AEG por qPCR

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Olá, seja bem-vindo
ao Universo da
Biologia Molecular. 
Eu sou o Eduardo
Castan e hoje eu vou
te ajudar a enxergar
a análise da
expressão gênica
por RT-qPCR sob
outra perspectiva.
Vamos lá
Sobre o autor
QUEM É EDUARDO
CASTAN?
Mestre e doutor em genética com foco em
técnicas de biologia molecular. Por vários anos
trabalhou como especialista de produtos na
maior empresa de ciências da vida do mundo,
atendendo centenas de clientes, incluindo os
maiores laboratórios do Brasil e América Latina.
Atualmente, Eduardo tem como missão ajudar
as pessoas que precisam aprender (ou
aprender mais) sobre biologia molecular.
Por meio do Universo da
Biologia Molecular, lives no
Instagram e aulas no YouTube
ele vem democratizando o
conhecimento sobre essas
técnicas e outros temas que
orbitam a biologia molecular.
O ano é 2048 e a aluna de doutorado está em campo para
fazer as análises de seu experimento de expressão gênica.
Ela precisou viajar de São Paulo às entranhas da floresta
amazônica para encontrar a plantinha que é o alvo
principal de seu experimento.
 
Ao encontrar a planta que procurava, ela tira do bolso um
equipamento menor que um celular e encosta o seu sensor
em uma das folhas da plantinha. Cinco segundos depois, o
aparelho apita, informando que os dados sobre o nível de
expressão de todos os genes daquela planta foram
coletados e analisados corretamente.
 
A doutoranda aperta salvar, coloca o aparelho no bolso e
segue em busca da próxima planta. 
 
O que esse aparelho fez ou o que ele é? Ele nada mais é
do que um tradutor. Um equipamento que tem a
capacidade de traduzir uma informação biológica
(expressão gênica) em uma informação digital (dados
numéricos).
As ferramentas de biologia molecular que utilizamos nos dias de
hoje (PCR em tempo real, por exemplo) fazem exatamente a
mesma coisa. Com a diferença que, entre a obtenção da
informação biológica e a obtenção da informação digital, há uma
série de procedimentos (ex. coleta da amostra, extração de
RNA, síntese de cDNA e a própria qPCR etc.) que,
necessariamente, distorcem os resultados.
 
No entanto, tais distorções podem e devem ser evitadas,
corrigidas ou normalizadas. De tal maneira que, ao final de um
experimento, os resultados obtidos representem de fato o que
estava acontecendo dentro da amostra antes de ela ter sido
coletada.
 
Essa é a sua função como pesquisador e biologista
molecular. Garantir que a tradução tenha sido realizada sem
viés e livre de variáveis.
 
Esse caderno é sobre isso. Sobre como utilizar a PCR em tempo
real como ferramenta de análise de expressão gênica, reduzindo
ao máximo, as variáveis que podem distorcer o processo da
tradução da informação biológica em informação digital.
PÁG. 6 PÁG. 10 PÁG. 12
PÁG. 13 PÁG. 14 PÁG. 17
PÁG. 19 PÁG. 25 PÁG. 28
Índice
A EXPRESSÃO DE
GENES
O FLUXO DE TRABALHO
DA RT-QPCR
COLETA E
ARMAZENAMENTO
EXTRAÇÃO E
PURIFICAÇÃO
CONTROLE DE
QUALIDADE
TRANSCRIÇÃO
REVERSA
PCR EM TEMPO
REAL
ANÁLISE DOS
DADOS
DICAS
Antes de começarmos, vamos dar um passo
para trás
O genoma de um organismo armazena uma
cacetada de informação. Um monte mesmo.
Ali tem informação relacionada à cor de olho
de um indivíduo até a sua predisposição a
desenvolver certas doenças.
 
Essas informações estão armazenadas em
forma de código e em regiões específicas ao
longo do genoma – os genes.
 
No entanto, as informações contidas nos
genes não são recrutadas pelas células o
tempo todo nem na mesma intensidade.
Em outras palavras, os genes são expressos
quando recebem certos estímulos, sob certas
condições (às vezes muito específicas).
A EXPRESSÃO DE GENES
Ao serem recrutados, os genes têm sua informação
transcrita (copiada) a uma molécula de RNA. A
informação transportada por essa molécula de RNA
poderá ser utilizada de alguma maneira - na produção
de uma proteína, por exemplo.
 
Entender a dinâmica de expressão dos genes pode ser
muito interessante e informativo. Por isso, muitas
pesquisas ao redor do mundo têm como objetivo analisar
o nível de expressão gênica em organismos e condições
específicas.
 
Para tais análises, existem as ferramentas de biologia
molecular, como a técnica de microarray, o
sequenciamento de nova geração e a PCR em tempo
real.
A EXPRESSÃO DE GENES
Agora você já entendeu que a
PCR em tempo real nada mais é
que uma ferramenta que traduz
informação biológica, a qual não
conseguimos compreender, em
informação digital - valores
números.
O processo de tradução acontece por
meio de geração de luz, geração de
fluorescência. De um lado entra DNA
(cDNA) e do outro lado sai luz. A luz,
por sua vez, é utilizada para gerar
valores numéricos.
A intensidade da fluorescência
ao longo da qPCR aumenta de
maneira proporcional à
produção de cópias do alvo -
a cada ciclo da reação.
A dinâmica de geração
de fluorescência, por sua
vez, está diretamente
relacionada ao nível de
expressão do gene em
questão.
Coleta da
amostra e
armazenamento
Extração,
purificação e c.
de qualidade
Síntese de cDNA
PCR em tempo
real
Análise de dados
Para que a fluorescência seja gerada ao
longo da qPCR e depois traduzida em
resultados, há uma série de procedimentos
que devem ser realizados - desde a coleta
da amostra até a obtenção do valor
numérico.
O que considerar
na realização de
cada passo para
evitar, diminuir,
corrigir e/ou
normalizar vieses
e variabilidades
que possam vir a
distorcer os
resultados.
COLETA DA AMOSTRA
E ARMAZENAMENTO
Trabalhe com
rapidez.
Armazene a amostra
coletada em
nitrogênio líquido ou
em solução de
preservação.
Alternativamente,
também é possível
seguir
imediatamente para
extração do RNA.
Utilize vidrarias,
plásticos e reagentes
livres de RNase.
Evite degradação do
RNA:
EXTRAÇÃO
E PURIFICAÇÃO
A amostra em si (tecido
vegetal ou animal, líquida
ou sólida, cultivo de células,
cultivo de bactérias etc.).
Seu orçamento. 
A quantidade de RNA
necessário para concluir o
experimento.
Homogeneíze muito bem a
amostra com a solução de
lise.
Utilize a quantidade
adequada de amostra em
relação ao volume de
solução de lise.
Não processe muitas
amostras por vez.
Utilize um kit ou sistema de
purificação compatível com
suas condições e amostra. Ou
seja, leve em consideração:
 
Preferencialmente deve ser realizada por fluorometria, já
que a espectrofotometria (ex. Nanodrop) não tem a
capacidade de discriminar DNA de RNA.
Ou seja, sabendo que todo sistema de purificação não
é 100% eficiente e que, consequentemente, um pouco de
DNA será extraído e purificado junto com o RNA, existe
grandes chances de se superestimar a quantidade de
RNA de uma amostra ao quantificá-la por
espectrofotometria.
Quantidade ideal de RNA: aquela suficiente para você
começar e terminar o experimento, considerando
otimizações, padronizações e repetições de reações.
CONTROLE DE QUALIDADE
QUANTIDADE
Existem algumas maneiras de se verificar o
nível de pureza de uma amostra, ou seja,
verificar o quão livre de proteínas e outros
contaminantes ela está.
No entanto, a espectrofotometria é de longe a
técnica mais fácil, de menor custo e mais
acessível.
Pureza ideal de RNA:
A260/280 = 1,9 a 2,1
A260/230 = 1,5 a 1,8
CONTROLE DE QUALIDADE
PUREZA
Uma amostra de RNA degradado pode ser um grande fator de
distorção da tradução.
O ideal é quantificar o nível de integridade do RNA. Esse tipo de
análise pode ser realizado por meio de equipamentos como o
Bioanalyzer, que utiliza um sistema de pontuação (de 1 a 10) para
quantificar a integridade - o RIN (RNA Integrity Number).
Entre outros fatores, o RIN de uma amostra é calculado pela
integridade e proporção entre os RNAs ribossomais 28S e 18S.
Idealmente, o RIN de uma amostra deve estar acima de 7.
Se não tiver acesso a um Bioanalyzer, vai de eletroforese em gel de
agarose mesmo. Verifique a resolução das bandas referentes aos
rRNAs 28S e 18S e a proporção entre elas – deve ser de 2:1 (28S:18S).
Também existe a possibilidade de quantificar a integridade do RNA
utilizando a própria PCR em tempo real. Clique aqui e veja esse post
quefiz há alguns dias sobre isso.
CONTROLE DE QUALIDADE
INTEGRIDADE
https://www.instagram.com/p/CKeRzhADa-2/?utm_source=ig_web_copy_link
SÍNTESE DE cDNA
A PCR ou a qPCR não funciona ao
utilizar moléculas de RNA como
molde. Por isso, é necessário fazer
uma reação anteriormente à
qPCR chamada transcrição
reversa ou, simplesmente, RT. 
Durante a reação de RT as
moléculas de RNA de uma
amostra serão utilizadas para a
produção de moléculas de DNA.
Esse processo é realizado por uma
DNA polimerase “especial”
chamada transcriptase reversa.
Os produtos da RT, ou seja, as
moléculas de DNA
complementares às moléculas de
RNA, são chamados de cDNA.
O cDNA representa o RNA original
da amostra e pode ser utilizado
como molde na qPCR.
SÍNTESE DE cDNA
Utilizar uma transcriptase
reversa termo estável para
que a reação possa acontecer
em temperaturas mais altas –
o que facilita a ruptura das
estruturas secundárias das
moléculas de RNA.
Utilizar uma transcriptase
reversa com baixa atividade
de RNase H – o que está
associada à processividade da
enzima (capacidade de gerar
fragmentos longos).
Manter a linearidade da
reação: proporção entre a
quantidade de RNA utilizada no
início da reação e a
quantidade de cDNA produzida
no final da reação.
Um bom kit de transcrição reversa
deve:
 
 
PCR em tempo real
Agentes intercalantes – ex.
SYBR Green
Sondas de hidrólise – ex.
Sondas TaqMan
Todos os passos do fluxo de
trabalho mencionados
anteriormente, só existiram para
que pudéssemos chegar aqui.
A qPCR, para análise de expressão
de genes, pode ser realizada por
meio de diferentes sistemas de
detecção, ou seja, por diferentes
“produtores” de luz ou
fluorescência.
Os dois mais conhecidos são:
A principal vantagem dos agentes intercalantes é o preço. Eles são
consideravelmente mais baratos que as sondas de hidrólise.
Sua principal desvantagem é a falta de especificidade, já que essas
moléculas têm afinidade a qualquer DNA dupla fita e não somente
cDNA a ser quantificado.
Justamente por isso, o usuário de intercalantes de DNA precisa
realizar um procedimento ao final de cada corrida de qPCR para
verificar se não houve amplificação inespecífica de DNA – esse
procedimento é chamado de curva de dissociação ou curva de
melting.
A principal vantagem das sondas de hidrólise é a especificidade, já
que as sondas, assim como os primers, são olignucleotídeos
complementares a uma região específica do cDNA (gene) a ser
quantificado.
Sua principal desvantagem é o preço, o que pode inviabilizar a
execução de alguns experimentos.
PCR em tempo real
Verificar a especificidade dos
primers e sondas
Determinar a concentração
ideal de cada conjunto de
primer e sonda
Verificar a eficiência de
amplificação de cada alvo
Ainda falando da qPCR...
 
É fundamental que o pesquisador
faça algumas verificações e
padronizações antes de iniciar o
experimento de fato.
 
1.
2.
3.
Realizar algumas corridas com controle negativo
(água no lugar de cDNA) para verificar se não há
geração de fluorescência. Se houver, pode ser um
indicativo de contaminação ou dímero de primers -
no caso de usuários de agentes intercalantes.
 
Realizar algumas corridas com controle positivo
(amostra sabidamente funcional – que gera
resultado) para verificar se não há fluorescência
inespecífica sendo gerada.
Essa verificação pode ser feita pela curva de
dissociação para usuários de intercalantes de DNA ou
por eletroforese com gel de agarose para usuários de
sondas de hidrólise.
PCR EM TEMPO REAL
VERIFICAR A ESPECIFICIDADE
DOS PRIMERS E SONDAS
100 nM
300 nM
600 nM 
50 nM
100 nM
150 nM 
200 nM
250 nM
Para cada alvo, diferentes concentrações de primers e sonda devem
ser testadas com controles positivos e controles negativos.
A melhor concentração é aquela que gera o menor Cq (amplifica
mais rapidamente ao longo da qPCR) nos controles positivos, sem
formar dímeros nos controles negativos.
Recomendação de concentrações finais a serem testadas para cada
primer na reação:
 
Recomendação de concentrações finais a serem testadas para
sondas na reação:
PCR EM TEMPO REAL
DETERMINAR A CONCENTRAÇÃO IDEAL DE CADA
CONJUNTO DE PRIMER E SONDA
A verificação da eficiência de amplificação de
cada alvo é fundamental para determinar que tipo
de método de análise será utilizado no processo de
quantificação do nível de expressão gênica.
 
Para essa verificação, é necessário realizar a qPCR
de uma diluição seriada para cada um dos alvos.
 
A diluição seriada, por sua vez, pode ser produzida
por meio de amostras controles e cinco (ou mais)
pontos, com diferença de concentração de 10 vezes
entre eles.
PCR EM TEMPO REAL
VERIFICAR A EFICIÊNCIA DE
AMPLIFICAÇÃO DE CADA ALVO
Análise dos dados
Dois pontos
fundamentais em
relação à análise dos
dados:
 
1 – Método de análise
para a quantificação
relativa da expressão
2 – Escolha dos genes
de referência
Com base no teste de eficiência de amplificação
dos alvos, escolha o método de quantificação:
Método do ΔΔ Cq
Mais fácil de fazer, menos custoso, mais fácil de
analisar. Porém, demanda que todos os alvos do
experimento estejam amplificando com eficiências
parecidas de reação (± 10% de variação é
aceitável)
Método da curva padrão relativa,
Compatível com alvos que amplificam com
eficiências diferentes. Porém, é mais trabalhoso,
mais difícil de fazer e de analisar e é mais caro.
ANÁLISE DOS DADOS
MÉTODO DE ANÁLISE PARA A
QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DA EXPRESSÃO
Os genes de referência (controles endógenos) têm a função de corrigir
as pequenas variabilidades experimenteis capazes de causar
deturpações na geração de fluorescência de cada reação. 
Ou seja, corrigir fatores que interferem no processo da tradução da
informação biológica em informação numérica. Por exemplo: erro de
pipetagem, diferentes níveis de degradação e pureza entre as amostras,
variação na eficiência da transcrição reversa etc.
Quase toda pequena variabilidade inserida no experimento pode ser
corrigida por meio dos genes de referência, contanto que:
 
Os genes de referência tenham um nível expressão constante entre todas
as amostras do experimento.
 
Duas observações:
1 – Para calcular a estabilidade do nível de expressão, é necessário
realizar testes com pelo menos 3 candidatos a gene de referência.
2 – Não existe um gene de referência universal. Cada experimento tem
suas condiçõese características específicas.
ANÁLISE DOS DADOS
ESCOLHA DOS GENES DE REFERÊNCIA
Evite utilizar consumíveis de lotes e fornecedores diferentes
ao longo do experimento. Por exemplo, se começou suas
reações utilizando um dado mastermix, tente seguir com a
mesma marca e, de preferência, com o mesmo lote.
Extraia uma quantidade de RNA que seja suficiente para
começar e terminar o experimento.
Evite fazer lotes diferente de cDNA para uma mesma
amostra.
Trate o RNA com DNase.
Faça um negativo da transcrição reversa.
Tente seguir todos os passos do fluxo de trabalho de uma
única vez. Evite fragmentar esses passos ao longo de
muitos meses ou anos.
Mantenha as pipetas sempre calibradas.
Faça triplicatas técnicas.
Não encha o saco do coleguinha. Seja cortês no ambiente
de trabalho.
DICAS EXTRAS PARA PARA VOCÊ UTILIZAR A
qPCR COMO UMA FERRAMENTA ADEQUADA DE
QUANTIFICAÇÃO DE EXPRESSÃO DE GENES
Agora você está munido de
informação e,
consequentemente, mais seguro
para entrar no laboratório.
 
Valeu demais!
SEU CADERNO
ACABA POR AQUI
Eduardo Castan
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auxiliar qualquer profissional que trabalha ou
pretende trabalhar com biologia molecular a
alcançar seus objetivos.
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