Lista I- Tecnicas de avaliação de plantas geneticamente modificadas

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INSTITUTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA 
 
 
 
 
Felesmar Rodrigues de Souza Oliveira 
 
 
 
 
Lista de exercícios – Técnicas de avaliação de 
plantas geneticamente modificadas 
 
 
 
 
Atividade apresentado junto à disciplina de 
biotecnologia Vegetal, ministrada pelo 
Prof. Dr. Michael dos Santos Brito. 
 
 
 
 
 
 
São José dos Campos 
2021 
 
 
1) Observe a figura abaixo, que é o mapa do vetor de expressão pET28a(+). Anote as 
unidades funcionais que você consegue identificar e descreva sua(s) função(ões) para 
a clonagem e/ou expressão da CDS clonada. Observe com bastante atenção a 
sequência mostrada em detalhe. Identifique as unidades discutidas na aula de fusões 
traducionais. Observe as fases de leitura e a existência de outras versões do pET28 -
pET28b(+) e pET28c(+). 
 
 
 Promotor T7 –É um promotor de transcrição 
 BAMH1 e EcoRI- Sítios de clivagem das endonucleases 
 His Tag- Tag de polihistidina é um marcador 
 T7 terminador- É a parte que codifica uma sequência de RNA que permite a 
transcrição eficiente 
 LACI-Codifica a proteina repressora LAC 
 
 
 LACO-Operador lac é um grupo de genes com um único promotor 
 Trombina-Sitio de clivagem para a trombina entre a proteína de interesse e o His-
TAG 
 Operon LAC 
 Ndel e BAMHI- são locais de clonagem 
As unidades de fusão traducionais tem por objetivo adicionar tags e sinais de secreção, 
uma das unidades de o promotor T7 que permite um elevado nível de expressão. As 
fases de leitura bem como as versões de pET28 são resultantes das dinâmicas de 
quebra das ligações pelas endonucleases. 
 
2) Observe a figura abaixo, que é o mapa do vetor de expressão pET SUMO. Anote as 
unidades funcionais que você consegue identificar e descreva sua(s) função(ões) para 
a clonagem e/ou expressão da CDS clonada. Observe com bastante atenção a 
sequência mostrada em detalhe. Identifique as unidades discutidas na aula de fusões 
traducionais. Observe a fase de leitura e a possibilidade de clonar fragmentos de PCR 
com um A nas extremidades 3´, mantendo a fase de leitura correta. 
 
 
 
 
 LACI-Codifica a proteina repressora LAC 
 LACO-Operador lac é um grupo de genes com um único promotor 
 SUMO-Proteína de Fusão 
 RBS-Sitio de ligação do ribossomo 
 KanR-Gene de resistência a Kanamycin 
 T7 reverse priming site-sitio de ligação ao códon de parada da fita complementar 
Conforme descrito na questão anterior,ss unidades de fusão traducionais tem por 
objetivo adicionar tags e sinais de secreção, uma das unidades de o promotor T7 que 
permite um elevado nível de expressão. É observado que é possível clonar fragmentos 
devido ao sitio de clivagem pois as extremidades tem sequencias com sítios de primers 
reversos, gerando assim uma fase de leitura 5´ 3’. 
 
 
3) Comente o papel dos antibióticos na seleção de plantas transgênicas? É possível 
que um vetor possua mais de um gene marcador de seleção? Explique 
 
 Os antibióticos são usados como marcadores para seleção, pois os mesmos são 
adicionados na cultura de células e agem matando as células não transformadas e deixando 
as transformadas vivas, sendo que as células transformadas possuem um gene de resistência 
ao antibiótico. Assim, genes de resistência servem como marcadores para seleção. Sim, o 
vetor pode ter genes repórteres cuja sua expressão gera um fenótipo mensurável que pode 
ser utilizado para distinguir a expressão basal de proteínas endógenas em comparação com 
que possuem o gene repórter e também os genes de resistência a um antibiótico ou de algum 
metabolito que são utilizados como tags, que usadas para seleção de células transformadas. 
 
4) Qual a função de colocar uma planta não transformada também em meio seletivo 
(ex: antibiótico) para validar eventos transgênicos ainda em meio de cultura? 
 
 
É interessante fazer isso para que se assegure que as células foram transformadas 
e que o experimento é valido, pois o mesmo serve como um controle e a morte dessa planta 
no meio seletivo demonstra que a transformação ocorreu de forma satisfatória. 
 
5) Faça uma breve descrição e trace um paralelo indicando quais são os pontos 
positivos e negativos de cada uma das técnicas utilizadas para selecionar um evento 
transgênico: 
 
• Expressão do gene repórter 
 Esses genes estão envolvidos com eventos de gradientes de transdução e 
expressão genica, o mesmo tem inúmeras vantagens como sua grande eficiência no estudo 
em plantas e bactérias, como o gene Gus que é utilizado para estudar eventos de simbiose. 
Essa técnica também é que a sua inserção é instável e tem uma grande sensibilidade, 
aumentando a sua precisão e na identificação de padrões característicos possibilitando 
identificar a atividade de um gene especifico. Em contrapartida, essas técnicas tem um alto 
nível de complexidade conforme o grau de sensibilidade que se deseja alcançar e a 
utilização dessa técnica pode gerar mutações inviabilizando o estudo. 
 
• Análise da progênie em meio seletivo 
Essa análise traz informações importantes, tais como o quanto a progênie expressa 
a característica escolhida, quais as vantagens essa progênie tem em relação as plantas 
controle, media de produtividade entre outros. Em contrapartida, existirá pouca variabilidade 
genética, pois os novos indivíduos serão clones, é importante observar se o número de 
plantas que forem restauradas foi satisfatório, a fim de se obter um número ideal de plantas. 
 
• PCR 
 O PCR tem uma grande sensibilidade e reprodutibilidade, sendo que o limite de 
detecção do PCR está em uma faixa muito grande, podendo detectar traços. A técnica 
amplifica o DNA amostral exponencialmente, assim falhas podem ocorrer nos processos de 
amplificação devido a problemas nos primers, nos plasmídeos e na extração do DNA 
podendo tornar o processo ineficiente e por fim essa técnica é cara. 
 
• Análises de Southern blot 
 A técnica é utilizada para verificar se sequencias de DNA estão presentes em uma 
amostra analisada que pode ser utilizada para verificar se a sequência do gene está contida 
na amostra e quantificar a abundancia do DNA, dependendo da enzima utilizada no teste é 
possível identificar diferentes eventos de transformação e estimar quantas copias do 
transgene foi inserido no genoma da planta produzida. As desvantagens estão no processo 
de extração do DNA que podem interferir na qualidade do resultado e nas técnicas 
associadas a mesma, como o PCR que é uma técnica cara. 
 
6) Pensando em uma análise de PCR ou Southern Blot, em qual parte do vetor devem 
ser usados como molde para desenhar os primers ou a sonda e por que? 
Os primers são fitas simples de DNA que se ligam por meio de pareamento de bases 
complementares, assim para se desenhar o primer deve-se levar em consideração as 
regiões de clivagem das endonucleases (tais como Bamh1 e Hindiii) para que a sequência 
de DNA seja incorporada pelo vetor de forma satisfatória. As sondas são cadeias simples 
 
 
de DNA marcadas com um radioisótopo ou biotina, as mesmas devem ser desenvolvidas 
pensando na sequência alvo, pois a mesma deve ser complementar a essa sequência. 
 
7) Qual a necessidade de se verificar um determinado fenótipo em mais de um evento 
transgênico? Explique 
 É importante verificar para confirmar a presença do gene, posição no genoma e o 
número de copias inseridas, níveis de expressão e dinâmicas de regulação, etc. Essas 
informações são importantes para melhorar a técnica e melhorar a qualidade das plantas 
transformadas. 
 
8) Qual a necessidade de se avançar em mais de uma geração (T1, T2, etc) para 
confirmar a estabilidade de um transgênico? 
 A estabilidade genética está relacionada a capacidade de um organismo de se 
reproduzir ou se modificar sem grandes alterações, ou seja, essas informações demonstram 
que o transgênico alcançou uma estabilidade na expressão do gene inserido, onde com o 
avançodas gerações o nível de expressão ficara constante. 
 
9) Faça uma breve descrição e trace um paralelo indicando quais são os pontos 
positivos e negativos de cada uma das técnicas utilizadas para avaliar a eficiência de 
expressão do seu transgene: 
 
• Northern blot 
 Essa técnica é utilizada para mensurar a expressão genica de um mRNA especifico 
e o quantificar. Essa técnica pode mostrar o nível se o gene está sendo expresso e 
quantificar a sua expressão, além de poder identificar fatores que influenciam na regulação 
e o mesmo tem alta especificidade. Essa técnica tem inúmeras desvantagens como a 
degradação da amostra pelas RNases e os produtos usados na técnica podem gerar um 
risco para o pesquisador e a técnica tem baixa sensibilidade comparada a outras técnicas. 
Assim é interessante utilizar essa técnica como uma metodologia complementar para 
corroborar a identificação do expressão do gene inserido. 
 
 • Western blot 
 É uma técnica para detecção de proteínas em uma amostra de homogenato de tecidos 
biológicos ou estratos. Essa técnica separa as proteínas com base no seu peso molecular 
através de uma corrida de eletroforese. Essa técnica tem alta sensibilidade e especificidade, 
podendo identificar níveis baixos da proteína alvo, sendo possível identificar o perfil de 
reconhecimento do antígeno e determinar quais proteínas são imunodominantes. Também é 
possível inferir dinâmicas de expressão com base na intensidade das bandas. Como 
desvantagem a técnica tem um custo médio a elevado dependendo de uma série de fatores, 
a metodologia é longa e é propensa a erros experimentais e na hora da revelação pode 
ocorrer problemas de biossegurança, sendo uma boa técnica complementar para corroborar 
resultados afirmativos de outros testes. 
 
• ELISA 
 Elisa são uma serie de imunoensaios que permitem a detecção de anticorpos 
específicos com a molécula alvo. O mesmo relativamente baratos e são aplicados para 
detectar proteínas especificas e também é possível quantifica-las e tem um bom limite de 
detecção. Essa metodologia não é eficiente quando a amostra utilizada é a advinda de partes 
 
 
da planta onde a proteína tem menor taxa de expressão e o tratamento utilizado para o 
preparo da amostra também podem degradar parcialmente ou totalmente a estrutura da 
proteína prejudicando a qualidade do ensaio. 
 
• RT-PCR 
 A técnica é análoga ao PCR, porem utiliza a transcriptase reversa para transformar o 
RNA em cDNA, podendo assim mensurar a produção do RNA especifico. Essa metodologia 
pode ser aplicada para identificar se uma proteína alvo foi expressa e servir para inferir se a 
dinâmica de expressão está estabilizada. A técnica tem já é bem consolidada e tem um bom 
nível de sensibilidade e reprodutibilidade e tem um baixo custo em relação a outras técnicas 
e em contra partida pode ocorrer problemas no desenho dos primers e também na 
metodologia de preparo das amostras. É uma técnica interessante que pode dar indícios se 
a transformação do organismo surgiu de forma satisfatória, mas sempre usando outras 
técnicas para corroborar esse resultado. 
 
• Real-time RT PCR 
 Essa técnica tem uma metodologia análoga, porem o processo ocorre de forma 
simultânea, sendo uma tecnologia mais cara em comparação com mais demais, tem uma 
boa sensibilidade, sendo ideal para atestar de se os eventos de transgenia ocorreram de 
forma satisfatória. Como a mesma é técnica mais cara e ainda não é bem difundida em 
comparação com as técnicas anteriores, os protocolos ainda não estão bem difundidos e as 
suas aplicações ainda não chegaram ai seu ápice, sendo interessante adotar essa 
metodologia para atestar de forma rápida se a transgenia ocorreu de forma satisfatória e 
assim traçar estratégias melhores para melhorar os protocolos e produzir clones com maior 
eficiência e qualidade. 
 
10) Observe a figura abaixo, que é o um gel contendo diferentes amostras de DNA 
marcadas com uma sonda radioativa. Com base nisto responda às seguintes 
questões: 
Qual o nome deste experimento? 
 Como são amostras de DNA constata-se que o mesmo é um Southern blot. 
Qual a utilização deste experimento? 
O experimento é usado para identificar uma sequência-alvo de DNA. 
O que corresponde as diferentes marcações nas canaletas de 3 a 10? 
 As marcações indicam diferentes eventos transgênicos, onde se observa diferenças 
nas bandas indica onde a amostra de DNA foi clivada, indicando trechos que a sequência 
procurada está ou não presente. 
Porque as marcações nas canaletas de 3-10 possuem diferentes tamanhos? 
 As marcações indicam o tamanho da banda que pode ser determinado com base na 
escala indicado no Lane 1 que mostra quantos pares de base tem no fragmento de DNA 
daquela marcação e a intensidade da banda indica a concentração de fragmentos de DNA, 
onde quanto maior a intensidade maior será a concentração de fragmentos DNA. 
 
 
 
11) Abaixo é possível visualizar um mapa de restrição no cassete de expressão. Para 
determinação do número de cópias, qual enzima é a mais adequada e por quê? 
 
A enzima mais adequada é a EcoRI pois a mesma é amplamente usada em técnicas de 
genética molecular e a mesma gera extremidades coesivas que tornam os fragmentos com 
o gene alvo ideais para que os mesmo se liguem posteriormente e sejam inseridos de forma 
adequada ao vetor. Entretanto, dependendo das condições do meio, a enzima pode 
apresentar corte não específicos, assim deve ser analisado se e possível manter as 
condições ideais para que a mesma funcione de forma esperada. 
 
12) Em um Southern ou Northern blot, através de qual tipo de ligação química a 
sonda complementar se liga ao ácido nucléico? 
 A hibridização se baseia na capacidade das moléculas de estabelecer ligações de 
hidrogênio entre a sonda e a fita de DNA simples, se e somente se as sequencias forem 
complementares.