Diagnóstico citogenético

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Fernanda Carvalho, 4º semestre - TUT 04 1 Genética 
Diagnóstico citogenético 
 
OBJETIVOS: 
1. Demonstrar a importância do 
conhecimento das anormalidades 
cromossômicas; 
2. Capacitar o estudante a reconhecer e 
avaliar as características dos 
cromossomos e dos cariótipos. 
 
DEFINIÇÃO: 
o A citogenética foi definida a partir dos 
estudos de Tijo e Levan (1956), que 
desenvolveram técnicas efetivas para a 
análise cromossômica e estabeleceram o 
número cromossômico humano normal 
igual a 46; 
o Citogenética é o estudo, em microscópio 
óptico, dos cromossomos e suas 
variações, tanto de número quanto de 
estrutura; 
o É atualmente considerada uma pesquisa 
biológica importante em todas as áreas 
da genética clínica e molecular. 
 
CARIÓTIPO HUMANO: 
o O cariótipo é o complemento 
cromossômico característico de cada 
espécie (número e morfologia); 
o O cariótipo é a organização dos 
cromossomos de uma determinada 
espécie considerando o tamanho e a 
morfologia dos cromossomos (ordem 
decrescente de tamanho). 
 
 
Cromossomos humanos são frequentemente 
classificados em três tipos que podem ser 
facilmente distinguidos na metáfase, pela 
posição do centrômero, a constrição primária 
visível na metáfase: cromossomos 
metacêntricos, com um centrômero mais ou 
menos central e braços aproximadamente 
do mesmo tamanho; cromossomos 
submetacêntricos, com o centrômero 
deslocado do centro e braços com 
tamanhos claramente diferentes; e 
cromossomos acrocêntricos, com o 
centrômero próximo a uma das 
extremidades. Um quarto tipo potencial de 
cromossomo, o telocêntrico, com o 
centrômero numa extremidade e apenas um 
único braço, não ocorre no cariótipo humano 
normal, mas é ocasionalmente observado em 
rearranjos cromossômicos. 
 
É preciso lembrar que os cromossomos nada 
mais são do que DNA compactado. Mas, 
sendo assim, fica a pergunta: 
P: Então, já que cromossomo é DNA, por que 
não usa o próprio DNA para fazer essas 
técnicas? 
R: É porque, a nível microscópio, o que vai 
conseguir enxergar é aquilo está mais 
condensado/eletrodenso. Isso vale não só 
para cromossomo, mas também para 
qualquer estrutura: aquilo que está mais 
denso/espesso se torna mais fácil de 
visualizar. Então, no microscópio óptico não é 
possível visualizar o DNA que não está 
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condensado (como na figura 1 da imagem 
anterior, por exemplo), mas a partir do 
momento em que essas estruturas vão se 
compactando, a sua visualização vai se 
tornando mais possível. Então, os 
cromossomos condensados são 
extremamente úteis para diagnóstico, e esses 
cromossomos condensados são os 
metafásicos/cromossomos em metáfase 
(cromossomos no seu maior nível de 
compactação). E é por isso que as técnicas 
de cariotipagem vão bloquear a mitose no 
momento em que as células estiverem 
exatamente na fase de metáfase, e aí o 
cromossomo bem condensando vai ser 
utilizado para que seja possível desenvolver as 
técnicas moleculares. 
 
PADRÕES DE BANDEAMENTO: 
o Tratamento dos cromossomos envolvendo 
desidratação,envelhecimento,desnatura
ção ou digestão enzimática seguida da 
incorporação do corante DNA-específico. 
Esse corante pode ser vinculado a um 
fluorocromo ou não; 
o Formação de bandas claras, escuras ou 
coloridas. Cada banda geralmente tem 
uma estrutura que abriga o gene, e essa 
estrutura é chamada de locus gênico. A 
depender da técnica, essas bandas 
podem ser coloridas ou em preto e 
branco. 
 
 
O cariótipo mostrado anteriormente é de um 
indivíduo do sexo masculino, normal, com 46 
cromossomos. Mas como saber que esse 
indivíduo de fato é normal (não possui 
cromossomopatias)? 
Existe atualmente um sistema internacional 
que classifica isso. Nesse sistema terá os 
cromossomos para serem comparados com 
os da pessoa analisada, através das bandas 
cromossômicas, da sua posição, de onde 
está localizado o centrômero, etc., como 
mostrado na figura abaixo: 
 
 
COMO ESSAS TÉCNICAS SÃO FEITAS: 
 
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Esse bandemamento é chamado de 
bandeamento G justamente por causa do 
corante pelo qual é corado: Gliemsa. 
 
Os 24 tipos de cromossomos encontrados no 
genoma humano podem ser rapidamente 
identificados, em nível citológico, através de 
procedimentos específicos de coloração. O 
mais comum desses, o bandeamento Giemsa 
(bandeamento G), foi desenvolvido no início 
da década de 1970 e foi a primeira 
ferramenta analítica do genoma completo 
utilizada amplamente para pesquisa e 
diagnóstico clínico. Este tem sido o padrão‑
ouro para detecção e caracterização de 
anormalidades genômicas estruturais e 
numéricas em amostras no diagnóstico 
clínico de distúrbios constitucionais (pós e pré-
natal) e adquiridos (câncer). 
Hoje, já existe um padrão de bandeamento 
mais automatizado, o que ajuda bastante 
para se fazer um bom diagnóstico: 
 
 
 
 
INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA E CÂNCER: 
O câncer como sendo também uma doença 
genética, a qual possui um componente 
molecular importante, possui a sua 
verificação genética de suma importância, 
até mesmo para saber qual o problema que 
está gerando aquele tumor no paciente. E 
essas variações genéticas podem se basear 
na pesquisa de mutações, as quais podem 
ocorrer nos genes de supressores tumorais e 
nos oncogenes, e também pode ser realizada 
uma análise a nível de cromossomo, uma vez 
que em alguns casos de câncer o paciente 
vai ter problemas relacionados à 
translocação, instabilidade cromossômica. 
Em alguns casos de câncer os cromossomos 
possuem uma tendência aumentada a sofrer 
quebras, e essas quebras podem estar 
diretamente relacionadas a processos 
carcinogênicos. Essas quebras/instabilidades 
cromossômicas podem ser avaliadas por 
essas técnicas de bandeamento e 
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posteriormente isso pode ser relacionado aos 
casos de câncer. 
 
CITOGENÉTICA MOLECULAR: 
 Técnica que utiliza citogenética com 
biologia molecular: 
o FISH (hibridação in situ por fluorescência). 
 Sondas pontuais; 
 Sondas painting. 
o SKY (cariótipo espectral); 
o aCGH (hibridação genômica 
comparativa array). 
 Alterações cromossômicas 10-100X 
menores. 
FISH: Hibridização por fluorescência in situ: 
 Quando uma molécula se liga a outra. 
Quando duas moléculas de DNA 
complementares de DNA interagem, haverá 
a hibridização (estabelecimento de pontes 
de hidrogênio entre essas moléculas). A 
hibridização, então, faz com que bases 
nitrogenadas de estruturas e sequências 
diferentes (uma do DNA da pessoa e outra 
artificial) se juntem. 
No FISH é utilizada a fluorescência, para que 
quando essa hibridização aconteça, seja 
possível um sinal fluorescente capaz de ser 
detectado por algum equipamento. A 
hibridização pode ser específica (em uma 
determinada região), mas também pode ser 
no cromossomo todo. 
 
 
Nessas imagens percebe-se que na primeira 
ilustração a hibridização está ocorrendo em 
uma região específica, já na segunda 
ilustração, o cromossomo está todo pintado 
(todos os cromossomos autossômicos estão 
de azul, os sexuais de verde e o Y de 
vermelho). Isso porque havia uma suspeita de 
uma síndrome associada a esse cromossomo 
sexual -> síndrome de Klinefelter (47, XXY). Se 
o indivíduo fosse normal do sexo feminino, 
esse cromossomo corado em vermelho não 
deveria aparecer, já se fosse normal do sexo 
masculino, o vermelho apareceria, porém 
apenas um verdeteria que aparecer, não 
dois. 
 
Na figura acima está sendo avaliado 
especificamente o cromossomo 3. 
 
Na imagem acima está havendo uma troca 
de pedaços entre si, então percebe-se uma 
translocação. 
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Essas translocações são vistas não só em 
síndromes ou cromossomopatias, mas 
também em câncer. A translocação 9;22, por 
exemplo, está associada com a leucemia. 
Esse é um caso de leucemia mieloide crônica. 
O bandeamento cromossômico de alta 
resolução direcionado foi amplamente 
substituído no início da década de 1990 pela 
hibridização in situ por fluorescência (FISH, do 
inglês, fluorescence in situ hybridization), um 
método para detectar a presença ou 
ausência de uma determinada sequência de 
DNA, ou avaliar o número ou a organização 
de um cromossomo ou região cromossômica, 
in situ (literalmente, “no local”) na célula. 
Embora a tecnologia da FISH forneça 
resolução e especificidade muito maiores do 
que a análise por bandeamento G, ela não 
permite a análise eficiente do genoma inteiro, 
e, assim, sua utilização é limitada pela 
necessidade de um alvo específico com base 
numa região genômica suspeita em um 
diagnóstico clínico. 
 
SKY: 
 
A técnica de FISHER possui algumas limitações 
no sentido de quantidade de fluorósforos que 
se pode utilizar, sobretudo no sentido de 
identificação de alterações de menores 
escalas, por exemplo. Quando as alterações 
acometem sequências bem curtas de 
material genético, o FISHER já não é tão 
capaz de identificar. Sendo assim, para 
substituir a técnica de FISHER nesses casos, 
existe a técnica SKY (cariótipo espectral), em 
que tem ondas específicas para todos os 
cromossomos do cariótipo humano, além de 
ser uma técnica mais sensível, sendo capaz 
de identificar alterações em menor escala. 
 
A imagem acima demonstra uma 
cariotipagem usando SKY em célula Hela 
(célula de tumor). E podem ser observadas 
muitas alterações nesses cromossomos 
graças a essa cariotipagem espectral. 
 
Essa imagem mostra um pouco da diferença 
das técnicas mais clássicas, as quais coram 
somente o centrômero e a da SKY, a qual 
possui todo o cromossomo corado e, 
consequentemente, o seu perfil diagnóstico 
será melhor, uma vez que as cores auxiliam 
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muito na identificação das mutações, 
alterações a nível cromossômico. Na técnica 
de bandeamento convencional essas 
translocações não são visíveis, já quando os 
cromossomos são todos tingidos pelas suas 
características será possível encontrar com 
mais facilidade, onde quer que ele ou o seu 
pedaço esteja. Logo, o poder de detecção 
da SKY é superior a todas as outras que foram 
vistas até agora. 
aCGH: 
Hoje, uma das técnicas que possui um dos 
maiores perfis de sensibilidade na área de 
genética é a técnica de CGH, que é a 
hibridização genômica comparativa. Nessa 
técnica o que se faz é comparar o DNA de 
uma célula normal (que não tem nenhum 
problema genético) com o DNA da célula do 
paciente. Esses dois DNAs são misturados e 
depositados em uma placa (essa mistura 
gera uma hibridização). Depois de um tempo 
vai ser possível observar na placa a presença 
de cores distintas em cada um desses 
“poços”, dentro desses poços terão cores 
quentes, frias (essas cores podem variar); 
essas cores podem indicar deleção, 
duplicação ou nenhuma mudança (no caso 
de não haver nenhuma mudança, nesse 
ponto o DNA é normal). O que vai ser 
analisado é o DNA atípico. 
Doenças como esquizofrenia, autismo, alguns 
casos de câncer, não serão possíveis de 
identificar por FISHER, SKY ou bandeamento, 
mas como o CGH possui uma sensibilidade 
muito maior que todas essas técnicas, 
consegue identificar essas alterações bem 
pequenas, em uma escala mais molecular, 
menor do que as anteriores, além de 
conseguir identificar todos os outros 
problemas que as outras técnicas identificam 
também. Sendo assim, CGH é a técnica mais 
completa. Porém é sempre bom avaliar o 
custo benefício, ver o que é melhor para 
cada caso. O custo para essa técnica é bem 
mais alto do que as outras, até porque os 
profissionais que irão mexer nesses 
equipamentos precisam ser altamente 
capacitados, além do maquinário e etc.