Aula 2 - Técnicas de flutuação e sendimentação

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Técnicas de flutuação e 
sedimentação
Profª Gabriela Ayres Fragoso Nascimento
Técnicas de flutuação
Profª Gabriela Ayres Fragoso Nascimento
Técnicas de flutuação
Técnicas de Flutuação
❖Flutuação em Solução Saturada de Cloreto de Sódio
❖Flutuação em Solução de Sulfato de Zinco
❖Flutuação em Solução de Sulfato de Magnésio
Técnicas de flutuação
Princípio:
❖ Diferença de densidade específica entre os ovos de helmintos, cistos e oocistos
de protozoários e o material fecal
❖ Organismos flutuem na superfície dos reagentes com densidade específica
➢ Meio contendo grande solução salina
Técnicas de flutuação
Vantagens:
❖ Formação de membrana clara com poucos detritos
❖ Remoção seletiva de ovos e cistos (concentração)
Desvantagens:
❖ Alta densidade pode promover colapso da membrana
❖ Parasitos apresentam-se distorcidos
❖ Amostra deve ser analisada entre 10 e 20 minutos
Técnicas de flutuação
São visualizados:
❖ Ovos leves – ancilostomídeos, alguns trematódeos (Clonorchis e o Heterophyes)
❖ Cistos de E. histolytica/díspar, Giardia lamblia, Balantidium coli
Entamoeba histolytica
Entamoeba histolytica Entamoeba coli
❖ 1 a 4 núcleos ❖ 5 a 8 núcleos
Giardia lamblia
Morfologia
Cisto
❖Formato oval ou elipsóide
❖Dois a quatro núcleos
❖Corpos escuros em formato de meia lua
Forma infectante
Técnicas de flutuação
Não são visualizados:
❖ Trofozoítos e ovos pesados e operculados
❖ Ovos operculados: S. mansoni, Ascaris lumbricoides, Taenia sp.
Técnica de Willis
Flutuação em Solução Saturada de Cloreto de Sódio
❖ Fundamenta-se na dupla propriedade que apresentam certos
ovos de helmintos e protozoários de flutuarem na superfície
de uma solução de densidade elevada e de aderirem ao
vidro
❖ Utiliza amostras frescas (não conservadas)
Técnica de Willis
Flutuação em Solução Saturada de Cloreto de Sódio
❖ Indicado para a pesquisa de ovos com densidade específica baixa
(ancilostomídeos)
Ancilostomídeos
Ancylostoma
duodenale
Ancylostoma
ceylanicum
Necator
americanus
Ancilostomídeos
❖ ovo de casca fina e transparente, de forma
elipsóide com massa embrionária no interior
Enterobius vermicularis
Ovos
❖50µm de comprimento por 20µm de largura
❖Um lado é sensivelmente achatado e o outro é
convexo (forma de D)
❖Membrana dupla, lisa e transparente.
Enterobius vermicularis
Técnica de Willis
Técnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar uma quantidade de fezes frescas de aproximadamente 1 a 2g, coletada de
várias partes do bolo fecal, em pequena cuba de vidro de 3cm de diâmetro com
capacidade aproximada de 20ml. Completar 1/4 da capacidade do recipiente com solução
saturada de cloreto de sódio.
3. Suspender as fezes na solução saturada salina até haver uma total homogeneização.
Técnica de Willis
Técnica
4. Completar o volume. Colocar uma lamínula (22 x 22mm) ou uma lâmina sobre a
borda da pequena cuba.
5. A lamínula deve ficar em contato com o menisco durante 30 a 45 minutos; não
deverá haver formação de bolhas de ar entre a lamínula e a superfície do líquido. A
gota contendo os ovos se adere à face inferior da lamínula.
6. Remover a lamínula e inverter rapidamente sua posição sobre uma lâmina.
Examinar ao microscópio com objetiva de pequeno aumento.
Técnica de Faust
Flutuação em Solução Saturada de Sulfato de Zinco
❖ Fundamenta-se na dupla propriedade que apresentam certos ovos de
helmintos de flutuarem na superfície de uma solução de densidade
elevada e de aderirem ao vidro
❖Modificada a partir da técnica de Willis
Técnica de Faust
Técnica de Phillipson
Flutuação em Solução Saturada de Sulfato de Magnésio e Cloreto de Sódio
❖ Fundamenta-se na dupla propriedade que apresentam certos ovos de
helmintos de flutuarem na superfície de uma solução de densidade elevada e
de aderirem ao vidro
❖ Permite a flutuação de ovos pesados
Técnicas de sedimentação
Técnicas de sedimentação
Técnicas de Sedimentação
❖Sedimentação Espontânea: Técnica de Lutz ou Técnica de Hoffman, Pons e Janner
❖Centrífugo-sedimentação pela Formalina-éter
❖Centrífugo-sedimentação pela Formalina-acetato de Etila
Técnicas de sedimentação
Técnicas de sedimentação
Ascaris lumbricoides
❖Morfologia
Ovos
Técnicas de Hoffman
Sedimentação Espontânea
Fundamento: sedimentação espontânea em água (combinação da gravidade e da
sedimentação).
❖ Os ovos operculados e de esquistossoma são facilmente recuperados
❖ O uso de grande quantidade de material fecal favorece um diagnóstico satisfatório e
seguro, mesmo quando o número de organismos presentes é pequeno.
Técnicas de Hoffman
Sedimentação Espontânea
Vantagens:
❖ Necessidade mínima de vidraria, sendo dispensável o uso de reagentes e da
centrifugação.
❖ Visualização de cistos e ovos leves e pesados
Técnicas de Hoffman
Sedimentação Espontânea
Desvantagens:
❖ Grande quantidade de detritos fecais no sedimento, dificultando, com freqüência, a
preparação e o exame da lâmina
Técnicas de Hoffman
Sedimentação Espontânea
Técnica:
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar cerca de 5g de fezes frescas, colhidas de várias partes do bolo fecal, em copo
graduado ou em bequer (cálice de sedimentação) de 250ml. Completar o volume de 50 a
60ml com água corrente e misturar vigorosamente.
3. Preparar a suspensão juntando 100ml de água corrente.
Técnicas de Hoffman
Sedimentação Espontânea
Técnica:
4. Filtrar a suspensão através de gaze, levemente umedecida em água corrente, dobrada
duas vezes e receber o filtrado em copo cônico com capacidade de 125ml.
5. Se necessário, adicionar água corrente até completar aproximadamente 3/4 do volume
do copo cônico. Deixar a suspensão em repouso durante uma a duas horas.
Técnicas de Hoffman
Sedimentação Espontânea
Técnica:
6. Com uma longa pipeta capilar, fixada a um bulbo de borracha, colher uma pequena
porção do sedimento na camada inferior, depositando-o sobre uma lâmina.
7. Examinar ao microscópio a presença de ovos, larvas e cistos.
Técnicas de Hoffman
Técnicas de Ritchie
Centrífugo- Sedimentação
Fundamento: sedimentação por centrifugação em água (utilização de força centrífuga).
❖ Concentração de parasitos
❖ Recupera ovos, cistos e larvas
Técnicas de Ritchie
Centrífugo- Sedimentação
Técnica:
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar 1 ou 2g de fezes frescas colhidas de várias partes do bolo fecal em frasco
contendo 10ml de água corrente ou solução salina a 0,85%.
3. Filtrar a suspensão através de gaze, levemente umedecida em água corrente, dobrada
duas vezes e receber o filtrado em um tubo de centrífuga de 15ml com fundo redondo.
Técnicas de Ritchie
Centrífugo- Sedimentação
Técnica:
4. Centrifugar (650 x g/1min).
5. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2ml de água corrente ou solução salina a
0,85% ao sedimento antes de ressuspendê-lo. Completar com água corrente (ou solução
salina a 0,85%) 2/3 do volume do tubo. Agitar e centrifugar (650 x g/1min).
6. Repetir a etapa 4, até que o sobrenadante se apresente relativamente claro.
Técnicas de Ritchie
Centrífugo- Sedimentação
Técnica:
7. Depois que o último sobrenadante é decantado, ressuspender o sedimento com 1 a
2ml de formalina a 10% (dar preferência à solução tamponada de formalina a 10%, pH
neutro). Completar o volume da suspensão em 10ml com formalina a 10%. Deixar em
repouso durante cinco minutos.
8. Adicionar 3ml de éter ou acetato de etila, fechar o tubo e agitar vigorosamente, na
posição invertida, por 30 segundos. Remover a tampa com cuidado.
Técnicas de Ritchie
Centrífugo- Sedimentação
Técnica:
9. Centrifugar (500 x g/1min).
Quatro camadas se formarão: 1.ª) sedimento no
fundo do tubo contendo os parasitos; 2.ª) camada
de formalina; 3.ª) tampão de detritos fecais; e 4.ª)
camada de éter na superfície
Técnicas de Ritchie
Centrífugo- Sedimentação
Técnica:
10. Afrouxar e separar o tampão de detritos das
paredes do tubo comum estilete fino e, com
cuidado, decantar as três camadas superiores.
Limpar com swab de algodão as paredes do
tubo, removendo os detritos remanescentes.
Técnicas de Ritchie
Centrífugo- Sedimentação
Técnica:
11. Uma pequena quantidade do líquido que
permanece nas paredes do tubo escorre para o
fundo junto ao sedimento. Misturar o líquido e
o sedimento, preparando as lâminas para a
pesquisa de ovos, larvas e cistos
Técnicas de centrífugo 
sedimentação
Observações
❖ A água corrente poderá ser substituída pela solução salina a 0,85% durante todo o
procedimento, conquanto a adição de água às fezes frescas causa a ruptura dos
cistos de Blastocystis hominis
❖ O acetato de etila é mais eficiente do que éter etílico na pesquisa de ovos de
Taenia spp. ou H. nana ou cistos de G. lamblia (menor tendência para que esses
ovos e cistos fiquem retidos no tampão de detritos fecais.)
Centrífugo-sedimentação
Adaptações:
❖ Centrífugo-sedimentação pelo acetato de sódio-ácido acético
➢ Material fecal preservado pela solução de mertiolato-iodo-formaldeído
❖ Centrífugo-sedimentação pelo sulfato de sódio-ácido clorídrico-triton-éter (AMS III)
➢ Material fecal preservado pela solução fixadora acetato de sódio-ácido acético-
formaldeído (SAF).