Processos Histológicos e Técnicas de Histologia

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA (FAVET)
DISCIPLINA DE HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA GERAL VETERINÁRIA
RELATÓRIO DE PROCESSOS HISTOLÓGICOS 
PARA MICROSCOPIA ÓPTICA
Docente: Dra. Janaína Serra Azul Monteiro Evangelista
Discentes: Amanda Oliveira Fernandez; Maria Jamille C. de Mesquita; Lara Cortez Passos; Lorena de Freitas Câmara; Vanessa Cordeiro Lima.
FORTALEZA
2021
 
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO	3
2. MICROSCOPIA ÓPTICA	4
3. ETAPAS DO PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO	5
3.1 Coleta	5
3.2 Fixação	6
3.2.1 Técnica da perfusão para lavagem e fixação do tecido	7
3.2.2 Técnica de fixação por imersão	8
3.3 Desidratação	9
3.3.1 Processo de desidratação	9
3.4 Clarificação	10
3. 4.1Processo de clarificação	10
3.5 Inclusão	11
3.6 Microtomia	13
3.7 Coloração	16
CONCLUSÃO	17
REFERÊNCIAS	18
1 INTRODUÇÃO
	Histologia é o estudo das células e dos tecidos do corpo e de como essas estruturas se organizam para constituir os órgãos (JUNQUEIRA, 2013). Para este fim, é indispensável o uso do microscópio, considerando as pequenas dimensões das células. Além disso, ressalta-se aqui a importância da compreensão das técnicas histológicas necessárias para a análise dos elementos teciduais. 
No microscópio de luz (ou microscópio óptico), a imagem se forma a partir dos raios luminosos de um feixe de luz que atravessam uma estrutura. Células vivas, camadas muito delgadas de células ou de tecidos, membranas transparentes de animais vivos (como por exemplo, a cauda de um girino) podem ser observadas diretamente ao microscópio. Dessa maneira, é possível estudar essas estruturas por longos períodos sob diferentes condições fisiológicas ou experimentais. 
Por outro lado, na maioria dos casos, os tecidos e órgãos são espessos e não possibilitam a passagem adequada da luz para a formação de uma imagem. Por essa razão, antes de serem examinados ao microscópio eles devem ser fatiados em seções ou cortes histológicos. Isso é feito por meio de instrumentos de grande precisão chamados micrótomos, mas antes os tecidos e órgãos necessitam passar por uma série de tratamentos. Nesse caso, vale destacar a importância de um bom planejamento para a execução dos procedimentos, pois dessa forma é possível evitar acontecimentos indesejados durante a realização de qualquer etapa desse processo.
Assim, neste trabalho objetivamos discutir inicialmente as características gerais da microscopia óptica, seus componentes estruturais e suas respectivas funções, e em seguida descrever cada etapa do processamento das amostras teciduais. São elas: coleta; fixação; desidratação; clarificação; inclusão; microtomia e coloração.
2. MICROSCOPIA ÓPTICA
A microscopia de luz ou microscopia óptica consiste em um método em que é utilizado uma fonte de luz que atravessa o espécime e projeta sua imagem para lentes que fazer o aumento e possibilita observação através das mesmas.
O microscópio de luz é composto por partes mecânicas e ópticas (Figura 1.1). O componente óptico consiste em três sistemas de lentes: condensador, objetivas e oculares.
 O condensador absorve a luminosidade da lâmpada e projeta um feixe sobre o espécime a ser observado. A objetiva recebe a luz que atravessou o espécime e projeta uma imagem aumentada do espécime em direção à ocular, que novamente amplia a imagem e a projeta na retina, em uma tela, em uma câmera fotográfica ou em um detector eletrônico. No caso das imagens projetadas na retina, a ampliação total é calculada multiplicando-se o aumento da objetiva pelo aumento da ocular).
Figura 1- Desenho esquemático de um microscópio de luz, que mostra seus componentes principais e o trajeto da luz desde a fonte luminosa até o olho do observador.
Fonte: Google imagens.
3. ETAPAS DO PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
A técnica histológica visa à preparação dos tecidos destinados ao estudado à microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e transparentes. Para isso são necessários sete processos: coleta, fixação, desidratação, clarificação, inclusão, microtomia e coloração.
3.1 Coleta
Consiste em remover amostras de tecido de um determinado organismo. Essa coleta pode ser feita quando o organismo ainda está vivo, por meio de biópsia ou durante uma cirurgia, ou mesmo post mortem, durante a realização de necropsia de animais ou seres humanos. Mais especificamente as amostras são obtidas por meio de:
· Biópsia Cirúrgica – através de uma incisão cirúrgica no órgão ou tecido;
· Biópsia Endoscópica – usada para órgãos ocos (estômago, intestino, etc.) através de endoscopia;
· Biópsia por agulha – a amostra (cilindro) é obtida pela punção do órgão (fígado, pulmão), sem precisar abrir a cavidade natural;
· Cirurgias amplas – a amostra corresponde a peças grandes (ex: tumores) ou órgãos (exemplo: mama, útero);
· Necropsia – retirada do órgão ou tecido de um animal morto.
 Figura 2 – Coleta de tecido
	 
 
 Fonte: Ishikiriama (2021).
 Figura 3 – Coleta de tecido
 Fonte: Ishikiriama (2021).
3.2 Fixação 
Ao se remover qualquer material (órgão ou tecido) de um organismo após a sua morte, esse material inicia um processo de autólise, ou seja, por não receber o suprimento necessário de oxigênio e de substâncias essenciais ao seu funcionamento, começa a haver acúmulo de dióxido de carbono nos tecidos e, em suas células, inicia-se o processo autolítico, no qual enzimas lisossomais atuam no citoplasma da própria célula.
Assim, ao se analisar as estruturas teciduais de um determinado órgão no microscópio, precisa-se preservar os tecidos, sendo imprescindível a realização do processo de fixação.
É uma etapa que visa interromper o metabolismo celular, estabilizando as estruturas e os componentes bioquímicos intra e extracelulares, preservando e conservando os elementos teciduais, além de permitir a penetração de outras substâncias subsequentes à fixação.
Diversos protocolos de fixação e tipos de fixadores são citados na literatura técnica; porém, nenhum desses procedimentos de fixação é reconhecido como perfeito. Deve-se investigar qual o fixador mais apropriado para o tipo de material a ser analisado. 
A título de exemplo, existem os fixadores aldeídos, pois estes são fixadores à base de aldeídos de amplo uso nos laboratórios de anatomia patológica e de histologia. Os mais comumente utilizados são o formaldeído, o glutaraldeído, e o paraformaldeído, que é o próprio formaldeído na sua forma pura polimerizada. Esses fixadores formam ligações cruzadas com as proteínas tissulares, tornando-as insolúveis em forma de um gel.
Figura 4 – Ação de um fixador aldeído
 
 Fonte: Marcuzzo (2021).
3.2.1 Técnica da perfusão para lavagem e fixação do tecido
Usando anestesia profunda, em ratos e camundongos, por exemplo, uma técnica que resulta em boas preparações consiste na perfusão cardíaca. Este método simula o funcionamento do sistema circulatório, uma vez que injeta os vasos do espécime com soluções químicas e perfunde os tecidos. O processo consiste inicialmente na retirada da circulação sanguínea através de lavagem feita com uma solução salina de pH neutro. Posteriormente, processa-se então a fixação através da injeção de solução fixadora. Em ambos os casos, as soluções são impulsionadas nos vasos através de tubos que se conectam à uma bomba peristáltica e à um grande vaso do animal a ser perfundido, com o arco aórtico por exemplo. 
Figura 5 – Diagrama da técnica de perfusão de tecidos de um rato.
 Fonte: Departamento de bioloxía funcionale Ciencias da saúde (2021).
3.2.2 Técnica de fixação por imersão
Além da perfusão cardíaca, pode-se também recorrer à fixação por imersão, ainda muito utilizada. O volume de fixador empregado deve ser 15 a 20 vezes maior que o volume do fragmento de tecido a ser fixado. O fixador inicia a sua ação da periferia para o centro do material. As porções periféricas do material são primeiramente fixadas em relação as suas porções mais internas. A boa penetração de qualquer fixador está diretamente relacionada ao tamanho e espessura do material. Entretanto, de acordo com o tipo de tecido, com a fixação de um encéfalo, por exemplo, a fixação por imersão seria um método condenável, devido à dificuldade de penetração da solução. Para estes casos sugere-se recorrer ao método da perfusão.
Figura 6 - Diagrama da técnica de fixação por imersão de uma amostra
Fonte: Departamento de bioloxía funcional e Ciencias da saúde (2021).
3.3 Desidratação
A desidratação é uma das etapas do processamento, que junto com a clarificação e a infiltração tornam a amostra histológica preparada para a inclusão. Tem por objetivo remover toda a água contida no tecido, pois a mesma não pode misturar-se com a parafina que será incluída.
3.3.1 Processo de desidratação
Em uma técnica de difusão por agentes desidratantes, remove-se os líquidos teciduais. A solução mais utilizada é a de Álcool etílico (C2H6O), devido ao seu baixo custo e resultados satisfatórios. Outras opções são: o toluol, óleo de cedro, benzol e salicilato de metila. 
São usadas concentrações crescentes de etanol, iniciando do álcool 70%, no qual a amostra foi colocada depois da etapa anterior, a fixação. A imersão do etanol segue de forma gradativa, passando pelos volumes alcoólicos de 80%, 96% e 100%, o álcool absoluto. Após isso, repete-se a submersão em álcool absoluto, para ter certeza que o líquido tecidual não alterou a concentração absoluta no etanol.
Em uma amostra de 3mm de espessura, é indicado 3 imersões de uma hora cada no álcool de concentração crescente, além de 3 imersões no álcool absoluto, finalizando a desidratação.
 
Figura 7. Ilustração do processo de desidratação
 Fonte: Molinaro (2010).
Ao longo do procedimento a água extraída do tecido decanta no fundo do frasco, devido à diferença de densidade entre ela e o etanol. É recomendado a agitação constante do recipiente, evitando o acúmulo de líquido no fundo, além da troca periódica da solução. 
Deve-se manter a temperatura ambiente, visto que o aquecimento do álcool oferece perigo pelo seu alto potencial de combustão e que a alteração de temperatura reverte o processo de desidratação. 
3.4 Clarificação
A clarificação, chamada também de diafanização, é o processo seguinte, ainda como um preparatório para a introdução da parafina ou de outro fixador. Tem por retirar o álcool antes da infiltração futura, pois assim como o líquido tecidual, o etanol também atrapalha no processo de impregnação e não permite a penetração do fixador de forma homogênea.
3. 4.1Processo de clarificação
Coloca-se a amostra em um recipiente de vidro com o produto clarificante, sendo sua proporção volumétrica de 10 a 20 vezes o tamanho da amostra, em temperatura ambiente.
Usa-se o Xilol (C₈H₁₀), comumente. Na medida que ele penetra na amostra substitui o álcool, tornando o tecido transparente, justificando o nome da etapa ser clarificação.
Repete-se o processo de imersão duas vezes, com a primeira durando uma hora e a segunda, duas.
O tempo adequado de imersão é importante, pois o xilol pode desidratar o material e danificar a integridade da amostra no caso de exceder esse tempo.
Recomenda-se a agitação do frasco para acelerar o procedimento de troca de substâncias.
Figura 8 - Material sendo desidratado e clarificado
 Fonte: Molinaro (2010).
A biossegurança é um fator essencial para essa etapa, pois as substâncias usadas são voláteis e inflamáveis. O uso de luva, jaleco e máscara é imprescindível pela toxicidade de seus elementos, principalmente o xilol, que agride o sistema respiratório. Aliado a isso, o descarte de substâncias químicas deve ser em locais adequados, nunca no esgoto sanitário comum.
3.5 Inclusão
Mesmo após a fixação e a desidratação, as amostras de tecido são ainda muito frágeis. Acontece então a impregnação do tecido com uma substância de consistência firme, para a obtenção de um bloco facilmente manejável e endurecido que permite a obtenção de cortes de qualidade sem destruição do tecido, deste modo os tecidos são envolvidos num meio que lhes irá conferir suporte. A parafina é a mais utilizada neste procedimento. Além do fácil manuseio e bons resultados, endurece em poucos minutos e preenche os lugares anteriormente ocupados pela água. Forma-se um bloco de parafina, que contém o espécime em seu interior.
Os fragmentos devem ser colocados na parafina enquanto aquecidos, evitando-se a formação de bolhas de ar em torno deles. Após o resfriamento, os blocos de parafina com o material incluído são obtidos. Para se realizar uma boa inclusão, é necessário que o fragmento esteja completamente desidratado e clarificado.
Figura 10- Ilustração do bloco de parafina com a amostra.
Figura 9 - Ilustração do processo de inclusão. 
Fonte: Google imagens. Fonte: Google imagens.
 
 Para a inclusão existem aparelhos que facilitam esse processo, denominados de aparelhos de inclusão:
	Figura 11- Aparelho de inclusão.
 Fonte: Google imagens.
As centrais de inclusão possuem normalmente duas placas, uma aquecedora para efetuar a inclusão, e outra refrigerada para resfriar os moldes com as amostras incluídas. Essas centrais também possuem um local para aquecimento das pinças que serão utilizadas durante a inclusão. Esses aparelhos facilitam o procedimento da inclusão, principalmente por manterem a mesma temperatura de infiltração em todos os tanques e placas, diminuindo consideravelmente o tempo gasto com a inclusão propriamente dita. 
Outro fato a ser considerado é o uso de cassetes durante o procedimento até a inclusão. Os cassetes de plástico são aconselhados, pois permitem escrever, a lápis, o número de registro do material. Os cassetes também são importantes para a microtomia, pois podem ser adaptados ao micrótomo.
	 
Figura 12 - Cassete de plástico.
 
 Fonte: Google imagens.
O fragmento durante a inclusão é importante para a demonstração correta da morfologia do tecido. Uma orientação incorreta pode resultar no dano do tecido durante a microtomia ou pode levar a que a área de interesse não esteja presente no corte, ao se incluir um fragmento de pele, por exemplo, deve-se considerar a análise de suas estruturas básicas, isto é, a epiderme e a derme. Pequenos fragmentos de tecidos podem ser incluídos paralelamente, enquanto fragmentos alongados são orientados longitudinalmente. 
Assim, os procedimentos para inclusão são:
· Selecionar o molde a ser utilizado de acordo com as dimensões dos fragmentos a serem incluídos de maneira a sobrar cerca de 2 mm de parafina nas margens do bloco;
· Preencher o molde com parafina líquida pré-aquecida; 
· Com o auxílio de uma pinça, selecionar o fragmento, sem deixá-lo esfriar, e colocá-lo no molde preenchido previamente com parafina; 
· Levar o molde com o material incluído para a placa resfriada; 
· Quando o molde começar a “suar” é o momento certo de retirar o bloco do molde. 
3.6 Microtomia
Depois de endurecido, o bloco de parafina deve ser cortado em seções extremamente finas e uniformes, que permitam a visualização do tecido ao microscópio de luz. 1 micrômetro (μm) é igual a 1/1.000 de 1 milímetro (mm). Assim, os cortes dos tecidos, extremamente finos e transparentes, são montadosem lâminas de vidro.
O instrumento capaz de confeccionar cortes com tal precisão é o micrótomo, sendo constituído por três partes: corpo, porta-bloco e porta-objeto. Considera-se, ainda, que em alguns modelos possuem duas manivelas, uma manivela de ajuste e outra de corte. 
Existem dois tipos de micrótomos: do tipo rotatório, também conhecido como do tipo Minot, em que o material, no porta-objeto, vai de encontro com a navalha que está imóvel no porta-navalha; e o do tipo corrediça, que avança o porta-navalha e vai de encontro ao porta-objeto onde se encontra a amostra. Encontram-se para venda no mercado diversos modelos dos dois tipos de micrótomo, podendo ser automáticos ou manuais. 
Muitos micrótomos foram desenvolvidos para confeccionar cortes a partir de blocos de parafina, outros, para realizar cortes congelados, e há ainda aqueles micrótomos específicos para a microscopia eletrônica, chamados ultra micrótomos, capazes de confeccionar cortes ultrafinos (Micrótomo rotativo, criostato e de congelação, etc.).
Também existe uma quantidade enorme de tipo de navalha (de aço, de aço para criostato, descartáveis - platina ou material cromado). As navalhas descartáveis são recomendadas por possuírem custo menor em relação aos de aço, além de dispensarem a utilização de equipamentos, como afiadores automáticos, que são muito caros. 
 
 Figura 13- Micrótomo manual rotativo em ilustração ao processo de microtomia.
 
 Fonte: Google imagens.
Para a realização dos cortes são necessários:
· Micrótomo;
· Banho frio: tina de água fria onde os cortes flutuam, de modo a selecionar o melhor corte e remover as pregas de maior tamanho;
· Banho quente: tina de água quente (cerca de 50 - 55 graus C) onde se vão remover as pregas mais pequenas;
· Lâminas: superfície onde os cortes vão ficar aderidos.
Os procedimentos para a microtomia incluem:
· Fixar o bloco no micrótomo. 
· Colocar o maior eixo do bloco verticalmente ao fio (gume) da navalha. 
· Acertar o bloco para que a sua superfície fique paralela à navalha.
· Colocar no micrótomo uma navalha já utilizada (velha) para desbastar o bloco (retirar o excesso de parafina até se alcançar o material). 
· Aparar o bloco (desbastar). 
· Substituir navalha velha por nova e afiada. 
· Resfriar o bloco para endurecer mais a parafina e umedecer a superfície do tecido. Pode-se utilizar um cubo de gelo, o qual deve ter a superfície lisa para entrar em contato com a superfície do material.  
· Secar a navalha e o bloco com cuidado para não atingir o fio da navalha nem causar ranhuras. 
· Efetuar a microtomia propriamente dita, obtendo os cortes com o auxílio de uma pinça.
· Retirar a fita do micrótomo, com o auxílio da pinça, e transportá-la para o banho-maria, para realizar a distensão dos cortes. A temperatura do banho-maria deve estar em torno de 40oC para que os cortes se distendem sobre a superfície da água, evitando-se a formação de pregas. 
· Coletar o corte com lâmina limpa e adesivada. 
· Transferir a lâmina com o corte para uma placa aquecedora. 
· Levar a lâmina para uma estufa aquecida a 60ºC para retirar o excesso de parafina e melhorar a adesão do corte à lâmina.
3.7 Coloração
Como as seções de parafina são incolores, os espécimes não estão ainda adequados para exame com microscópio de luz. São então corados para possibilitar a análise. A seletividade com que os corantes coram os componentes dos tecidos pode ser maior ou menor. Muitos corantes se comportam como substâncias de caráter ácido ou básico e tendem a formar ligações eletrostáticas (salinas) com componentes ionizados dos tecidos. Os componentes dos tecidos que se coram bem com corantes básicos são chamados de basófilos, e os que têm grande afinidade por corantes ácidos, de acidófilos. 
O azul de toluidina e o azul de metileno são exemplos de corantes básicos. Outros corantes, como a hematoxilina, comportam-se como corantes básicos e se ligam às estruturas basófilas das células e dos tecidos. Os principais componentes dos tecidos que reagem com corantes básicos o fazem por conter ácidos na sua composição - ácidos nucleicos, glicosaminoglicanos e glicoproteínas ácidas. Por outro lado, corantes ácidos (tais como orange G, eosina, fucsina ácida) coram principalmente os componentes acidófilos dos tecidos, como, por exemplo mitocôndrias, grânulos de secreção, proteínas citoplasmáticas e colágeno. 
Dentre todos os corantes, a combinação de hematoxilina e eosina (HE) é a mais comumente utilizada. Assim, a hematoxilina cora de rôxo os ácidos nucleicos dos núcleos e em seguida, os cortes são lavados e corados de rosa pela eosina, que irá corar os componentes básicos predominantes no citoplasma das células. 
Após a coloração, os cortes são protegidos por uma lamínula e podem ser analisados por microscopia.
Figura 14- Coloração HE: Núcleo celular basófilo (rôxo) e citoplasma acidófilo (rosa).
 
 
 Fonte: Marcuzzo (2021).
CONCLUSÃO
Em suma, ao analisar este relatório, pode-se concluir que o processamento histológico é um conjunto de procedimentos técnicos complexos, executado em fases sequenciais, as quais demandam, simultaneamente, a análise dos protocolos e a capacidade de adaptação dos mesmos diante da necessidade de cada amostra, que apresenta particularidade. Logo, sabe-se que cada etapa apresenta relevância para a qualidade da conclusão obtida, para em seguida utilizar a lâmina como objeto de estudo. 
Dessa forma, é fundamental a cautela com os instrumentos utilizados no processo, a dedicação e, consequentemente, a atenção de quem for manuseá-los, além de apresentar zelo no ambiente usado para o processo desejado, visto que a técnica histológica consiste em uma série de etapas com o objetivo de preparar determinado tecido com o fito de analisá-lo no microscópio, adquirindo uma lista de procedimentos essenciais em áreas de pesquisas acadêmicas, como também, em diagnósticos clínicos.
REFERÊNCIAS
BANCROFT, J. D.; STEVENS, A. Teory and Practice of Histological Techniques. 4. ed. Nova York: Churchill Livingstone, 1996.
CAPUTO, L. F. G.; GITIRANA, L. B.; MANSO, P. P. A. Técnicas Histológicas. Disponível em: https://www.epsjv.fiocruz.br/sites/default/files/capitulo_3_vol2.pdf. Acesso em: 25 Abril 2021.
DEPARTAMENTO DE BIOLOXÍA FUNCIONAL E CIENCIAS DA SAÚDE. Universidade de Vigo. Histological techniques: fixation methods. FIXATION METHODS. Disponível em: https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/6-tecnicas/2-metodos-fijacion.php. Acesso em: 25 Abril 2021.
Gehrke, Flávia. Descrição Básica de um Microscópio Óptico. Disponível em: https://dnaeoutrascoisas.wordpress.com/2013/09/02/descricao-basica-de-um-microscopio-optico/. Acesso em: 20 Abril 2021.
GRIMALDI FILHO, G. Manual de técnica histológica. Rio de Janeiro: CME/IOC/ Fiocruz, 1981.
ISHIKIRIAMA, Bella Luna Colombini. Histologia e Seus Métodos de Estudo. Disponível em: https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/5243764/mod_resource/content/1/Aula%202%20-%20histologia%20e%20seus%20m%C3%A9todos%20de%20estudo.pdf. Acesso em: 25 Abril 2021.
JUNQUEIRA C. U.; JUNQUEIRA, L. M. M. S. Técnicas básicas de citologia e histologia. São Paulo: Santos, 1983.
JUNQUEIRA, L. C. U.; CARNEIRO, J. Histologia Básica. 2013.
MARCUZZO, Simone. Técnicas Histológicas. Disponível em: https://professor.ufrgs.br/simonemarcuzzo/files/tecnicas_histologicas_1.pdf. Acesso em: 25 Abril 2021.
MOLINARO, Etelcia Moraes. Conceitos e métodos para a formação de profissionais em laboratórios de saúde: volume 2 / Organização de Etelcia Moraes Molinaro, Luzia Fátima Gonçalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira. - Rio de Janeiro: EPSJV; IOC, 2010. Disponível em: https://www.sbhistotecnologia.bio.br/pdf/trabalhos/1bc9527a3f3f03afc71f64235de55a3c.pdf. Acesso em: 20 Abril 2021. 
PAD (PROGRAMA DE APRIMORAMENTO DISCENTE )(Minas Gerais). Ufmg. Técnicas Histológicas. Disponível em: http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-morf/histologicabasica.htm.Acesso em: 25 Abril 2021.
ROSS, M. H.; PAWLINA, W. R. | Histologia – Texto e Atlas – Correlações com Biologia Celular e Molecular, 7ª edição. Guanabara Koogan, 2016.