quimica PERITO aula 20

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Aula 20
Química p/ Polícia Federal (Perito
Criminal - Área 14 - Farmácia) 2021
Pré-Edital
Autores:
Diego Souza, Equipe Diego Souza
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Aula 20
14 de Março de 2021
00010280146 - WILLIAM CARRARA DA SILVA
 
 
 
 
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Sumário 
Métodos cromatográficos (parte 2) .............................................................................................................. 3 
1 – Considerações Iniciais .......................................................................................................................... 3 
2 – Visão geral da cromatografia gasosa ................................................................................................... 3 
2.1 – Colunas para cromatografia gasosa .............................................................................................. 5 
2.2 – Forno - Programação de temperatura do método ........................................................................ 7 
2.3 – Gás de arraste ............................................................................................................................. 10 
2.4 – Injetor e tipos de injeção de amostra .......................................................................................... 11 
2.5 – Detectores .................................................................................................................................. 15 
2.5.1 – Detector por condutividade térmica (DCT ou TCD) .................................................................. 16 
2.5.2 – Detector de ionização de chama (DIC ou FID) .......................................................................... 17 
2.5.3 – Detector de captura de elétrons (DCE e ECD) .......................................................................... 18 
2.5.4 – Detector por espectrometria de massa .................................................................................... 18 
3 – Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC) .................................................................. 20 
3.1 – Coluna para CLAE ....................................................................................................................... 23 
3.2 – Fase normal e fase reversa .......................................................................................................... 26 
3.3 – Tipos de eluição .......................................................................................................................... 31 
3.4 – Detectores para CLAE ou HPLC .................................................................................................. 34 
3.4.1 – Detectores espectrofotométricos ............................................................................................ 35 
3.4.2 – Detector por espalhamento de luz ........................................................................................... 37 
3.4.3 – Detectores por índice de refração ............................................................................................ 37 
3.4.4 – Detector eletroquímico ............................................................................................................ 37 
3.5 – Escolha do tipo de cromatografia líquida .................................................................................... 40 
Questões Comentadas ............................................................................................................................... 45 
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Lista de Questões da Aula .......................................................................................................................... 76 
Gabarito ..................................................................................................................................................... 93 
Principais Pontos da Aula ....................................................................................................................... 94 
 
 
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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS (PARTE 2) 
1 – Considerações Iniciais 
Olá, pessoal, tudo joia? 
Na introdução da aula passada, já havia mencionado a importância do estudo da cromatografia, tópico 
muito cobrado em concursos na área de química e farmácia. Hoje finalizaremos o estudo desse conteúdo, 
abordando tanto a cromatografia gasosa (CG) quanto a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). 
Nossa aula será dividida em dois capítulos, um para CG e outro para CLAE. Como os fundamentos da 
cromatografia em coluna já foram ensinados na aula passada, nosso foco hoje será na análise instrumental, 
ou seja, no estudo dos cromatógrafos. No início de cada capítulo, farei uma abordagem geral do 
instrumento e, na sequência, abordaremos cada componente dele de forma mais detalhada. 
Temos muito conteúdo para hoje e também muitos exercícios para resolver. Então, sem mais demora, 
vamos iniciar nosso conteúdo de hoje. Desejo-lhe uma boa aula e lembre-se de me procurar pelo fórum caso 
fique com alguma dúvida. Bons estudos! 
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2 – Visão geral da cromatografia gasosa 
A cromatografia gasosa e líquida se diferencia pela fase móvel (FM) utilizada. 
Se for utilizada FM líquida, temos um experimento de cromatografia líquida (CLAE). Por 
outro lado, se for utilizada FM gasosa, obtém-se um experimento de cromatografia gasosa 
(CG). 
Um equívoco bastante comum é o candidato achar que a CG é aplicável apenas para amostras gasosas. Na 
verdade, amostras líquidas também podem ser analisadas por CG conforme explicado no quadro abaixo. É 
possível ainda a análise de uma amostra sólida, desde que ela seja dissolvida em um solvente líquido. 
 
O que permite amostras líquidas serem analisadas/separadas por CG é a presença do forno 
nos cromatógrafos gasosos. Em geral, as amostras já são evaporadas na câmara do injetor 
antes delas entrarem na coluna cromatográfica. O forno é responsável por manter a 
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coluna aquecida e manter a amostra volatilizada. Pois bem, para que você não erre esse 
tópico em prova, listo abaixo os pré-requisitos para uma amostra ser separada por CG: 
I- Os constituintes da amostra precisam apresentar uma certa solubilidade no gás de 
arraste (fase móvel - FM) utilizado; e 
II- Os constituintes da amostra precisam ser voláteis. Em geral, precisam apresentar 
pontos de ebulição de até 300°C e serem termicamente estáveis (não se decomporem) à 
temperatura utilizada no forno. 
Agora que já sabemos que CG é aplicável tanto à amostra gasosa quanto à amostra líquida, desde que 
respeitado alguns pré-requisitos, vamos agora discutir a estrutura de um cromatógrafo gasoso de maneira 
mais geral. Observe a figura abaixo e correlacione com a discussão a seguir. 
 
Visão geral de um sistema de cromatografia gasosa 
O reservatório de gás corresponde a um cilindro de alta pressão de um gás de alta pureza. Esse gás, que 
pode ser He, N2 ou H2, recebe o nome de gás de arraste porque, no interior do cromatógrafo, será 
responsável por arrastar os componentes da amostra através da coluna cromatográfica. Antes de adentrar 
no equipamento, a pressão do gás comprimido vindo do cilindro é regulada para uma pressão desejada por 
um regulador de pressão (manômetro). 
A amostra é injetada no equipamento por um sistema de injeção, na figura acima, a amostraestá sendo 
injetada por uma seringa cuja agulha perfura um septo (um disco de silicone), responsável por fornecer 
vedação ao sistema cromatográfico. O interior do injetor e o forno já se encontram aquecidos no momento 
da injeção, promovendo a rápida evaporação dos constituintes da amostra, os quais são arrastados pelo gás 
de arraste através da coluna cromatográfica contida no forno, a qual também está aquecida para permitir 
uma eluição em tempo razoável. Por fim, os diferentes constituintes chegam em tempos diferentes ao 
detector, o qual é responsável por gerar o sinal continuo que irá constituir os picos de cada componente e, 
ao final da corrida cromatográfica, compor o cromatograma. Ressalta-se que o detector se encontra a uma 
temperatura superior à coluna para que os constituintes permaneçam no estado gasoso. 
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Após essa visão geral, vamos discutir separadamente os componentes dos cromatógrafos gasosos, 
apresentando os diferentes tipos de cada componente, suas características e respectivas aplicações. 
 
(COMPERVE - Técnico de Laboratório - Química - UFRN - 2015) 
 
A figura representa um sistema destinado à análise por cromatografia 
a) por troca iônica. 
b) líquida. 
c) por partição. 
d) gasosa. 
Comentários 
A presença do manômetro (regulador de pressão), componente 2, e do forno, componente 4, indicam que 
o instrumento ilustrado corresponde a um cromatógrafo gasoso. Apenas complementando a interpretação, 
temos: 
Componente 1: reservatório de gás analítico pressurizado; 
Componente 3: injetor; 
Componente 5: coluna cromatográfica; 
Componente 6: detector; e 
Componente 7: sistema de registro do cromatograma. 
Resposta: letra D 
2.1 – Colunas para cromatografia gasosa 
Na aula passada, por meio da interpretação da equação de van Deemter, vimos que o efeito dos caminhos 
múltiplos (= diferentes caminhos com diferentes comprimentos para o soluto seguir através da coluna) 
resulta em um maior alargamento do pico, um aumento da altura do prato teórico, diminuindo, portanto, a 
resolução (= capacidade de separação) da coluna cromatográfica. Nesse sentido, a separação realizada em 
colunas cromatográficas mais espessas sofrerá maior efeito dos caminhos múltiplos e apresentará menor 
resolução. Por isso, colunas capilares, que são mais estreitas, apresentam maior resolução (picos mais 
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estreitos) que as colunas empacotadas, que são mais espessas. Esses dois tipos de coluna são ilustrados na 
figura abaixo. 
 
 
Coluna capilar: se assemelha a um fio fino, o 
qual é enrolado na forma de bobina para 
ocupar um menor espaço dentro do 
equipamento. 
Coluna empacotada: mais espessa e muito 
mais curta que a coluna capilar. 
Apresento abaixo uma tabela que lista os dois tipos de colunas cromatográficas utilizadas em CG e as 
respectivas características que você deve conhecer. 
Tabela com as principais características das colunas para cromatografia gasosa 
 
Coluna capilar ou coluna tubular 
aberta Coluna empacotada ou coluna 
recheada de parede recoberta 
revestida com 
suporte 
Revestimento 
externo 
Geralmente aço, alumínio, cobre ou 
Poliamida (polímero que resiste a 
temperatura de 350°C) 
Aço ou vidro 
Dimensões 
Estreita e cumprida 
L: 15 a 100 m (normalmente em torno de 30 
m); 
: entre 0,10 e 0,53 mm 
Espessa e mais curta 
L: 1 a 5 m; 
: entre 2 e 6 mm 
Suporte Sílica fundida Sílica 
Composição interna 
Filme de 0,1 a 5µm 
de FE líquida sobre a 
parede interna da 
coluna 
Filme de ~30 µm 
Partículas finas, as quais podem 
funcionar como FE ou podem ser 
recobertas por uma FE líquida 
Capacidade de 
amostra 
Baixíssima Intermediária Elevada 
Resolução 
(desempenho, 
capacidade de 
separação) 
Elevada Intermediária Baixíssima (muito ruim) 
Aplicação 
Utilizadas na maioria das separações por 
cromatografia gasosa 
Utilizada em cromatografia preparativa 
ou para separação de gases de baixa 
retenção 
Em que L: comprimento da coluna, : diâmetro da coluna e FE: fase estacionária. 
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Note que temos dois tipos de coluna capilar: coluna tubular aberta de parede recoberta; e coluna tubular 
aberta revestida com suporte. A escolha entre uma e outra dependerá da quantidade de amostra que se 
deseje analisar e também da resolução desejada. Conforme apresentado na tabela, a do tipo revestida com 
suporte apresenta capacidade de amostra mais elevada. Por outro lado, a do tipo parede recoberta é a mais 
indicada em separações cromatográficas mais complexas que seja requerido uma maior resolução. 
Para finalizar nosso estudo sobre os tipos de coluna para CG, explico que colunas mais estreitas, colunas 
capilares, exigem uma maior pressão do gás de arraste para viabilizar a eluição dos constituintes da 
amostra. Além disso, no caso em que a FE é sólida, quanto menor a granulometria (tamanho das partículas), 
maior será resolução e maior será a pressão exigida. 
Aproveito o espaço desta seção para falar rapidamente de dois componentes distintos, que, embora 
cumpram funções distintas da coluna cromatográfica, apresentam composição parecida a ela. Listo abaixo 
esses dois componentes com as respectivas funções: 
o Pré-coluna: apresenta composição química semelhante à coluna cromatográfica. Apresenta 
comprimento entre 3 e 10 m e são posicionadas antes da coluna. É fabricada com menor rigor C 
analítico que as colunas e, por isso, apresentam um menor custo. Cumpre a função de reter 
impurezas ou contaminantes não voláteis que poderiam comprometer o desempenho da coluna 
cromatográfica e diminuir sua vida útil. Portanto, podemos dizer que a pré-coluna melhora a 
qualidade da análise e preserva a coluna cromatográfica. Eventualmente, se faz necessário cortar a 
parte inicial da pré-coluna, região em que se acumula os contaminantes não voláteis. 
o Coluna de retenção: apesar do aquecimento realizado pelo forno, algumas gotículas podem 
persistir antes da evaporação completa da amostra e seguir no interior da coluna cromatográfica. 
Essas gotículas promovem uma liberação lenta dos constituintes da amostra, produzindo 
irregularidades nos picos. Para resolver esse inconveniente analítico, utiliza a coluna de retenção que 
impede que a amostra entre na coluna antes de sua evaporação completa. Sendo assim, a pré-coluna 
e a coluna de retenção melhoram a resolução e a reprodutibilidade do método. 
2.2 – Forno - Programação de temperatura do método 
A respeito do forno, é importante saber que é possível escolher uma temperatura constante pré-definida 
para o método ou também ser programado uma rampa de temperatura, em que a temperatura é alterada 
durante a corrida (análise) cromatográfica de uma amostra. E por que isso é importante? 
De início, vale relembrar que a temperatura do forno, no qual a coluna cromatográfica está contida, deve 
ser suficientemente elevada para evaporar os diferentes constituintes e permitir que os mesmos sejam 
arrastados pelo gás de arraste através da coluna. Ok! Isso já sabíamos, mas e quanto à rampa de 
temperatura... qual a sua utilidade? 
 
 
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O aumento da temperatura da coluna resulta num menor tempo de equilíbriodo soluto 
entre as fases estacionária (FE) e móvel (FM), reduzindo, portanto, o tempo de eluição 
(tempo necessário para atravessar a coluna e chegar ao detector). Uma elevação já no 
início da análise pode, em alguns casos, prejudicar a separação dos primeiros picos a sair, 
os quais são mais finos. Entretanto, o aumento da temperatura durante a análise (= rampa) 
pode acelerar a eluição dos últimos picos, bem como afiná-los. Ressalta-se que os últimos 
picos são mais largos, já que houve um tempo maior para o efeito da difusão longitudinal 
(estudado na aula passada). 
Como se vê, a utilização da rampa de temperatura pode, em alguns casos, trazer 
vantagens para o método, tais como: 
i. melhorar a resolução para alguns constituintes da amostra; 
ii. diminuir o tempo de eluição (menor retenção do soluto pela coluna); e 
iii. diminuir o tempo de análise, aumentando a produtividade. 
Por outro lado, a utilização de rampas deve ser realizada com certa parcimônia, sempre respeitando a 
resistência térmica da coluna. O fabricante indica no manual da coluna dois limites elevados de 
temperatura. O mais baixo deles indica a temperatura isotérmica, à qual a coluna suporta ser aquecida e 
mantida por um longo período sem sofrer alterações ou decomposições do conteúdo interno. A outra 
temperatura mais elevada corresponde ao limite máximo em que a coluna consegue ser mantida por 
períodos mais curtos, em geral, por minutos. Temperatura demasiadamente elevadas podem promover o 
“sangramento” da coluna, que consiste na liberação lenta de uma parte da fase líquida imobilizada da 
coluna. Aumento da linha de base do cromatograma, alteração do tempo de retenção de um padrão e 
distorção dos picos são indicativos de degradação da coluna em decorrência do seu “sangramento”. 
Diante do discutido, fica claro que o controle de temperatura é importante não só para a boa qualidade da 
análise, mas também para o aumento da vida útil da coluna. Nesse sentido, destaco algumas características 
desejáveis de um forno de CG: 
o Temperatura estável e reprodutível: o forno deve apresentar boa exatidão (erro ≤ 0,1°C) e precisão 
(desvio padrão ≤ 0,1°C); 
o Rápido aquecimento e resfriamento: essa característica aumenta a velocidade da análise em 
métodos que se utiliza rampas de temperatura; 
o Ampla faixa de trabalho: em geral, é desejável uma faixa entre temperatura ambiente e 400°C; 
o Uniformidade de temperatura: é desejável que o forno mantenha a mesma temperatura em todo 
seu interior, o que pode ser conseguido por sistemas de ventilação inteira; 
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o Bom isolamento térmico para que o aumento de sua temperatura não resulte no aumento da 
temperatura dos demais componentes do equipamento; e 
o Facilidade no acesso à coluna: essa característica permite maior rapidez na troca de coluna, o que 
é interessante para equipamentos que são utilizados para diferentes métodos com diferentes 
colunas. 
Por fim, vale mencionar que alguns equipamentos modernos possuem controle eletrônico de pressão do 
gás de arraste. Desta forma, no programa do método pode ser previsto não só a alteração da temperatura 
durante a corrida, mas também alteração da pressão. Essa possibilidade é uma boa alternativa para análise 
de compostos termicamente instáveis, pois, a partir do aumento da pressão, é possível diminuir o tempo de 
eluição sem elevar significativamente a temperatura. 
Abaixo está apresentado um cromatógrafo gasoso com a tampa frontal aberta, permitindo a visualização 
interna do forno, dentro do qual está instalada uma coluna capilar. A ventoinha posicionada atrás da coluna 
promove a circulação de ar no interior do forno, melhorando a homogeneidade da temperatura em seu 
interior. 
 
Visão interna do forno de um CG 
 
(CESGRANRIO – Técnico Químico de Petróleo Júnior – Petrobras – 2012) Considere um sistema de 
cromatografia gasosa, formado por uma fase móvel gasosa e inerte, e uma fase estacionária líquida, 
imobilizada em um suporte capilar que compõe a coluna. Uma dada análise é conduzida no referido 
sistema a partir da injeção de uma amostra, que é carreada para a coluna e separada ao longo da 
passagem por essa coluna. 
Com relação a potenciais amostras líquidas a serem analisadas nesse sistema, sabe-se que elas são 
a) vaporizadas ao longo do seu carreamento pela coluna. 
b) vaporizadas antes de alcançarem a coluna. 
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c) vaporizadas parcialmente antes de alcançarem a coluna. 
d) impossíveis de serem analisadas por essa técnica. 
e) carreadas através da coluna na forma líquida. 
Comentários 
Já no injetor, componente anterior (que vem antes) à coluna, a amostra é vaporizada para, em seguida, 
adentrar à coluna cromatográfica. 
Resposta: letra B 
2.3 – Gás de arraste 
 O gás de arraste corresponde à fase móvel (FM) em cromatografia gasosa (CG). Recebe 
esse nome porque não interage com a amostra e porque é responsável por arrastar os 
constituintes de uma amostra (mistura complexa) através da coluna. 
Podemos destacar as seguintes características desejáveis para um gás de arraste: 
o Inerte: o ideal é que ele não reaja com nenhum material que esteja em contato, quais sejam amostra, 
FE e superfícies diversas do instrumento; 
o Elevada pureza: apesar do elevado custo, são requeridos gases com elevado grau de pureza, 
frequentemente chamados de gases analíticos. As impurezas podem degradar a FE da coluna, a 
exemplo da presença de oxigênio que pode oxidar compostos do interior da coluna. Além disso, 
algumas impurezas podem ser incompatíveis com determinados tipos de detectores: água e 
oxigênio são incompatíveis com detector por captura de elétron (DCE); enquanto que 
hidrocarbonetos são incompatíveis com detector por ionização em chama (DIC); e 
o Compatível com o detector: cada tipo de detector apresenta compatibilidade com um grupo de 
gases de arrastes específicos, conforme apresentado na tabela abaixo. 
 
Escolha do gás de arraste de acordo com o tipo de detector do instrumento 
Tipo de detector Gases de arraste compatíveis 
Detector por condutividade 
térmica (DCT ou TCD) 
He, H2 
Detector por ionização em 
chama (DIC ou FID) 
Ne, H2 
Detector por captura de elétrons 
(DCE ou ECD) 
N2 SS (super seco), Ar + 5% CH4 
(mistura P5) 
 
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O gás hidrogênio (H2) produz boas separações em tempos reduzidos de análise, o que é uma grande 
vantagem. Além disso, confere elevada robustez ao método, mantendo boa resolução (capacidade de 
separação), em relação à utilização de diferentes vazões. O principal receio dos analistas, quanto ao uso 
desse gás, era o risco de explosão caso o hidrogênio entrasse em contato com oxigênio em proporções 
adequadas. No entanto, hoje é possível a utilização de um gerador de hidrogênio, que produz hidrogênio 
em pequenas quantidades requeridas pelo instrumento, substituindo, portanto, a utilização de cilindros de 
gás de hidrogênio. Nesse caso, o risco de explosão é praticamente inexistente. 
 
A pureza dos gases analíticos é expressa em uma nomenclatura pouco usual em nosso dia 
a dia. Apesar disso, essa nomenclatura permite a identificação rápida do gás presente e de 
sua pureza. Veja abaixo como funciona: 
Representação geral: Nome do Gás X.Y 
Em uma escala de 0% a 100%: 
X representa o número de “noves” da pureza do gás 
Y representa o último dígito da pureza, podendo assumirvalores entre 0 e 8 
Exemplos: 
O2 5.0: corresponde ao gás oxigênio a uma pureza de 99,999% (cinco “noves”); 
He 4.5: corresponde ao gás hélio a uma pureza de 99,995 (quatro “noves” seguidos de 
“cinco”). 
2.4 – Injetor e tipos de injeção de amostra 
O injetor é, sem dúvida, um componente determinante para a boa reprodutibilidade da análise 
cromatográfica. Conforme estudamos na aula passada, existe uma variância decorrente da injeção pois, a 
amostra não pode ser injetada na coluna em uma variação de tempo (Δt) infinitesimalmente pequena, ou 
seja, com Δt tendendo a 0. Por isso, a banda já apresenta uma certa largura, a qual pode ser estimada por 
Δt≠0. Esse alargamento diminui a resolução da coluna (= capacidade de separação das bandas), conforme 
ilustrado na figura abaixo. Portanto, o ideal é que a injeção seja realizada no menor tempo possível para 
reduzir esse efeito negativo. 
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Ilustração do efeito da velocidade de injeção na separação de bandas. 
Além da velocidade de injeção, outra variável crítica, no processo de injeção da amostra, é a quantidade de 
amostra injetada na coluna. Como vimos, as colunas capilares, que fornecem melhores resoluções, 
apresentam baixa capacidade de amostra. Por isso, muitas vezes, para se obter boas resoluções, são 
injetados volumes muito pequenos (≤ 1µL). Outra alternativa é utilizar uma injeção com divisão de fluxo, na 
qual apenas 0,2-2,0% segue para a coluna cromatográfica. Para entender melhor essas variantes, vamos 
analisar a estrutura física de um injetor e, na sequência, estudar os diferentes tipos de injeção de amostra 
em colunas capilares. 
Na figura abaixo está apresentado um injetor do tipo injeção direta na coluna ou “on-
column”. A estrutura do injetor não carece de muitas explicações, já que seu 
funcionamento é intuitivo. Na parte superior, tem-se o septo (disco de silicone), o qual é 
perfurado pela agulha no momento da introdução da amostra no equipamento. A 
tubulação em vermelho corresponde à entrada do gás de arraste, que é responsável por 
conduzir a amostra através da coluna. A extremidade da coluna cromatográfica fica 
conectada na parte inferior do injetor. Note ainda que a estrutura do bloco é metálica, o 
que permite seu rápido aquecimento, que se faz necessário para a volatilização dos 
componentes da amostra. 
 
Ilustração do injetor do tipo on-column (injeção direta na coluna). 
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Para compreender os três tipos de injeção em colunas capilares, observe as figuras abaixo e descrição 
seguinte. 
 
 
Ilustração dos três tipos de injeção1 
Injeção com divisão de fluxo (split): no desenho da esquerda acima, note que são 
introduzidos 102 ml/ min (fluxo) do gás de arraste. Desses, um fluxo 1 mL/min é escapado 
pela purga do septo, a grande maioria deixa o injetor pela abertura de divisão (parte 
inferior), 100 mL/min, e apenas um fluxo de 1 mL/min atinge o interior da coluna. Nesse 
tipo de injeção, injeta-se em torno de 1µL, apenas cerca de 0,2-2,0% da amostra injetada 
chega-se à coluna, o que, em muitos casos, é mais que suficiente para uma detecção 
adequada. Estima-se que uma boa quantidade para detecção seja de apenas ≤ 1ng (10-9g) 
de cada constituinte da amostra. A injeção com divisão de fluxo é indicada, portanto, para 
amostras mais concentradas. Ressalta-se que a temperatura do injetor é alta (~350°C), 
temperatura para evaporar instantaneamente toda a amostra. Uma desvantagem desse 
tipo de injeção é a baixa reprodutibilidade obtida na divisão de fluxo. 
Injeção sem divisão de fluxo (splitless): apropriada para amostras com baixíssimas 
concentrações (concentrações traço). Injeta-se cerca de 2µL (volume maior) de amostra, 
a qual não evapora totalmente, já que a temperatura do injetor é mais reduzida (~220°C). 
A temperatura, em geral, está abaixo do ponto de ebulição do solvente. Desta forma, o 
solvente na entrada da coluna impede a entrada dos constituintes na amostra (também 
chamado de aprisionamento). Em seguida, inicia a elevação da temperatura até que o 
 
1 HARRIS, Daniel C. Química analítica quantitativa. Rio de Janeiro: LTC Editora, p. 469, 2001. 
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solvente evapore e entre juntamente com os constituintes da amostra dentro da coluna. 
Esse aprisionamento permite a formação de picos finos e faz com que amostra permaneça 
cerca de 1 minuto na câmara interna do injetor. Nesse tipo de injeção também há um fluxo 
de gás de arraste, só que aqui esse fluxo é muito inferior, cerca de 2 mL/min. Por fim, vale 
destacar que cerca de 80% da amostra alcança o interior da coluna cromatográfica. 
Injeção direta na coluna (on-column): em geral, são utilizadas seringas analíticas com 
agulhas finas de sílica. A agulha alcança o interior da coluna, daí o nome injeção direta na 
coluna. Esse tipo de injeção é aplicável a amostras que se decompõe acima do seu ponto 
de ebulição, o que inviabilizaria o seu aquecimento prévio no injetor. A amostra líquida fica 
retida no início da coluna e começa a eluir após o início do aquecimento da coluna. Nesse 
tipo de injeção, são utilizadas as menores temperaturas possíveis para evitar ou pelos 
menos diminuir a degradação dos constituintes da amostra. 
Vale lembrar que compostos sólidos podem ser analisados por CG, desde que sejam dissolvidos em um 
solvente adequado para posterior injeção no equipamento. Você pode ser questionado ainda sobre o 
volume de injeção na CG. Embora as faixas de volume de injeção sejam relativamente amplas, devemos 
lembrar que colunas capilares apresentam capacidade de amostra muito interior às colunas empacotadas. 
Para responder esse tipo de questionamento, use a tabela abaixo: 
Tipo de coluna Amostras líquidas Amostras gasosas 
Capilar 0,01 µL a 3 µL 0,001 mL a 0,1 mL 
Empacotada 0,2 µL a 20 µL 0,1 mL a 50 mL 
 
(IBFC – Perito Criminal – Farmácia – PC-RJ – 2013) A cromatografia com fase gasosa vem, ao longo dos 
anos, evoluindo no sentido de oferecer opções ao analista. Sobre esta técnica, selecione a alternativa 
verdadeira. 
a) As principais colunas usadas hoje em dia são as capilares, cujas dimensões geralmente situam-se entre 
0,15 a 0,75mm de diâmetro interno, 10 a 30m de comprimento e 0,5 a 2,5µm de espessura de filme líquido. 
b) As derivações (ou derivatizações), reações feitas nas moléculas dos analitos para torná-los analisáveis por 
cromatografia gasosa, visam introduzir nelas grupos específicos para diminuir sua volatilidade ou aumentar 
sua detectabilidade. 
c) No modo de injeção sem divisão (splitless), toda a amostra é introduzida no sistema cromatográfico; esta 
técnica é adequada particularmente na análise de traços, bastante comum em peritagens. 
d) O número de pratos teóricos, em cromatografia gasosa, normalmente é associado à coluna: quanto 
maiores o seu comprimento e seu diâmetro interno, maior será sua eficiência. 
e) A resolução é inversamente proporcional à raiz quadrada de eficiência. Ao duplicar o comprimento da 
coluna, duplica- se o tempo de análise. 
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Comentários 
Letra A: incorreta. Conforme estudamos, as principais colunas capilares utilizadas apresentam as seguintes 
características: 
:entre 0,10 e 0,53 mm; 
L: 15 a 100 m (normalmente em torno de 30 m); 
Filme de ~30 µm para coluna tubular aberta revestida com suporte. 
Letra B: incorreta. Conforme estudaremos mais adiante, a derivatização consiste em ligar covalentemente 
grupos fluorescentes ao analito. Desta forma, o produto formado entre o analito e o grupo ligado passa a 
apresentar fluorescência, viabilizando a determinação do analito por meio desse tipo de detector que é mais 
sensível ou de maior detectabilidade. 
Letra C: correta. Traz a correta definição da injeção sem divisão de fluxo e um exemplo de sua utilização. 
Lembro que peritagem é a análise realizada por peritos. 
Letra D: incorreta. Colunas mais espessas apresentam menor eficiência devido ao agravamento do efeito 
dos caminhos múltiplos, estudados na aula passada. 
Letra E: incorreta. Resolução e eficiência são diretamente proporcionais. Uma maior eficiência produz picos 
mais estreitos, o que melhora a separação (resolução) dos picos. 
Resposta: letra C 
2.5 – Detectores 
O detector é o componente que gera um sinal elétrico proporcional à quantidade de mols 
de analito que chega até ele. Esse sinal é traduzido na forma de gráfico. Respeitados os 
limites inferior e superior de concentração, a área do pico é diretamente proporcional à 
concentração, de modo que é possível se estabelecer uma equação linear que correlacione 
área do pico (variável y) com a concentração (variável x). Essa equação, chamada de reta 
de calibração do equipamento, permite estimar a concentração das amostras, após ser 
obtidas as respectivas áreas. 
Os detectores podem ser classificados quanto à sua especificidade ou seletividade (= capacidade de 
distinguir o analito em relação às demais substâncias presentes) em: 
o Universais: produzem sinal para todas as substâncias eluídas, independentemente de suas 
características físico-químicas; 
o Seletivos: detectam apenas um grupo específico de substâncias que apresentam em comum uma 
dada propriedade físico-química; e 
o Específicos: detectam apenas substâncias que apresentam determinado grupo de átomos, a 
exemplo de uma função orgânica, ou determinado elemento. É o tipo de detector mais específico. 
Mais de 50 tipos de detectores já forma utilizados em cromatografia gasosa. Vamos nos restringir ao estudo 
de apenas 4 deles, os quais correspondem a maioria das aplicações. Sem mais delongas, vamos discutir as 
principais características, funcionamento e aplicações desses 4 tipos. 
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2.5.1 – Detector por condutividade térmica (DCT ou TCD) 
O funcionamento do detector DCT se baseia na variação de condutividade térmica do 
eluato gasoso, no momento da passagem do analito pelo detector. O hélio (He) é o gás de 
arraste mais utilizado no caso do DCT. Esse gás apresenta uma alta condutividade térmica, 
sendo menor apenas que o hidrogênio (H2). Por isso, durante a passagem do He pelo 
detector, a passagem de qualquer outra substância produzirá uma diminuição da 
condutividade. Essa diminuição da condutividade promove o aquecimento do filamento 
metálico (figura abaixo), a resistência também é aumentada, o que gera uma diferença de 
potencial que é medida e convertida em um pico cromatográfico. Muitos equipamentos 
dividem o fluxo do gás de arraste entre duas celas de leitura do tipo DCT, uma será tida 
como cela de referência e a outra cela da amostra. A vantagem desse tipo de configuração 
é que permite que flutuações naturais da leitura possam ser corrigidas. 
 
Detector de condutividade térmica 
Principais características do detector por condutividade térmica (DCT ou TCD) que você deve lembrar: 
o Princípio: variação de condutividade térmica do eluato gasoso, no momento da passagem do 
analito pelo detector; 
o Gás de arraste: geralmente He; 
o Seletividade: UNIVERSAL; 
o Sensibilidade: intermediária e inferior a dos demais detectores; 
o Área do pico é dependente da vazão do gás de arraste. Em linhas gerais, dizemos que o DCT é 
mais sensível quanto menor for o fluxo do gás; 
o Quanto menor a condutividade térmica do analito, maior será o aquecimento do filamento 
(DICA: quanto mais isolante for o analito, menos da corrente elétrica será conduzida e isso resultará 
no aquecimento do filamento, já que a corrente estará sendo continuamente fornecida ao sistema); 
o Aplicação: análise de compostos que não geram sinal em outros detectores, a exemplo de gases 
nobres e gases fixos. 
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2.5.2 – Detector de ionização de chama (DIC ou FID) 
Esse detector se baseia no aumento da condutividade elétrica devido a formação de íons 
oriundos da queima dos compostos contendo carbono (excetuados carbonos 
provenientes de carbonilas ou carboxilas) em uma chama de hidrogênio (H2) + oxigênio 
(O2). Aplica-se uma diferença de potencial entre a extremidade do queimador (flame tip), 
figura abaixo, que funciona como o eletrodo negativo e o coletor (eletrodo positivo). Na 
chama de H2 + O2 não há íons, mas quando chega ao detector um composto constituído 
de carbonos, o mesmo é queimado produzindo íons CHO+, conforme reação apresentada 
abaixo. A presença de íons permite o fluxo da corrente elétrica, a qual é convertida em 
diferença de potencial, mensurada e finalmente traduzida como um pico cromatográfico. 
 
 
Detalhe da chama de H2 + O2, no momento 
em que é gerado íons, permitindo a 
condução da corrente elétrica (i). 
Arquitetura do detector de ionização de chama. 
Segue abaixo a reação de formação de íons a partir de radicais CH: 
CH + O → CHO+ + e- 
Apenas uma quantidade muito pequena dos átomos carbonos, 1 a cada 105, são transformados em íons, 
mas já é suficiente para permitir que a resposta seja proporcional à quantidade de carbono. Por fim, listo 
abaixo as principais características do detector de ionização de chama (DIC ou FID) que você deve lembrar: 
o Princípio: aumento da condutividade elétrica devido a formação de íons oriundos da queima dos 
compostos contendo carbono; 
o Gás de arraste: Ne, H2, N2, He; 
o Seletividade: detector seletivo para substâncias que contém ligações do tipo C-H; 
o Sensibilidade: excelente. Apresenta limite de detecção 100 vezes menor que o detector DCT. Por 
isso, é perfeitamente aplicável ao uso de colunas capilares; 
o Aplicação: sensível a hidrocarbonetos em geral; e 
o Alguns compostos que não produzem sinal no DIC: H2, O2, N2, CO, CO2, CCl4, NH3, H2O e HCOOH. 
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2.5.3 – Detector de captura de elétrons (DCE e ECD) 
Baseia-se na diminuição (supressão) de elétrons lentos devido a absorção dos mesmos por 
espécies eletrofílicas, que, nesse caso, corresponde aos analitos. No detector, o gás de 
arraste é ionizado por elétrons de alta energia (radiação β-), conforme apresentado na 
reação abaixo, emitidos por uma lâmina radioativa, que é normalmente constituída de 63Ni 
ou 3H (na forma de Ta3H3). Os elétrons gerados dessa ionização produzem uma corrente 
elétrica constante entre o cátodo e ânodo. Parte dos elétrons são absorvidos por analitos 
eletrofílicos (moléculas que “gostam de elétrons”) que chegam ao detector, resultando em 
uma diminuição da condutividade no plasma (mistura gasosa com espécies iônicas 
formada no detector). 
Como de costume, listo abaixo as principais características do detector de captura de elétrons (DCE ou ECD) 
que você deve levar para prova: 
o Princípio: diminuição (supressão)de elétrons lentos devido a absorção dos mesmos por espécies 
eletrofílicas; 
o Gás de arraste: N2 SS (super seco), Ar + 5% CH4 (mistura P5); 
o Seletividade: sensível a substância que apresentem halogênio, carbonilas conjugadas, nitrilas, 
nitrocompostos e compostos organometálicos; 
o Baixa sensibilidade a cetonas, álcoois e hidrocarbonetos; 
o Sensibilidade: extremamente sensíveis. Sua sensibilidade se assemelha à espectrometria de massa; 
o Aplicação: determinação de substâncias eletrofílicas. 
2.5.4 – Detector por espectrometria de massa 
A espectrometria de massa (MS) não é um assunto que vamos desenvolver na aula de hoje, pois já tivemos 
uma aula mais dedicada ao seu estudo. Por enquanto, você deve se lembrar que o detector por 
espectrometria de massa pode ser utilizado em cromatografia gasosa (CG), combinação de técnicas muito 
conhecida pela sigla CG-MS. 
Você se lembra da aula passada, em que discutimos que na cromatografia em camada delgada (CCD), duas 
substâncias podem apresentar o mesmo fator Rf e, por isso, não poderíamos utilizar a CCD para identificar 
as substâncias de forma categórica? Pois é.... Embora pouco provável, isso também pode acontecer na 
cromatografia em coluna, ou seja, duas substâncias com características semelhantes podem apresentar o 
mesmo tempo de retenção, sob certas condições analíticas. É nesse ponto que se destaca a principal 
vantagem do detector por espectrometria de massa, o qual pode ser utilizado não só para quantificação, 
mas também para identificação confiável de substâncias presentes na amostra. 
A seguir, vamos relembrar algumas características desse tipo de detector: 
o Princípio: detecção, por meio de suas relações massa/carga (m/z), dos íons produzidos a partir da 
fragmentação de moléculas maiores; 
o Seletividade e sensibilidade: muito elevadas; 
o Aplicação: ampla. Aplicável a amostras com diferentes níveis de complexidade; e 
o Custo: elevado tanto de aquisição como manutenção. 
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Para finalizar nosso estudo sobre cromatografia gasosa (CG), lembro que vários outros tipos de detectores 
podem ser utilizados em CG, a exemplo de: 
o Detector nitrogênio-fósforo (detector de chama alcalino): detector de ionização em chama (DIC) 
adaptado para detecção de compostos contendo N e P; 
o Detector fotométrico de chama: baseia-se na emissão de luz por espécies atômica de fósforo, 
chumbo, dentre outros elementos; 
o Detector de plasma: também se baseia na emissão atômica, só que aqui essa emissão ocorre no 
plasma. 
 
(NUCEPE - Perito Criminal – Química - PC-PI - 2018) A cromatografia gasosa é um método físico de 
separação dos componentes de uma mistura através de uma fase gasosa móvel sobre um adsorvente 
estacionário. Depois de separados, os componentes da mistura podem ser quantificados por um 
detector adequado, situado na saída da coluna de separação. Sobre as características dos diversos tipos 
de detectores, NÃO é correto afirmar: 
a) O de condutividade térmica (DCT) é um detector considerado universal, não destrutivo e sensível à 
concentração. 
b) O detector por captura de elétrons (DCE) é praticamente insensível a hidrocarbonetos, mas é muito 
utilizado na análise de pesticidas. 
c) O detector por ionização de chama (DIC) é muito utilizado na detecção de compostos orgânicos por não 
ser destrutivo. 
d) Os cromatógrafos com DIC normalmente utilizam hidrogênio como gás de arraste. 
e) O cromatógrafo gasoso acoplado à espectrometria de massa permite, além da separação dos compostos, 
a determinação da razão m/z dos fragmentos dos compostos separados. 
Comentários 
Letra A: correta. Apresenta três das principais características do detector por condutividade térmica (DCT). 
Letra B: correta. O DCE apresenta baixa sensibilidade a cetonas, álcoois e hidrocarbonetos. Por outro lado, 
apresenta alta sensibilidade a halogênio, carbonilas conjungadas, nitrilas, nitrocompostos e compostos 
organometálicos. 
Letra C: incorreta. O DIC é destrutivo. Quando chega ao detector um composto constituído de carbonos, o 
mesmo é queimado produzindo íons CHO+. 
Letra D: correta. O hidrogênio é muito utilizado como gás de arraste para detector DIC porque permite a 
formação da chama H2 + O2. 
Letra E: correta. A determinação da razão m/z dos fragmentos dos compostos separados é justamente o 
que permite a identificação das substâncias pela espectrometria de massa. 
Resposta: letra C 
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(CESPE - Perito Criminal - Farmácia - Polícia Científica - PE - 2016) A cromatografia gasosa acoplada à 
espectrometria de massas (CG-MS ou CG-MS/MS) tem substituído cada vez mais as técnicas de 
cromatografia gasosa (CG) acoplada a outros detectores, como o de ionização de chama (CG-FID) e o 
de captura eletrônica (CG-ECD). Com relação às técnicas e aos detectores citados, assinale a opção 
correta. 
a) O espectrômetro de massas só pode ser utilizado para a análise de moléculas pequenas, cuja massa molar 
seja de no máximo 300 g/mol. 
b) O detector de ionização de chama é seletivo a compostos nitrogenados, o que torna a técnica mais 
adequada para a análise de proteínas. 
c) O detector de captura eletrônica é altamente sensível a compostos que tenham halogênios, aminas ou 
álcoois como grupos funcionais, mas não é sensível a compostos eletronegativos. 
d) Utilizando-se o espectrômetro de massas, é possível obter informações sobre a massa molecular e a 
estrutura química do analito durante a análise. 
e) Os equipamentos de CG-MS ou CG-MS/MS tem menor custo que os de CG-FID e CG-ECD. 
Comentários 
Letra A: incorreta. Não há limitação de massa molar a 300 g/mol para utilização de espectrômetro de 
massas. A cocaína, por exemplo, que pode ser analisada por CG-MS (cromatografia gasosa acoplada a 
espectrometria de massa) possui massa molar 303,4 g/mol. 
Letra B: incorreta. O detector de ionização de chama é seletivo a hidrocarbonetos em geral e não a 
compostos nitrogenados. 
Letra C: incorreta. Conforme estudamos, no detector de captura eletrônica (DCE), parte dos elétrons 
gerados no detector são absorvidos por analitos eletrofílicos (moléculas que “gostam de elétrons”) que 
chegam ao detector, resultando em uma diminuição da condutividade no plasma. Como se vê, esse tipo de 
detector é sensível a compostos eletronegativos. 
Letra D: correta. Conforme estudamos, é possível quantificar e identificar substâncias a partir da 
espectrometria de massa. 
Letra E: incorreta. Detectores por espectrometria de massa (MS) apresentam elevados custos de aquisição 
e manutenção em relação a detectores de ionização em chama (FID) e de captura de elétrons (ECD). 
Resposta: letra D 
3 – Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC) 
Uma vez estudados os fundamentos da cromatografia em coluna, ensinados na aula passada, e a 
cromatografia gasosa, capítulo anterior, fica muito mais fácil e objetivo o estudo da cromatografia líquida 
de alta eficiência (CLAE ou HPLC). Vamos então à análise instrumental e experimental de CLAE. Antes, 
porém, relembro que é a utilização da fase móvel (FM) líquida que configura o experimento de CLAE. Caso 
a FM seja utilizada uma FM gasosa, então teremos um experimento de cromatografia gasosa. 
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Observe a figura abaixo e correlacione com a discussão a seguir. 
 
Visão geral de um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência. 
Naaula passada, no estudo da cromatografia em camada delgada (CCD), discutimos que 
a utilização de uma mistura de solvente como fase móvel (FM) poderia melhorar a 
separação cromatográfica. O mesmo acontece em CLAE. A diferença é que, em um 
sistema CLAE, o próprio equipamento faz a mistura dos solventes na proporção indicada 
pelo operador. Observe na figura acima que pode ser utilizado mais de um solvente como 
FM. Vamos dividir a explicação do sistema CLAE em tópicos para facilitar a visualização: 
1. As bombas, duas no exemplo acima, são responsáveis por bombear esses solventes, os 
quais são misturados na proporção desejada pelo misturador. 
2. A amostra é injetada na válvula do sistema, que tem a função de direcionar o fluxo de 
amostra e da FM para o caminho correto. De início, a válvula assume a posição load (de 
carregamento), em que a amostra lava o loop de amostragem (alça de amostragem) e, 
persistindo a injeção de amostra, o loop acaba sendo totalmente preenchido pela amostra. 
Note que o volume do loop de amostragem é fixo e, desta forma, sempre será injetada a 
mesma quantidade de amostra. Loops maiores ou menores poderão ser requeridos a 
depender da concentração dos analitos na amostra. 
3. Em seguida, a válvula muda para posição inject (modo de injeção), conforme 
estudaremos com mais detalhes adiante, e a FM vinda do misturador é responsável por 
carrear (“empurrar”) a amostra pelo sistema. 
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4. A amostra chega então à coluna cromatográfica, na qual ocorre a separação dos seus 
constituintes. 
5. Cada constituinte da amostra elui em tempos diferentes, possibilitando ao detector 
mensurar o pico cromatográfico de cada um. 
6. Por fim, o eluato líquido (fase móvel + amostra) chega ao resíduo ou descarte da 
análise. Perceba que há um outro frasco coletor de resíduo conectado diretamente à 
válvula. Esse tem a função de receber o excesso de amostra que passa pelo loop de 
amostragem durante a etapa de lavagem do mesmo. 
 
(IDECAN - Técnico em Química - CNEN - 2014) Analise o esquema que mostra um sistema genérico 
usado para cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPCL – High Performance Liquid 
Chromatography), a qual, independente do fabricante e do modelo atual, apresenta os seguintes 
princípios. 
 
Os componentes identificados pelas letras A, B e C são, respectivamente 
a) manômetro, válvula injetora e coluna cromatográfica. 
b) manômetro, filtro de solvente e coluna cromatográfica. 
c) manômetro, detector de amostra e coletor de amostra. 
d) medidor de fluxo de eluente, pré‐coluna cromatográfica e coletor de amostra. 
e) medidor de fluxo de eluente, pré‐coluna cromatográfica e coluna cromatográfica. 
Comentários 
O dispositivo A é um medidor de pressão ou manômetro; B, situado antes da coluna, corresponde à válvula 
injetora; e C é a coluna cromatográfica. 
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Resposta: letra A 
 
(FGV - Engenheiro Químico - CAERN - 2010) Em relação aos tipos de ensaios cromatográficos 
existentes, é correto afirmar que 
a) a cromatografia supercrítica é um tipo de cromatografia líquida. 
b) a cromatografia gasosa é classificada, em relação à forma física do sistema cromatográfico, como 
cromatografia planar. 
c) a cromatografia em papel é uma técnica de partição líquido-vapor. 
d) a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) emprega uma bomba para a eluição da fase móvel. 
e) no contexto da cromatografia gasosa, é imprescindível que a amostra não seja volátil. 
Comentários 
Letra A: incorreta. Não abordei a cromatografia supercrítica na parte teórica porque raramente suas 
particularidades são cobradas em prova, já que é um tipo de cromatografia ainda pouco explorado 
comercialmente. No entanto, cabe aqui uma rápida explicação, a cromatografia supercrítica é um tipo de 
cromatografia diferente da gasosa (CG) e da líquida (CLAE) e que despertado o interesse da pesquisa por 
reunir vantagens tanto de CG quanto de CLAE. Em geral, a cromatografia supercrítica emprega CO2 à alta 
pressão, liquefazendo e produzindo o chamado fluído supercrítico. Esse fluído reuni a maior permeabilidade 
da fase móvel pela coluna (característica de gás) e também facilita a solubilização de compostos 
(característica de FM líquida). Julgo que o informado na resolução desta alternativa seja suficiente para sua 
prova. 
Letra B: incorreta. A cromatografia gasosa é classificada como cromatografia em coluna. O gênero 
cromatografia planar engloba a cromatografia em camada delgada e cromatografia em papel. 
Letra C: incorreta. Na cromatografia em papel, a própria água presente na superfície do papel funciona 
como fase estacionária e a FM também é líquida. Portanto, temos uma cromatografia do tipo líquido-líquido 
por partição. 
Letra D: correta. A bomba é responsável por empurrar fase móvel e amostra através da coluna, resultado 
na eluição dos mesmos. 
Letra E: incorreta. É desejável que a amostra seja volátil ou que, pelo menos, seja termicamente estável para 
viabilizar a sua evaporação no forno antes da eluição através da coluna. 
Resposta: letra D 
3.1 – Coluna para CLAE 
 A coluna cromatográfica para CLAE é preenchida por partículas muito finas (3 a 10 µm) e é isso que 
proporciona uma alta resolução para técnica. 
Quanto mais finas as partículas da fase estacionária (FE), mais eficiente é a separação e, portanto, maior 
será o número de pratos teóricos. 
Mas por que a separação é mais eficiente com a diminuição do tamanho das partículas? 
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Para responder a essa questão, devemos recorrer à equação de van Deemter, discutida na 
aula passada e representada abaixo. Uma menor granulometria das partículas diminui as 
constantes A e C associadas, respectivamente, ao efeito de caminhos múltiplos e de 
tempo de equilíbrio. Para entendermos melhor esse efeito sobre C, podemos comparar a 
interação do analito com a FE a uma reação, já que, quanto maior a superfície de contato, 
mais rápida será a reação e, nesse caso, mais rápida será a interação e mais rapidamente 
o analito volta para a FM. 
Caminhos Difusão Tempo de
 mútiplos longitudinal equilíbrio
 
x
x
B
H A C u
u
 + + 
 
No entanto, devemos lembrar que, quanto mais finas e empacotadas forem as partículas da FE, maior a 
pressão necessária para forçar a passagem da amostra através da coluna. Ouvi de um professor há muito 
tempo que a passagem da amostra pela coluna é similar a forçar a passagem de um líquido através de uma 
parede. Impressionante, não é mesmo? Daí temos uma ideia da pressão necessária para um sistema CLAE. 
Outro fator que influi na pressão necessária é o raio da coluna cromatográfica. Quanto menor ele for, maior 
será a pressão requerida para a amostra e FM atravessarem a coluna. Pressões elevadas melhoram a 
resolução (= capacidade de separação), além de diminuir o tempo de eluição dos compostos. 
Sistemas de cromatografia líquida que trabalha com partículas da FE muito pequenas (entre 1,5-2µm) 
requerem pressões ainda mais elevadas e são chamados de Cromatografia Líquida de Ultraeficiência (CLUE 
ou UPLC do inglês Ultra Performance Liquid Chromatography). 
A tabela abaixo ilustra o efeito do tamanho das partículas da FE sobre o tempo de retenção, número de 
pratos teóricos e pressão requerida pelo sistema CLAE. 
Efeito do tamanho das partículas sobre parâmetros do método CLAE2 
Tamanho departícula (µm) 
Tempo de 
retenção (min) 
Número de 
pratos teóricos 
Pressão requerida, 
bar (psi) 
5,0 30 25000 19 
3,0 18 42000 87 
1,5 9 83000 700 
1,0 6 125000 2300 
Dados de desempenho de uma coluna capilar de 33 µm de diâmetro interno e 25 cm de comprimento. 
 
 
2 MACNAIR, John E.; PATEL, Kamlesh D.; JORGENSON, James W. Ultrahigh-pressure reversed-phase capillary liquid 
chromatography: isocratic and gradient elution using columns packed with 1.0-μm particles. Analytical chemistry, v. 71, n. 3, p. 
700-708, 1999. 
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Atenção! 
Há diferentes tipos de coluna, mas as mais amplamente utilizadas apresentam as 
seguintes características: 
i. Empacotadas com partículas muito finas (3 a 10 µm), fase estacionária; 
ii. Comprimento (L): entre 5 e 30 cm; 
iii. Diâmetro interno (): entre 1 e 5 mm; 
iv. Revestimento externo: em aço ou plástico 
v. Suporte: sílica com alta uniformidade do tamanho das partículas; e 
vi. Fase estacionária (FE): composto orgânico química ou fisicamente ligados ao suporte. 
 
Exemplos de colunas cromatográficas para CLAE de comprimentos e diâmetros diversos. 
O suporte e a FE em conjunto são comumente chamados de recheio da coluna. Como eu disse, existem 
outros tipos de coluna para CLAE, a exemplo das colunas capilares e colunas preparativas. 
Na tabela abaixo resumo algumas características dos principais tipos de coluna para CLAE. É bom ter uma 
noção geral dessas características. Por isso, organizei a tabela numa ordem crescente de comprimento, 
diâmetro interno, vazão e tamanho de partículas. 
Visão geral de características dos principais tipos de coluna cromatográfica para CLAE 
Tipo de 
coluna 
Comprimento 
Diâmetro 
interno (mm) 
Vazão 
(µL/min) 
Tamanho de 
partícula (µm) 
Colunas 
capilares 
1m a 100m 0,01 a 0,5 0,1 a 20 
entre 1 e 3 ou com 
filme líquido ligado ao 
suporte 
Colunas rápidas 3cm a 10cm 2 a 6 1000 a 5000 3 
Convencional 
ou analítica* 
5cm a 30cm 2 a 6 1000 a 3000 3 a 5 
Colunas 
preparativas 
maior que 20 cm 
maior que 10 
mm 
maior que 
1000 
maior que 10 
* tipo de coluna mais amplamente utilizado 
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101 
Embora muitos métodos via CLAE sejam executados em temperatura ambiente, o aquecimento da coluna 
pode ser empregado em alguns métodos. O aumento da temperatura diminui a viscosidade da FM, 
resultando em uma eluição mais rápida da amostra, além de melhorar a reprodutibilidade do método. Do 
mesmo modo que discutimos em cromatografia gasosa (CG), em CLAE também devemos ficar atento à 
temperatura máxima de trabalho da coluna. Caso contrário, com o aquecimento excessivo, a FE pode 
degradar, o que diminui consideravelmente a vida útil da coluna. 
Vale lembrar que, assim como na CG, em CLAE, também se utiliza a pré-coluna ou coluna de guarda. 
A pré-coluna apresenta a mesma FE da coluna cromatográfica e é responsável por reter 
partículas finas e solutos que se adsorvem fortemente. Em se tratando de uma coluna 
empacotada, não podemos cortar a pré-coluna como acontece em CG. Por isso, em CLAE, 
a pré-coluna é frequentemente substituída. A função desse dispositivo é a mesma em CG 
e CLAE: melhorar a qualidade da análise e preservar a coluna cromatográfica. 
Por fim, destaco alguns cuidados com a coluna cromatográfica a fim de preservá-la, aumentando, assim, 
sua vida útil: 
o Realizar a limpeza da coluna antes de guardá-la, removendo sais e tampões; 
o Manter suas extremidades vedadas durante o seu armazenamento, evitando contaminações da sua 
FE; 
o Evitar mudanças abruptas de pressão e de temperatura e choques mecânicos; 
o Usar solventes grau cromatográficos. A soluções utilizadas devem ser filtradas para evitar a entrada 
de sólidos suspensos na coluna; 
o Observar o sentido da coluna; 
o Utilizar coluna de proteção; 
o Manter a solução que atravessa a coluna dentro da faixa de pH indicada pelo fabricante. Em geral, 
2,0 < pH < 8,0 (acima de 8, por exemplo, ocorre a dissolução da sílica). Em muitos métodos, são 
utilizadas substâncias tampões para estabilizar o pH dentro de uma faixa desejável; e 
o Evitar precipitações durante a corrida cromatográfica por meio da escolha da FM adequada. 
3.2 – Fase normal e fase reversa 
Vimos na aula passada que 
Dá se o nome fase normal aos experimentos cromatográficos nos quais se utiliza uma fase 
estacionária (FE) de caráter mais polar e uma fase móvel (FM) de caráter mais apolar. Por 
outro lado, recebe o nome de fase reversa nas situações em que é utilizado uma FE de 
caráter mais apolar e uma FM de caráter mais polar. 
A sílica tem sido amplamente utilizada como suporte em colunas cromatográficas devido a sua boa 
estabilidade térmica; por ser mecanicamente estável, estar disponível em uma grande variedade de 
tamanho de partículas; apresentar elevado número de grupos silanóis3; e pode ser facilmente modificada... 
Pessoal, vamos discutir melhor essa última vantagem da sílica. Embora a sílica “nua” (sem nenhuma 
 
3 Grupos em que há pelo menos uma hidroxila ligada ao silício. Ex: (CH3)3-Si-OH; (CH3)2-Si-(OH)2. 
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modificação) possa ser utilizada como FE, o mais comum é que ela seja modificada para se obter uma nova 
constituição como FE. Observe a equação genérica abaixo em que o hidrogênio da hidroxila da sílica é 
substituído por um grupo R, o qual pode ser vários grupos diferentes. Se R for um grupo mais polar, então 
teremos uma FE polar e cromatografia será de fase normal. Por outro lado, se R for um grupo mais apolar, 
então a FE será apolar, a qual é normalmente utilizada em fase reversa. 
 
A esse tipo de fase estacionária dá se o nome de fase estacionária quimicamente ligada, a qual é obtida a 
partir da reação entre os grupos silanóis e os compostos contendo grupos polares (fase normal) ou apolares 
(fase reversa). Esses grupos estão ligados covalentemente à sílica como se vê na figura acima. Na tabela 
abaixo são apresentados os principais grupos R de fases polares e fases apolares. 
Fases estacionárias mais comuns4 
Fases polares comuns Fases apolares comuns 
R = (CH2)3NH2 amino R = (CH2)17CH3 octadecil, C18 
R = (CH2)3C≡N ciano R = (CH2)7CH3 octil, C8 
R = (CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH diol R = (CH2)3C6H5 fenil 
 R = (CH2)3C6F5 F5-fenil 
As fases estacionárias (FE) de baixa polaridade são comumente referidas pela nomenclatura C + número de 
carbonos. Por exemplo, C8 é a FE com 8 carbonos; C4, 4 carbonos e assim por diante. A coluna C18 é, sem 
dúvida, a mais aplicada em fase reversa, pois permite desde a separação de substâncias hidrossolúveis e 
iônicas até substâncias hidrofóbicas. 
Precisamos agora estabelecer um paralelo entre fase normal e fase reversa, discutindo suas principais 
características, vantagens e desvantagens e em que situações podemos aplicar uma ou outra. Sistematizei 
essas informações em forma de tabela, observe abaixo. Essa tabela não é para ser totalmente decorada, 
pois muitas das suas informações são deduzíveis. Por exemplo, se utilizamos uma FE polar, obviamente os 
compostos apolares eluirão mais rapidamente (menor tempo de retenção, tR), enquanto os polares ficarão 
mais tempo retidos por apresentar maior afinidade com a FE. Se, em outra situação, desejamos eluir mais 
rapidamente um soluto apolar através de uma FE apolar, então devemos diminuir a polaridade da FM. Por 
meio desse tipo de raciocínio, você conseguirá completar muitasinformações da tabela sem ter que 
memorizá-las. Beleza? Fica como dica de estudo. 
 
 
 
 
4 HARRIS, Daniel C. Análise Química Quantitativa. Grupo Gen-LTC, 2000. 
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==bc3d1==
 
 
 
 
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Paralelo com as principais características das fases normal e reversa 
 Fase normal Fase reversa 
Fase estacionária De caráter mais polar De caráter mais apolar 
Fase móvel 
Solventes de baixa e média polaridade. Ex: 
hexano, clorofórmio, acetonitrila (ACN), 
tetrahidrofurano (THF), isopropanol e metanol 
(MeOH) 
Solventes de média e alta polaridade. Ex: água, 
acetonitrila (ACN), metanol (MeOH) e 
tetrahidrofurano (THF) 
Quais solutos eluem 
primeiro? 
Os mais apolares, já que apresentam menos 
afinidade com a FE polar 
Os mais polares 
Como aumentar o 
tempo de retenção de 
um soluto? 
Diminuindo a polaridade da FM Aumentando a polaridade da FM 
Como diminuir o tempo 
de retenção de um 
soluto? 
Aumentando a polaridade da FM Diminuindo a polaridade da FM 
Aplicação 
Substâncias insolúveis em água (ex: lipídeos, 
hidrocarbonetos). Também usado na 
separação de isômeros. 
Ampla aplicação, podendo ser aplicados tanto 
para compostos hidrofílicos (polares e iônicos) 
quanto para compostos hidrofóbicos 
(apolares). 
Principais vantagens 
1. Estabilidade da coluna em relação à FM 
aquosa; 
2. Muitas substâncias orgânicas são mais 
solúveis em FM apolar; 
3. Aplicável a amostras incompatíveis com 
água; e 
4. Versatilidade satisfatória obtida por meio de 
alterações da FE e/ou FM. 
1. Ampla gama de aplicação (separação de 
compostos polares e apolares); 
2. Maior reprodutibilidade, a qual não é afetada 
pela presença de umidade; 
3. A água pode ser utilizada como FM e é um 
solvente muito barato; 
4. Os modificadores mais utilizados (metanol e 
acetonitrila) são de fácil obtenção; 
5. Ordem de eluição mais facilmente previsível; 
6. Eluição em gradiente facilitada 
(estudaremos esse tópico a seguir); e 
7. Menor ocorrência de adsorção irreversível. 
Principais desvantagens 
1. Ruim para separar compostos iônicos; 
2. Eluição mais demorada devido a maior força 
de interação entre solutos e FE; 
3. Baixa resolução; 
4. Custo elevado dos solventes orgânicos; e 
5. Maior tendência a formação de caldas 
(distorção do pico). 
Exatamente por praticamente não apresentar 
desvantagens que a fase reversa corresponde a 
maioria das aplicações. 
Em fase normal, a utilização de agentes de supressão iônica melhora a resolução cromatográfica. São 
normalmente utilizados ácidos acético ou fórmico para análise espécies ácidas; e amônia ou trietilamina 
para a análise de espécies com caráter básico. 
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Eu prefiro sempre que você entenda um dado efeito do que você o decore. Portanto, vamos lá! Como o 
próprio nome diz, esses agentes são responsáveis por diminuir a concentração de espécies iônicas. Ao 
adicionar um ácido acético a um meio, estamos aumentando a concentração de H+ e esse aumento desloca 
o equilíbrio (apresentado abaixo) do outro ácido HA, que é nosso analito, para a esquerda, ou seja, para a 
forma não iônica HA em detrimento da concentração de A-. O raciocínio análogo explica a supressão iônica 
para espécies básicas. Havendo menos espécies iônicas, a passagem por uma coluna polar será mais rápida. 
HA  H+ + A- 
 
(FGV - Tecnologista em Saúde - Farmacocinética - FIOCRUZ - 2010) O sucesso de uma análise 
cromatográfica depende, fundamentalmente, da coluna escolhida conforme a natureza das 
substâncias que se deseja determinar. As colunas de fase reversa são as mais utilizadas na separação 
por CLAE. Não é correto afirmar, sobre as colunas de fase reversa, que: 
a) são colunas de fase ligada. 
b) a retenção pode ser aumentada, reduzindo a polaridade da fase móvel. 
c) a polaridade da fase móvel utilizada é alta. 
d) a amostra mais polar, elui mais rapidamente. 
e) as do tipo C18, C8 e C2 são exemplos. 
Comentários 
Letra A: correta. Podemos ter coluna de fase reversa, cuja fase estacionária seja líquida e esteja ligada ao 
suporte. 
Letra B: incorreta. Em fase reversa, a retenção é diminuída, reduzindo a polaridade da fase móvel ou, em 
outras palavras, aumentado sua apolaridade. Nesse caso, a fase móvel mais apolar compete com a fase 
estacionária (FE) na interação com moléculas apolares, o que acaba diminuindo a interação dessas 
substâncias com a FE, o que resulta em uma maior velocidade de eluição. 
Letra C: correta. Em fase reversa, a fase estacionária (FE) é apolar e FM, polar. 
Letra D: correta. Em fase reversa, a FE é apolar e, por isso, solutos mais polares eluem mais rapidamente. 
Letra E: correta. As colunas C18, C8 e C2 são exemplos utilizados em fase reversa, em que o número indica 
a quantidade carbono da fase estacionária. 
Resposta: letra B 
 
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Eluição em cromatografia iônica: um caso à parte 
Precisamos examinar em mais detalhes, como se dá a eluição em cromatografia iônica. A 
fase estacionária será uma resina trocadora de íons, pois vai receber um íon e liberar outro 
de mesma carga. Portanto, podemos a fase estacionária (FE) serão grupos aniônicos ou 
catiônicos imobilizados (–SO3- ou –N(CH3)3+). Diante dessas informações, como podemos 
prever a ordem de eluição? Para tanto, devemos considerar duas regras: 
1. O fator principal de atração entre os íons analitos e a FE é a sua carga. Quanto maior a 
carga, mais fortemente se ligará à FE. Por exemplo, se tivermos uma resina de troca 
catiônica (FE) do tipo –SO3-, o cátion Ca2+ por ser bivalente será mais fortemente atraído 
pela FE do que o Na+ que é monovalente, já que, quanto maior a carga dos íons, maior será 
a atração eletrostática; 
2. Caso dois íons apresente a mesma carga, aí devemos considerar fatores menos diretos 
como polarizabilidade e grau de hidratação. No caso da polarizabilidade, basta 
lembrarmos que está diretamente relacionado ao raio do íon, quanto maior o seu raio, 
mais polarizável (mais sua nuvem de elétrons pode ser distorcida pela aproximação de 
outro íon). Por exemplo, o fluoreto (F-), que tem raio menor, é menos polarizável que o 
cloreto (Cℓ-), que tem raio maior. Sendo assim, em uma cromatografia iônica, os haletos 
apresentarão a seguinte ordem de eluição: F- (mais rápido), Cℓ-, Br- e I- (mais demorado). 
Considerando esses dois aspectos, que não são seguidos exatamente à risca, segue a 
ordem de eluição crescente (do mais rápido para os mais lentos) de alguns cátions e 
ânions: 
Cátions: 
Li+, H+, Na+, K+, NH4+, Rb+, Cd2+, Be2+, Cs+, Ag+, Mn2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+, Ca2+, Sr2+, 
Pb2+, Ba2+, Aℓ3+, Fe3+, Th4+. 
Ânions: 
F-, OH-, Cℓ-, Br-, I-, acetato-, MoO42-, PO43-, NO3-, tatarato2-, citrato3-, CrO42-, SO42-. 
 
 
 
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3.3 – Tipos de eluição 
Frequentemente os solventes utilizados como fase móvel (FM) são comparados pela a sua força eluente ou 
força de eluição. 
A força de eluição é a capacidade da FM de conduzir os solutos através da fase 
estacionária em um menor tempo, ou seja, com um menor tempo de retenção. 
Um solvente mais polar apresentará maior força de eluição em fase normal (FE polar). Por outro lado, um 
solvente mais apolar apresentarámaior força de eluição em reversa (FE apolar). Não confunda isso. 
Esquematizo abaixo para facilitar a revisão. 
 
Comparando força de eluição de solventes polar e apolar nas fases normal e reversa 
FM Fase normal Fase reversa 
Polar Maior força de eluição Menor força de eluição 
Apolar Menor força de eluição Maior força de eluição 
 
A eluição pode ser realizada de duas maneiras: 
Eluição isocrática: realizada utilizando FM com composição constante, que pode ser um 
único solvente ou uma mistura de solventes com proporções constantes do início ao fim 
da corrida (análise) cromatográfica; e 
Eluição por gradiente: a proporção entre os solventes da FM é alterada de maneira 
contínua. Por exemplo, suponhamos um FM formada pelos solventes A e B. Em uma 
eluição com gradiente, o solvente A pode ter sua proporção aumentada no misturador, 
enquanto a participação do solvente B é diminuída, durante a corrida cromatográfica. Esse 
tipo de eluição é muito apropriado em casos em que a eluição a uma proporção constante 
é muito demorada para alguns solutos. Essa estratégia possibilita que a polaridade da FM 
seja alterada durante a eluição, melhorando, em muitos casos, a resolução e resultando 
em picos mais finos. 
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Observe na figura abaixo, a diferença de um cromatograma obtido por eluição isocrática e o cromatograma 
para a mesma amostra, por eluição por gradiente. O tempo total da corrida necessário para eluir os 11 
componentes diminuíram de aproximadamente 16 min para menos de 10 min, ao substituir a eluição 
isocrática pela eluição por gradiente. Além disso, nota-se que os picos ficaram mais finos, o que melhora a 
resolução da análise. 
 Eluição isocrática Eluição por gradiente 
 
Comparação entre eluição isocrática e eluição por gradiente. 
Segue abaixo os parâmetros de um método por gradiente apenas como exemplo: 
o Coluna C18, L: 20 cm, : 4,5 mm; 
o Gradiente linear: 20 a 90% de acetonitrila (ACN), 45’’; 
o Fluxo da FM: 2,0 mL/min; 
o Volume de injeção: 20 µL de amostra. 
No exemplo acima, a concentração de ACN será elevada de 20 a 90% no intervalo de 45 segundos. A 
complementação dos 100%, nesse caso, será realizada com água. Então, se a um dado instante a 
concentração de ACN for 75%, então 25% será água. O gradiente aplicado foi linear, ou seja, a concentração 
aumenta de forma linear com o tempo. Outros tipos de gradiente podem ser aplicados para obter melhores 
resultados. Existem métodos que misturam os dois tipos de eluição, realiza o gradiente por um período, 
depois torna constante (isocrática) a proporção entre os solventes. Para fins de prova, você deve considerar 
o seguinte: 
 
 
 
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Houve variação da proporção entre os solventes? 
Se sim → eluição por gradiente 
Se não → eluição isocrática 
Abaixo dois exemplos de eluição por gradiente. Na figura (a), tem-se um gradiente linear em que a 
concentração de um dado solvente é elevada de 5 a 95%. Na figura (b), tem-se também uma eluição por 
gradiente, mas com intervalo isocrático mantendo a concentração em 40% por um certo período. Ainda na 
comparação das figuras (a) e (b), nota-se que houve uma melhor separação na figura (b). 
 
 
(a) Eluição por gradiente linear 
 
 
(b) Eluição por gradiente com intervalo isocrático 
 
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3.4 – Detectores para CLAE ou HPLC 
Assim como acontece em cromatógrafos gasosos, em CLAE, o detector é o componente 
que gera um sinal elétrico proporcional à quantidade de mols de analito que chega até ele. 
Após a separação ocorrida na eluição pela coluna cromatográfica, cada constituinte chega 
separadamente ao detector e tem seus respectivos sinais detectados e monitorados. 
Respeitados os limites inferior e superior de concentração, em CLAE, a área do pico 
também é diretamente proporcional à concentração, de modo que é possível estabelecer 
uma equação linear que correlacione área do pico (variável y) com a concentração (variável 
x), chamada reta de calibração. 
Podemos destacar algumas características desejáveis para detectores: 
o fornecer, em uma ampla faixa, área diretamente proporcional à quantidade de mols (linearidade); 
o elevada sensibilidade; 
o boa capacidade de identificação e quantificação de substâncias; 
o estabilidade de leitura e boa precisão; 
o robustez em relação a variações de temperatura, de pressão e de fase móvel; 
o elevada especificidade em relação ao analito; 
o de fácil operação e manutenção; e 
o não ser destrutivo (não destruir a amostra analisada). 
Os principais detectores utilizados em cromatógrafos líquidos (CLAE) são: 
o Espectrofotômetros UV-VIS (espectroscopia de absorção molecular); 
o Detector de Fluorescência (espectroscopia de emissão molecular); 
o Detector por espalhamento de luz; 
o Detectores eletroquímicos (ex: amperométrico, condutométrico, polarográfico e potenciométrico, 
detector sensível à constante dielétrica); 
o Detector de índice de refração; e 
o Espectrômetro de massa. 
Apresento abaixo um quadro comparativo da sensibilidade dos diferentes detectores e na sequência 
falaremos um pouquinho sobre alguns deles. 
Quadro comparativo da sensibilidade de diferentes detectores5 
Detector Limite de detecção (ng) 
UV-VIS 0,1-1,0 
Fluorescência 0,001-0,01 
Espalhamento de luz 0,1-1 
Eletroquímico 0,01-1 
Índice de refração 100-1000 
Espectrometria de massa 0,1-1 
 
5 HARRIS, Daniel C. Química analítica quantitativa. Rio de Janeiro: LTC Editora, p. 469, 2001. 
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3.4.1 – Detectores espectrofotométricos 
Detectores espectrofotométricos são os mais utilizados em CLAE e englobam os detectores UV-VIS e os 
por fluorescência. A diferença básica entre ambos: 
o UV-VIS: baseia na absorção de radiação eletromagnética pelas espécies analisadas. 
o Fluorescência: baseia na emissão de radiação eletromagnética pelas espécies analisadas. 
Outra diferença é que, conforme tabela acima, detectores por fluorescência são muito mais sensíveis que 
detectores UV-VIS (NOTA: explico o motivo dessa diferença em nossa aula sobre espectroscopia UV-VIS, 
não deixe de revisá-la. Nela discuto de forma mais aprofundada o funcionamento dos detectores 
espectrofotométricos). 
Em uma rápida revisão de nossa aula sobre espectroscopia UV-VIS, destaco cinco componentes (ilustrados 
na figura abaixo) principais dos equipamentos espectroscópicos: (1) uma fonte emissora de radiação 
eletromagnética; (2) um seletor de comprimento de onda que permite a passagem apenas da faixa da luz 
de interesse para a análise; (3) um recipiente para amostra; (4) um detector que transforma o sinal luminoso 
em corrente elétrica; e (5) um processador eletrônico associado a um display de saída de sinal, que, nos 
equipamentos atuais, pode ser um microcomputador configurado com o software do equipamento. 
 
Componentes principais de um espectrofotômetro de absorção molecular UV-VIS 
Os detectores UV-VIS e por fluorescência para CLAE apresentam a mesma configuração acima com uma 
única diferença, como a análise é em fluxo, há uma célula de fluxo, ilustrada abaixo, no lugar da cubeta. 
 
Célula de leitura em fluxo (dispositivo que substitui a cubeta