, ou seja, 
 Escolha do espécime apropriado a ser 
examinado, o que requer conhecimento a 
respeito da patogênese da infecção; 
 Coleta do espécime de modo apropriado, a 
fim de evitar a contaminação pela microbiota 
normal; 
 Transporte do espécime rapidamente ao 
laboratório, ou sua armazenagem correta; 
 Fornecimento de informações essenciais para 
orientar os profissionais do laboratório. 
 
Em geral, o trabalho desenvolvido no laboratório 
bacteriológico adota três abordagens: 
 Observação do organismo ao microscópio 
após coloração. 
 Obtenção de uma cultura pura do organismo 
pela inoculção em meio bacteriológico. 
 Identificação do organismo por intermédio de 
reações bioquímicas, crescimento em meios 
seletivos, sondas de DNA, ou reações com 
anticorpos específicos. Tanto a escolha das 
abordagens a serem utilizadas quanto a 
sequência em que serão empregadas 
dependem do tipo do espécime e do 
organismo. Após o crescimento do organismo 
em cultura, sua sensibilidade em relação a 
vários antibióticos. 
 
Antimicrobianos 
 
Antimicrobianos são substâncias naturais, 
semissintéticas ou sintéticas que eliminam 
(bactericidas) ou inibem o crescimento 
(bacteriostáticos) dos microrganismos. 
 
Os microrganismos importantes sob a perspectiva 
médica podem ser classificados em 4 grupos 
gerais: bactérias, vírus, fungos e parasitos. 
 
 
Julia Paris Malaco – UCT14 
Antibióticos 
 
Cada antimicrobiano pode ser classificado de 
acordo com a sua atividade: 
 Bacteriostáticos: descrevem os antibióticos 
que inibem o crescimento dos microrganismos 
 Bactericida: descrevem os antimicrobianos 
que matam as bactérias 
 
Dois importantes conceitos devem ser lembrados 
ao se considerar o uso dos antimicrobianos: 
 Espectro de ação: Cada antimicrobiano está 
associado a um espectro particular de 
atividade. Esse espectro de atividade 
descreve o número de diferentes espécies de 
microrganismos que são sensíveis a esse 
fármaco. Antibióticos de amplo espectro são 
aqueles que atuam em diferentes espécies de 
bactérias, enquanto os de baixo espectro são 
efetivos contra um pequeno número de 
espécies bacterianas. 
 Concentração inibitória mínima: É a 
concentração de antimicrobiano necessária 
para inibir o crescimento bacteriano, de forma 
que quanto menor a MIC, maior a potência. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mecanismo de ação do antibiótico 
 
Os antimicrobianos podem agir contra as 
bactérias por diferentes mecanismos de ação, 
que incluem: 
 Inibição da síntese da parede celular 
o β-lactâmicos, glicopeptídeos, fosfomicina; 
 Aumento da a permeabilidade da membrana 
celular 
o Polimixinas, daptomicina; 
 Inibição da síntese proteica a síntese proteica 
o Macrolídeos, lincosamidas, tetraciclinas, 
glicilciclinas, aminoglicosídeos, 
estreptograminas, oxazolidinonas, 
cloranfenicol; 
 Inibição da síntese de ácidos nucleicos 
o Rifamicinas, fluoroquinolonas, 
nitroimidazóis e nitrofuranos; 
 Inibição da síntese de metabolitos essenciaiso Sulfonamidas. 
 
 Resistencia 
Microrganismos resistentes são aqueles capazes 
de se multiplicar em concentrações mais altas de 
antimicrobianos que as obtidas com o uso de 
doses terapêuticas. 
A resistência ocorre de 2 formas. 
 A primeira é chamada primária ou intrínseca, 
na qual as bactérias são naturalmente 
resistentes aos antimicrobianos (como 
exemplo, a bactéria Mycoplasma 
pneumoniae não tem parede celular, 
portanto e ́ naturalmente resistente aos β-
lactâmicos). 
 A segunda forma é a secundária ou adquirida, 
que ocorre por desenvolvimento de novos 
mecanismos de defesa por parte do 
microrganismo perante a exposição 
continuada ao antimicrobiano (seleção de 
resistência). 
 
Os mecanismos de resistência da bactéria diante 
dos fármacos incluem: 
 Inativação ou modificação enzimática – de 
enzimas que inibem o fármaco 
 Sintetizam alvos modificados, contra os quais 
os fármacos não tem efeito 
 Reduzem sua permeabilidade ao fármaco de 
modo que uma concentração intracelular 
efetiva do fármaco não é obtida 
 Desenvolvimento de uma via alternativa à 
inibida 
 Aumento da síntese do local-alvo 
 Diminuição da captação ou efluxo do 
fármaco pelo microrganismo. 
 As bactérias exportam fármacos ativamente 
por meio do uso de “bombas de resistência 
múltipla a fármacos” (bomba MDR, ou bomba 
de “efluxo”). A bomba MDR importa prótons e, 
em uma reação do tipo permutação, exporta 
uma variedade de moléculas exógenas, 
incluindo certos antibióticos, como as 
tetraciclinas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Julia Paris Malaco – UCT14 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
O termo alto nível de resistência é utilizado para os 
casos em que a resistência ao antimicrobiano não 
pode ser superada pelo aumento da dose do 
fármaco. Nesses casos, um antibiótico, 
geralmente de uma classe diferente, é utilizado. 
O termo baixo nível de resistência é utilizado 
quando a resistência pode ser superada pelo 
aumento da dose do antibiótico. 
 
 β-lactâmicos 
Os antibióticos β-lactâmicos são uma classe 
ampla de antibióticos, que inclui a penicilina e 
seus derivados 
Possuem o núcleo β-lactâmico em sua estrutura 
molecular 
Mais usado grupo de antibióticos 
Agem inibindo a síntese da parede celular 
São eles: Penicilinas, cefalosporinas, monobactans 
e carbapenens. 
 Resistência: 
o Alteração de Proteínas Ligadoras de 
Penicilina (PLPs) ou Penicillin-binding 
proteins (PBPs) 
o Produção de -lactamases 
o Diminuição da permeabilidade da 
membrana e ativação do mecanismo 
de efluxo. 
 
 
Produção de Beta-lactamase – em gram negativo e 
gram postivo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Resistência em cocos gram positivos 
 Staphylococcus aureus resistente à Meticilina 
(MRSA) - Importância do mecanismo de 
resistência 
O principal mecanismo de resistência é a 
produção de proteína auxiliar de ligação à 
penicilina PBP2a/PBP2c que tornam o isolado 
resistente a todos os β-lactâmicos, exceto a 
nova classe de cefalosporinas “anti-MRSA”. 
Esses agentes tem afinidade suficientemente 
elevada a ̀ PBP2a, e provavelmente também à 
PBP2 codificada por mecC (anteriormente 
designado mecALGA251), para serem ativos 
contra MRSA. As PBPs auxiliares são 
codificadas pelo gene mecA ou mecC 
recentemente descrito. O elemento mec é 
exógeno ao S. aureus e não está presente em 
S. aureus sensível à meticilina. Cepas com 
expressão heterogênea do gene mecA e CIMs 
frequentemente baixas prejudicam a 
acurácia dos testes de sensibilidade. 
 
Além disso, alguns isolados expressam a 
resistência de baixo nível à oxacilina, mas são 
mecA e mecC negativo e não produzem PBPs 
auxiliares [S. aureus com sensibilidade 
borderline (BORSA)]. 
Essas cepas são relativamente raras e o 
mecanismo o de resistência é mal 
caracterizado, mas pode incluir 
hiperproduc ̧a ̃o de β-lactamases ou alteração 
das PBPs pré-existentes. Isolados de S. aureus 
positivos para mecA que são sensíveis tanto a 
cefoxitina como a oxacilina (OS-MRSA) devido 
à inativação do mecA foram descritos em 
diferentes partes do mundo. 
Essas cepas são diferentes dos MRSA com 
resistência heterogênea, que também são 
sensíveis à oxacilina, mas resistentes à 
cefoxitina. Estima-se que a frequência de tais 
isolados seja aproximadamente 3% de acordo 
com resultados fenotípicos convencionais 
combinados com resultados de PCR positivos 
para mecA. Métodos recomendados para a 
detecção da resistência à meticilina em S. 
aureus 
 A resistência à oxacilina/meticilina pode 
ser detectada fenotipicamente pela 
determinação da CIM bem como por 
teste de disco-difusão. Aglutinação com 
látex pode ser usado para detectar PBP2a, 
mas não é confiável para detectar PBP2c. 
Detecção genotípica utilizando a PCR é 
confiável. 
 Detecção por determinação da CIM ou 
disco-difusão: A expressão heterogênea 
de resistência afeta particularmente a CIM 
Julia Paris Malaco – UCT14 
de oxacilina, a qual pode se mostrar 
sensível. A cefoxitina é um marcador muito 
sensível e específico da resistência 
mediada por mecA/mecC e é o fármaco 
de eleição para o disco-difusão. O uso do 
teste de disco-difusão com oxacilina deve 
ser desencorajado e os critérios 
interpretativos para os halos de inibição 
não estão mais incluídos na tabela de 
pontos de corte do EUCAST devido à fraca 
correlação com a presença de mecA. 
 Microdiluição em caldo: A metodologia 
padrão (ISSO 20776-1) deve ser utilizada e 
cepas com CIM > 4 mg/L deve ser 
reportadas como resistentes a meticilina. 
 Disco-difusão: Utilizar a metodologia de 
disco-difusão do EUCAST. Cepas com um 
halo de inibição < 22 mm para a cefoxitina 
devem ser reportadas como resistentes a 
meticilina. Detecção por métodos 
genotípicos A detecção genotípica dos 
genes mecA e mecC por metodologia 
molecular (PCR) é possível pela utilização 
de testes comerciais ou padronizados no 
próprio laboratório. 
 
 Enterococcus faecium ou Enterococcus 
faecalis com resistência à vancomicina (VRE) 
- (CIM de vancomicina > 4 mg/L) 
A resistência clinicamente relevante é mais 
frequentemente mediada por ligases VanA e 
VanB, codificadas por plasmídeos, que 
substituem no peptidoglicano o terminal D-Ala 
por D-Lac. Esta substituição reduz a ligação de 
glicopeptídeos ao alvo. As cepas VanA 
exibem resistência tanto à vancomicina 
quanto à teicoplanina, enquanto as cepas 
VanB geralmente permanecem sensíveis à 
teicoplanina, devido à ausência de indução 
do operon de resistência. Outras enzimas Van 
de menor prevalência são VanD, VanE, VanG, 
VanL, VanM e VanN, embora a VanM tenha 
aumentado significativamente em E. faecium 
na China. 
 A resistência à vancomicina pode ser 
detectada pelos métodos de 
determinação da CIM, discodifusão e 
triagem em ágar. 
 
Há uma probabilidade significativamente 
aumentada de infecções associadas à assistência 
à saúde (infecções hospitalares) serem causadas 
por organismos resistentes a antibióticos, quando 
comparadas as infeções adquiridas na 
comunidade. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tratamento empírico 
 
Iniciação do tratamento baseado na 
apresentação clínica 
 Trata-se realmente de uma infecção? 
 É uma infecção comunitária ou hospitalar? 
 Qual o foco? 
 Qual a gravidade da infecção? 
Após o resultado do exame – decisão de mudar 
ou não o tratamento 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Cultura 
Resultado da cultura: Seleção de ATB 
 
 
 
 
 
 
 
 
Descalonamento: Administração inicial de 
tratamento empírico de amplo espectro, com 
objetivo de cobrir os patógenos mais 
frequentemente relacionados à infecção a ser 
tratada e, assim que o agente causador for 
identificado, ajustar o tratamento 
 
 
 
 
Julia Paris Malaco – UCT14 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Inclui alteração de terapia combinada por 
monoterapia 
Objetivos:Reduzir mortalidade e morbidade com 
o início precoce de terapia empírica ampla Limitar 
o desenvolvimento de resistência bacteriana por 
meios da redução da pressão seletiva, com a 
suspensão do antimicrobiano ou a redução do 
espectro 
 
 Antibiograma 
Antibiograma ou teste de sensibilidade aos 
antimicrobianos (TSA) tem como principal objetivo 
predizer o resultado do tratamento com os 
agentes antimicrobianos testados. Representa 
também uma importante ferramenta no 
monitoramento da evolução da resistência 
bacteriana, além de auxiliar na implantação de 
medidas de controle que evitem a disseminação 
de bactérias multirresistentes. 
 
O método mais utilizado é o teste de disco difusão 
em ágar em função da facilidade técnica e da 
obtenção de resultados confiáveis. A maior 
limitação deste método é que seus resultados são 
qualitativos, ou seja, o micro-organismo é avaliado 
como sensível, intermediário ou resistente aos 
diversos antimicrobianos testados. 
 A droga presente nos discos se difunde no 
meio de cultura, de modo que a 
concentração do antimicrobiano decresce à 
medida que se distancia do disco, formando 
uma espécie de gradiente de concentração 
do antibiótico ao redor deste disco. Com a 
devida incubação desta placa, nas áreas 
onde a concentração do antimicrobiano é 
inibitória, não ocorre crescimento do micro-
organismo, formando-se então as zonas de 
inibição ao redor dos discos. O diâmetro da 
zona de inibição é inversamente proporcional 
a CIM e é influenciado por vários fatores, como 
a velocidade da difusão da droga no ágar 
(que varia de acordo com o antimicrobiano), 
pelo inóculo bacteriano, pH do meio de 
cultura, condições de estocagem das placas, 
temperatura e tempo de incubação e até 
mesmo da quantidade de ágar na placa. 
 
As técnicas quantitativas mais utilizadas são: 
diluição em caldo, que pode ser realizada em 
macro ou micro técnica, diluição em ágar, difusão 
quantitativa, mais conhecida como E-test e as 
técnicas automatizadas. 
 
 Concentração inibidora/inibitória mínima 
(CIM) 
Em muitas infecções, os resultados dos testes de 
sensibilidade são importantes para a escolha do 
antibiótico. Esses resultados são comumente 
relatados como concentração inibidora mínima 
(CIM), sendo definida como a menor 
concentração do fármaco capaz de inibir o 
crescimento do organismo. A CIM é determinada 
por meio de inoculação do organismo, isolado a 
partir do paciente, em uma série de tubos ou 
frascos contendo diluições do fármaco na base 
dois. Após incubação a 35°C por 18 horas, a 
menor concentração do fármaco que impede o 
crescimento visível do organismo corresponde a ̀ 
CIM. Isso fornece ao médico uma concentração 
precisa do fármaco, orientando na escolha tanto 
do fármaco quanto da dosagem a ser usada. 
Um segundo método para determinar a 
sensibilidade ao antibiótico consiste no método 
de difusão em disco, em que discos impregnados 
com antibióticos variados são posicionados na 
superfície de uma placa de meio sólido que foi 
inoculada com o organismo isolado do paciente. 
Após a incubação a 35°C por 18 horas, período 
em que o antibiótico se difunde a partir do disco, 
determina-se o diâmetro da zona de inibição. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
O tamanho da zona de inibição é comparado 
com padrões, a fim de determinar a sensibilidade 
do organismo ao fármaco. 
 
Concentração bactericida mínima: Essa 
concentração, denominada concentração 
bactericida mínima (CBM), é determinada 
Julia Paris Malaco – UCT14 
coletandose uma pequena amostra (0,01 ou 0,1 
mL) dos tubos utilizados para o ensaio de CIM, 
semeando-os sobre a superfície de uma placa de 
agar-sangue desprovida de fármaco. Quaisquer 
organismos que forem inibidos, mas não mortos, 
exibem a possibilidade de crescer, uma vez que o 
fármaco foi diluído significativamente. Após a 
incubação a 35°C por 48 horas, a menor 
concentração que reduziu o número de colônias 
em 99,9%, comparando-se ao controle desprovido 
do fármaco, corresponde a CBM. Os fármacos 
bactericidas geralmente exibem CBM igual ou 
muito similar a CIM, ao passo que os fármacos 
bacteriostáticos “em geral” apresentam CBM 
significativamente superior a CIM. 
 
 Cocos gram positivos de interesse na clínica 
médica 
 Enterococcus spp. 
Resistência intrínseca a baixos níveis de Penicilina 
e Aminoglicosídeos. 
Tratamento de Infecções Graves: associação 
entre antibiótico que age em parede (ampicilina, 
penicilina ou vancomicina) e Aminoglicosídeo. 
 
*Ampicilina - é a classe representativa para 
ampicilina e amoxacilina. O resultado de 
ampicilina pode ser usado para predizer 
sensibilidade para amoxacilina-ácido clavulânico, 
ampicilina-sulbactam, piperacilina e piperacilina-
tazobactam, entre os enterococos não produtores 
de -lactamases. 
*Penicilina - A sensibilidade dos Enterococcus 
spp. para penicilina prediz sensibilidade para 
ampicilina, amoxacilina, amoxacilina-ácido 
clavulânico, ampicilina-sulbactam, piperacilina e 
piperacilina-tazobactam, entre os enterococos 
não produtores de -lactamases. Entretanto isto 
não quer dizer que enterococos sensíveis à 
ampicilina são sensíveis à penicilina. Se o resultado 
para penicilina for solicitado, deve-se testar 
também o disco de penicilina. 
 
Resistência aos glicopeptídeos: Inibem a síntese 
de parede celular, por inibirem a síntese de 
peptideoglicano. Ligam-se a porção d-alanil-d-
alanina, precursor do peptideoglicano 
 Glicopeptídeo: Vancomicina; Oritavancin 
 Lipoglicopeptídeo: Teicoplanina; 
Dalbavancin; Telavancin 
 
Resistência aos aminoglicosídeos: Inibem a síntese 
proteica: 
 Por se ligarem irreversivelmente à subunidade 
30S do ribossomo. Impede a tradução do RNA 
mensageiro durante a síntese proteica. 
 Devido a captação diminuída do antibiótico 
o Intrínseca e adquirida 
o Os aminoglicosídeos são carregados 
positivamente 
o Dificuldades para atravessar a mb externa 
(Gram -) ou mb citoplasmática (Gram +). 
o Conferem resistência a baixos níveis de 
antibiótico 
 Produção de enzimas modificadoras e 
modificação do alvo ribossomal 
o Adquirida (plasmídio ou transposons) 
o Conferem resistência a altos níveis (HLAR – 
High level aminoglycosides resistance). 
 
No antibiograma: O resultado da gentamicina 
(em alta concentração) pode ser aplicado a 
todos os demais aminoglicosídeos (amicacina, 
tobramicina, canamicina, etc), exceto à 
estreptomicina, que deve, portanto, ser testada 
separadamente 
 Aminoglicosídeos: Gentamicina; Kanamicina; 
Amicacina; Estreptomicina; Tobramicina; 
Netilmicina; Neomicina; Plazomicin