Virologia_ Replicação do DNA viral

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Rep����ção d� D�A vi���
- Genoma de DNA tem que ser replicado para fazer a nova progênie viral
- + DNA: Parvovirus
- +- DNA: Hepatitis B virus (gapped)
- +- DNA: Adenovirus, Herpes simplex virus, Polyoma and Papillomaviruses
- Regras universais:
- O DNA sintetizado usa um template para incorporação direta de
dNMPs
- O DNA é sempre sintetizado no sentido 5’-3’ com replicação
semiconservativa
- A replicação se inicia em sítios específicos chamados de origem de
replicação
- A replicação é catalizada por DNA polimerase dependente de DNA e
proteínas acessórias
- Pode ser dependente de primer ou independente de primer
- Papel do hospedeiro:
- A replicação do DNA viral geralmente requer a síntese de no
mínimo uma proteína do vírus, algumas vezes necessita de mais
de uma
- Vírus simples geralmente usam as proteínas do hospedeiro (tem
genomas pequenos)
- Vírus complexos codificam todas as proteínas necessárias para
síntese do DNA - ex: vírus da varíola
- De onde vem a polimerase?
- vírus com DNAs pequenos não codificam o sistema de replicação
inteiro
- codificam proteínas que orquestram a maquinaria de replicação
do hospedeiro
- Papillomaviridae, Polyomaviridae, Parvoviridae
- Vírus de DNA grande geramente codificam todo o sistema de
replicação
- Herpesviridae, Adenoviridae, Poxviridae
- Proteínas virais envolvidas na replicação do DNA
- DNA polimerase e proteínas acessórias
- Proteínas que se ligam a origem de replicação, helicases
- Exonucleases
- Enzimas do metabolismo de ácidos nucleicos
- A replicação de DNA viral geralmente tem um “delay” depois da
infecção porque requer a síntese de no mínimo uma proteína viral
Existe uma diversidade de estruturas de DNA virais
- DNA simples fita, dna circular, DNA dupla fita covalentemente ligado nas
pontas
Lições ����n�i��s ��� o v���� Sim��� 40
- Origem de replicação -> se liga ao antígeno T (Large T, LT)
- região rica em AT e com palíndromos imperfeitos
- reconhecimento da origem de replicação pelo LT é o primeiro passo da
síntese do DNA
- quando se liga ao ATP, a LT forma um hexamero duplo na origem e
leva a distorções na sequência abrindo as fitas (atividade de helicase)
- Rp-A (cellular replication protein) se liga a fitas simples de DNA
(protegendo contra degradação)
- A maioria das origens de replicação são ricas em AT e são
próximas as sequências regulatórias
- LT
- específico entre espécies
- assegura que os componentes necessários para a síntese do
DNA estejam disponíveis na célula hospedeira -> se liga e
sequestra proteínas celulares específicas
- perturba mecanismos que controlam a proliferação
celular e podem induzir a célula infectada a entrar na
fase S
- regula sua própria síntese
- Síntese da fita leading
- Uma primase sintetiza os primers de RNA da fita leading e a DNA
polimerase alfa estende esse primer produzindo pequenos fragmentos;
a extremidade 3’ desses fragmentos de DNA são ligados ao fator C,
Pcna e DNA polimerase e (há o aumento da processividade)
- Síntese da fita lagging
- o primeiro fragmento da Okazaki da fita lagging é sintetizado pela DNA
polimerase alfa-primase
- requer a formação de vários primers em diferentes sítios
- Terminação e resolução
- necessita das topoisomerases I e II que alteram a topologia do DNA ->
removem os supercoils
- topoisomerase I associada a LT é necessária para a progressão da
replicação do SV 40 e para a reproução viral
- Replicação dos templates de cromatina
- O genoma SV40 é associada com nucleossomos celulares tanto na
partícula viral quanto no núcleo da célula infectada
- novos nucleossomos são depositados na fita nascente já na forquilha
de replicação
Rep����ção d� �u���s ���om�� �� D�A vi����
- Síntese dos primers de RNA
- DNA polimerase alfa primase (celular) sintetiza todos os primers
necessários para a replicação de ambos os templates do genoma do
polyomavirus
- Um mecanismo similar opera em papillomavirus e alguns herpesvirus
- Os primers de RNA também podem ser sintetizados por proteínas
virais
- Utilização de primers de DNA
- Acontece em Parvovírus
- Utilização de estruturas especializadas do genoma viral como
primer -> inverted terminal repetitions (ITRs)
- DNA genômico está em ambas as polaridades, porém ambas as fitas
estão em partículas virais separadas
- Sequências palindrômicas dos 125 nucleotídeos centrais pareiam para
formar uma estrutura T.
- A formação dessa estrutura na extremidade 3’ da fita simples do DNA
gera um template/primer ideal para a iniciação da síntese do DNA
- Após o reconhecimento da extremidade 3’OH livre do primer viral, o
template pode ser copiado por um mecanismo contínuo análogo ao da
fita leading
- Requer DNA polimerase omega, Rf-C, Pcna mas não requer a DNA
polimerase alfa primase.
- Um mecanismo especializado é necessário para completar a
replicação, já que a fita parental e a fita nascente ficam
covalentemente conectadas devido ao grampo de DNA usado como
primer
- A cópia completa é iniciada cortando-se o intermediário ligado
ao DNA parental em um sítio específico
- A nova extremidade 3’OH liberada dessa maneira e então é
possível continuar a síntese do DNA
- Esse corte é introduzido por proteínas Rep 78 e Rep 68
- são sítio e fita específicas (tem ação de endonucleases)
- durante o término do processo, Rep 78/68 permanece
covalentemente ligada ao DNA clivado no sítio que se
tornará a extremidade 5’ da molécula completamente
replicada e simples fita
- Alguns genomas de DNA simples fita não são replicados dessa
maneira, mas pelo mecanismo de rolamento do círculo
- utilizam também um auto primer
- Utilização de primer de proteínas
- mecanismo relativamente raro
- Presente em adenovirus
- O final 5’ da fita de DNA é covalentemente ligado a uma
proteína terminal (TP) -> o precursor dessa proteína (Pre-TP)
serve como primer para a síntese do DNA viral
- A DNA polimerase adenoviral covalentemente liga o grupo
alfa-fosforil do dCMP ao grupo hidroxil de um resíduo específico
de serina no Pre- TP
- O grupo 3’-OH da proteína ligada ao dCMP é então utilizado
como primer para a fita nascente
- Após a incorporação dos primeiros nucleotídeos, a DNA
polimerase se desassocia do Pre-TP permitindo o crescimento
da fita de DNA nascente
- O nucleotídeo é direcionado a Pre-TP apenas quando essa
proteína está ligada a DNA polimerase no complexo de
pré-iniciação na origem de replicação
- Como a origem está na extremidade do genoma linear, cada fita
template é copiada continuamente de uma ponta a outra.
Do�s ���an����s �e �ín�e�� d� ��D�A
- Replication folk
- síntese ocorre em ambas as fitas
- em uma fita a síntese é contínua, na outra não
- forquilha de replicação
- primers de RNA
- Papillomavirus, Polyomavirus, Herpesvirus, Retroviral proviruses
- Strand displacement
- usa primer de DNA ou proteína
- há a copia de apenas uma das fitas
- Adenovírus (proteina), Parvovírus (, Poxviruses
Problema da extremidade 5’:
- Quando os primers de RNA são retirados, os espaços ocupados por eles são
preenchidos pela DNA polimerase. Entretanto, para ocupar o lugar do
primeiro primer que é colocado na extremidade 5’, a DNA polimerase teria
que sintetizar no sentido 3’->5’ o que não acontece.
Síntese semi-descontinua de uma origem bidirecional
- Fita Leading e fita Lagging
- Não existe o problema da extremidade 5’ já que o DNA é circular
- LT se ligam na origem de replicação e começam a denaturar as fitas de DNA
e recrutar proteínas que se ligam a LT (Rp-A)
- Rp-A interage com o DNA simples fita
- T é um ligante específico de espécies
- forma o complexo de pré-iniciação
- se liga e sequestra reguladores de ciclo celular -> faz com que a célula
entre em fase S
- Pol-alfa Primase se liga a Rp-A e LT e sintetiza os primers de RNA e sintetiza
pequenos fragmentos de DNA
- Pol-y faz a síntese de DNA longo
- Rf-C se liga a 3’OH
- causa o desgrude da pol-alfa
Topoisomerases
- faz o relaxamento dos supercoils -> diminui a tensão gerada pela forquilha de
replicação
- topoisomerase II: relaxa os circulos
DNA priming: Parvoviruses- rep ORF (codifica proteínas necessárias para a replicação do DNA) e cap
ORF (codifica proteínas necessárias para o capsídeo)
- replica o genoma através de um primer de DNA
- replicação é contínua
- Não existe pol alfa, usa ITR para primer
- DNA polimerase delta corrige os buracos do DNA
- Rep 78/68: necessário para começar e terminar a replicação - endonuclease,
helicase, se liga a extremidade 5’
- tem atividade enzimática
- Também não existe o problema da extremidade 5’
Adenovírus - primer de proteína
- tem origens de replicação em ambas as extremidades de DNA
- pTP-C pareia com o DNA viral - primer para a síntese do DNA
- DBP se liga na fita simples e a outra fita é sintetizada
Herpes simplex virus
- tem três origens de replicação
- DNA é convertido para uma molécula circular
- proteínas do hospedeiro são responsáveis pela circularização do
genoma
- Replicação ao longo do círculo
- É introduzido um “Nick” e a fita vai sendo sintetizada ao longo do círculo
- São sintetizados vários genomas concatenados (concatâmero)
Poxvirus
- esse vírus se replica no citoplasma
- codifica todas as proteínas necessárias para a replicação
- no mínimo 15 proteínas virais envolvidas na síntese do DNA
- codifica inclusive a DNA polimerase
Origens de replicação virais
- regmentos ricos em AT que são reconhecidos por proteínas
- ponto de montagem para a maquinaria de replicação
- podem existir de 1 a 3 origens de replicação
Pro��ína� ��r�i� ��� re���h��e� �s ��i��n� �� re���c�ção
- Polyomavirus T se liga especificamente ao DNA
- Parvovírus Rep 68/78 se liga as extremidades do DNA e ao DNA
desenrolado
- Adenovírus pTP se liga e recruta DNA pol
- Herpesvirus UL9 recruta proteínas virais para a origem de replicação rica
em AT e então ao DNA desenrolado
Reg���ção d� �ín�e�� d� D�A
- a maioria das células não se dividem ou se dividem raramente
- vírus não se replicam em células quiescentes
- vírus tem que induzir a replicação no hospedeiro para conseguir se
replicar
- Proteína Rb controla a entrada em S
- Perda de Rb está associada a tumores = gene supressor de tumor
- O recrutamento de RB por enzimas que controlam a transcrição do
genoma viral retira essa proteína do controle da regulação do ciclo
celular -> necessárias para a síntese de DNA e para transpor o ciclo
celular
- LT também se liga a Rb
- Os vírus de genoma pequeno, que não codificam todas as proteínas
necessárias para sua replicação, tem que codificar uma proteína que se
ligue a Rb e a desloque de sua função normal