Introdução aos exames complementares - aula 1

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Introdução aos exames 
complementares 
- Os exames laboratoriais influenciam em 70% da 
decisão médica. 
- Há uma complexidade além de uma simples 
comparação com valores de referência. 
- Nem sempre o valor “mais comum” é o normal 
para todos os pacientes. 
- É importante fazer a curva de acompanhamento, 
mesmo que o valor do paciente esteja dentro da 
referência. → observar se os valores estão 
aumentando ou diminuindo. 
 
 
 
- A seleção de exames depende do objetivo clínico 
para a sua realização e da população de pacientes 
que está sendo analisada. 
- Os resultados de exames laboratoriais ajudam 
na: 
 
 
 
 
 
 
 
- O propósito de todos os exames é reduzir a 
incerteza clínica. 
- Muitos diagnósticos só podem ser estabelecidos, 
as etiológicas confirmadas ou a terapia apropriada 
com o emprego desses exames. 
 
Sensibilidade e Especificidade 
- Tais conceitos levam em consideração um 
método, exame ou molécula a ser detectada. 
Sensibilidade: Capacidade do exame de detectar 
pacientes com alguma doença específica. 
- Um método sensível é possível detectar a doença 
bem no início. 
- Com uma alta sensibilidade é possível detectar 
um marcador em pequenas concentrações, ou 
seja, está no início da doença. Se a sensibilidade 
for baixa, os marcadores só são detectáveis 
quando já está há um tempo no organismo, em 
concentrações maiores. 
 
Especificidade: Descreve o grau com que a 
anormalidade do teste se restringe a doença em 
questão. 
- Uma alta especificidade marca a doença 
especifica que queremos. 
 
Qual o melhor teste? Alta sensibilidade ou alta 
especificidade? 
 
 
 
→Para diagnóstico é preferível uma alta 
sensibilidade, a fim de detectar a doença. 
→Para monitorar pode ser usada uma baixa 
especificidade, pois já conhecemos a doença. 
- Para diagnóstico de câncer, por exemplo, é 
melhor que o marcador seja o mais sensível 
possível. E mais especifico para saber qual o 
câncer. Depois pode ser usado um menos 
especifico para acompanhamento, pois já 
sabemos o tipo de câncer. 
 
- Quanto mais falso negativo → compromete a 
sensibilidade. 
- Quanto mais falso positivo → compromete a 
especificidade 
 
 
o Descoberta de doenças ocultas; 
o Prevenção de danos irreparáveis; 
o Diagnóstico precoce após o início dos 
sinais ou sintomas; 
o Estimativa da atividade da doença; 
o Detecção de recorrência da doença; 
o Monitorização do efeito de terapia; 
o Aconselhamento genética em 
condições hereditárias; 
o Problemas médico-legais, como o teste 
de paternidade. 
Pode ser que esteja com 
anormalidade, mas ainda não 
atingiu o valor de referência, pois o 
marcador ainda não foi detectável. 
- Deve-se saber o objetivo clínico. 
- Observar a curvar de ROC → 
correlacionar os dois parâmetros. 
Reprodutibilidade e exatidão 
Reprodutibilidade: é a capacidade do laboratório 
de obter o mesmo resultado, em longos períodos, 
quando o exame é efetuado repetidamente com a 
mesma amostra. 
➔ Na pratica isso não acontece devido a 
imperfeição humana e dos equipamentos. 
➔ Estes desvios do valor real são geralmente 
randômicos. 
 
- Mas ideal é que os valores sejam os mais 
próximos possíveis → menor desvio → menor 
coeficiente de variação → melhor 
reprodutibilidade. 
- O laboratório quase sempre transforma o desvio 
padrão numa percentagem do valor médio que é 
o coeficiente de variação (CV) e considera o limite 
aceitável de erro = 2 desvios padrão. 
- A variação do valor médio é expressa em termos 
de desvio padrão (DP). 
+3 +2 +1 0 -1 -2 -3 
Se o desvio foi de +2 significa que o valor foi a 
média + 2 vezes o desvio padrão. 
Média: 80 
Desvio padrão: 3,5 
Uma variação de 2 desvios → 87 (80+3,5+3,5) 
 
- Quanto pior for a reprodutibilidade (CV mais 
alto), menor a precisão. 
- Uma boa reprodutibilidade em si não assegura a 
exatidão. E sim a precisão. 
Exatidão: Resultado real que deve ser obtido 
através do teste. 
Precisão: Capacidade do método de fornecer 
resultados reprodutivos (próximos entre si) de 
uma série de análises repetitivas de uma amostra. 
Tem a ver com a reprodutibilidade. 
 
- Reprodutibilidade → mesmo método sendo 
realizado em dias diferentes ou em longos 
períodos. 
- Repetitividade → mesmo método sendo 
realizado no mesmo dia/simultaneamente. 
 
 
 
 
Amostras controles 
- O laboratório avalia as amostras conhecidas 
como controles. 
 
 
→Entretanto, algumas alterações podem não 
afetar todas as amostras, por exemplo, os 
controles. 
Algumas alterações são próprias de cada amostra 
→ importante saber identifica-los diante de cada 
amostra. 
-Hemólise 
-Lipemia 
-Erro de pipetagem 
-Troca de material de pacientes, etc. 
 
 
Acontece por acaso. 
Valores de determinação 
previamente conhecidos. 
Para uma boa reprodutibilidade/ 
repetitividade os resultados devem ser os 
mais próximos possíveis em todas as 
replicatas. 
 
 
Faixas normais de referência 
- O uso de faixas normais consiste em admitir que 
todas as pessoas que não demostram sintomas ou 
sinais clínicos de qualquer doença são normais. 
 
Problemas com uso de faixas de referência: 
- Pessoas clinicamente normais podem apresentar 
doença subclínica ou não detectada e serem 
incluídas dentro do grupo normal de acordo com 
as faixas normais. 
- As faixas normais são algumas vezes calculadas 
utilizando um número pequeno de valores para 
ser estatisticamente confiáveis. 
- A população a partir da qual são obtidas as 
amostras para determinação das faixas normais 
podem não ser representativa da população 
testada. 
 
 
- Os valores obtidos por um método analítico 
podem ser inadequadamente utilizados para 
outros métodos. 
- Também ocorre variações como o mesmo 
método e equipamentos diferentes. 
- Dependendo da amplitude da faixa normal, um 
paciente pode ter alteração significativa no 
resultado do exame sem ultrapassar os limites 
normais. 
(sempre bom olhar o resultado anterior para 
comparar). 
 
Problemas comuns no laboratório clínico 
- Contaminação de amostras; 
- Amostras colhidas sem respeitar os horários ou 
condições determinadas; 
- Vários erros de coleta; 
- Má conservação das amostras; 
- Vários erros de coleta; 
- Má conservação das amostras; 
- Variações metabólicas normais, sexo, idade, 
período do dia, stress, etc. 
- Efeitos de medicamentos; 
- Repetições desnecessárias de exames; 
- Solicitação de exames desnecessários. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pode haver diferença de sexo, 
localidade, raça, idade, dieta, etc. 
 
 
Aula prática 1 
 
Ferramentas para utilizar nas análises 
bioquímicas 
- Para análises bioquímicas pode usar soro ou 
plasma, mas de uma maneira geral, usa-se mais 
soro. 
Ferramentas gerais 
- EPIs (equipamento de proteção individual). 
→ Luvas (ter cuidado para não manusear 
nada após estar com as luvas, retirar da 
forma correta, descartar da forma correta). 
→ Mascaras de proteção 
→ Touca (com cabelos presos) 
→ Óculos de proteção 
→ Jaleco de mangas longas 
→ Sapato fechado 
- EPCs (equipamento de proteção coletivo). 
- Piso não escorregadio 
- Boa iluminação para analisar as amostras. 
 
Para métodos manuais ou semiautomatizados 
- Pipetas semi automáticas (saber manusear) 
- Observar a posição de segurar, observar o 
volume indicado na pipeta, pipetar de 
forma vertical. 
- 1º parada → aspirar 
- 2º parada → desprezar todo o volume 
- Descartar → botão de descarte 
- Evitar a formação de espumas → Ter 
cuidado na velocidade de pipetagem → 
uma velocidade muito rápida gera espuma. 
- Trocar a ponteira a cada reagente 
manuseado. 
- Homogeneizar o tubo. 
- Incubação em banho maria. 
- Ajustar a temperatura 
- Tempo para incubação 
- Leitura da absorbância em espectrofotômetro. 
 
→É importante manter a metrologia dentro de um 
laboratóriomanual → assegura a qualidade dos 
resultados dos exames. 
 
Metrologia → calibração das pipetas, manutenção 
da refrigeração dos laboratórios, dos 
equipamentos. 
Garante uma maior segurança na 
realização dos exames de forma manual. 
É necessário pastas de manutenção dos 
equipamentos, pipetas (certificados de 
calibração). 
 
Para métodos automatizados totais 
- Agulhas de aspiração no lugar da pipeta. 
- Sensores para saber se há bolhas, se a ponteira 
entortou. 
- Aviso sonoro para temperatura inadequada. 
- Aviso para manutenção do espectrofotômetro 
(como trocar a lâmpada). 
- Não é necessário fazer cada amostra por vez. 
- Apenas coloca todas as amostras, todos os 
reagentes e o equipamento faz tudo sozinho. 
- A grande diferença entre o método manual e 
automatizado é o controle de qualidade. 
- A automatização permite uma análise mais 
precisa. 
- Entretanto, a maquina não tem a capacidade de 
perceber quando os resultados dos exames não 
batem com a clínica do paciente, por exemplo. 
- Nós devemos saber cada etapa do processo de 
automação. 
- Como a máquina pipeta, como acontece 
as reações, quais os possíveis erros, 
quando esses erros são próprios da 
amostra (hemólise, turvação). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Espectroscopia de absorção 
Quando a radiação passa através de uma camada 
de um sólido, um líquido ou um gás, certas 
frequências podem ser seletivamente removidas 
por absorção, um processo pelo qual a energia 
eletromagnética é transferida para os átomos, 
íons ou moléculas que compõem a amostra. 
- Quando a molécula absorve energia, pode 
absorver na região do infravermelho, na luz visível 
ou na ultravioleta. 
Ao absorver no IV existe uma transição 
vibracional, no mesmo nível energético. 
Ao absorver no LV e no UV existe uma transição 
eletrônica, onde os elétrons saem de um nível 
mais baixo de energia para um nível mais alto. 
 
Espectroscopia Óptica 
→Se refere aos níveis de energia do visível. Mas 
como o UV e o IV tem características bem 
parecidas, eles também são considerados como 
espectroscopia óptica. 
 
→Consiste na interação da radiação 
eletromagnética (UV, visível ou IV) a matéria no 
estado sólido, líquido ou gás. 
- A interação ocorre pela absorção da luz (radiação 
eletromagnética) que pode ser detectada e 
quantificada. 
-A radiação vai incidir na amostra, uma parte dessa 
radiação pode ser refletida, uma parte pode ser 
espalhada, uma parte será absorvida e outra será 
transmitida. Mas o que interessa na análise é a 
intensidade absorvida, ela é que será 
determinada. 
 
 
 
Instrumentação 
- Simples, possui boa sensibilidade, baixo custo de 
análise, fácil operação, equipamento robusto e 
pouca interferência do ambiente. 
- Em uma determinada fonte de radiação passa 
pelo seletor de comprimento de onda para isolar a 
banda de radiação de interesse para a análise. A 
radiação de comprimento de onda selecionado 
atravessa a amostra e a radiação transmitida é 
detectada, medida e o sinal para leitura é 
processado e a partir disso será possível saber a 
quantidade de energia absorvida pela amostra. 
 
Espectrofotometria no ultravioleta/Visível 
(UV-vis) 
- A técnica de espectrofotometria no ultravioleta e 
visível tem diversas aplicações, principalmente na 
identificação de grupos orgânicos cromóforos e 
íons de metais de transição, que absorvem 
radiação nos comprimentos de onda do UV-vis. 
UV = 100 a 400nm visível = 400 a 780nm 
→O objetivo principal é a determinação da 
concentração de soluções/analitos. 
 
 
Fonte de luz: é composta por uma lâmina de 
deutério, que emite radiação UV, e uma lâmpada 
de tungstênio, que emite luz visível. 
Monocromador: dispositivos eletrônicos que 
transformam a luz incidida em vários 
comprimentos de onda em um único 
comprimento de onda em um único comprimento 
de onda, ou seja, luz monocromática. 
Detector: é um dispositivo que detecta a fração de 
luz que passou pela amostra e transfere para o 
visor e para o computador acoplado ao aparelho. 
Cubeta: recipiente utilizado para conter o material 
a ser analisado. São constituídas de vidro, sílica 
(quartzo) ou plásticas. 
 
Instrumento de feixe único: 
- São mais simples e de menor custo. 
- Adequados para medidas quantitativas de 
absorção em um único comprimento de onda. 
- Realizado em 2 etapas. 
- A radiação passa pela célula de referência, 
branco, para quantificar a absorção de energia. 
- Em uma segunda etapa, a radiação passa pela 
amostra, onde a energia de absorção também será 
quantificada. 
- A diferencia entre o valor da referência e da 
amostra será o valor para o analito na amostra. 
Branco: aquilo que não queremos considerar na 
análise. Por ex: se temos uma amostra diluída em 
solvente, devemos colocar o solvente no branco 
para descartar a energia absorvida por ele. 
Instrumento de feixe duplo 
- Oferecem a vantagem de compensar quaisquer 
flutuações rápidas na saída radiante da fonte. 
- Realizado em 1 etapa. 
- A radiação que passa no monocromador se 
divide, uma parte vai para a célula de referência e 
a outra para a amostra, as duas energias são 
detectadas e o aparelho já dá o valor da 
absorbância do analito. 
- Justamente por ter uma única etapa, a analise 
das duas amostras (branco e amostra) são 
realizadas simultaneamente, evita a possibilidade 
de possíveis interferentes no resultado final. 
 
Seleção do comprimento de onda para cada 
analito 
- É realizado uma varredura. A análise é feita em 
vários comprimentos de onda. E padroniza-se o 
comprimento de onda onde a amostra obteve a 
maior medida de absorbância (fotopíco). Pois a 
maior absorbância indica maior concentração do 
analito. 
- Ou seja, as medidas de absorbância são feitas em 
comprimentos de onda que correspondem ao 
máximo de absorbância. 
- Espectro de absorção da substância 
Variáveis que influenciam a absorbância: 
- Efeito e solvente, temperatura ou outras 
substâncias presentes na amostra, devem ter seus 
efeitos conhecidos e as condições para a análise 
escolhidas de maneira que a absorbância não seja 
afetada. 
Relação entre absorbância e concentração 
- Os padrões de calibração para uma análise 
espectrofotométrica devem ser os mais 
semelhantes possíveis em relação à composição 
global das amostras verdadeiras e devem 
abranger uma faixa razoável de concentração do 
analito. 
→Quanto mais concentrada uma solução é, maior 
é a quantidade de luz absorvida por ela 
(absorbância). 
Lei de Lambert-Beer 
→Quantificação do analito em termos de 
concentração. 
- Nos diz quantitativamente como a grandeza de 
absorção/absorbância depende da concentração 
de moléculas (c) e da extensão do caminho sobre 
o qual ocorre a absorção (b). 
- Ou seja, a absorbância depende da concentração 
e do percurso optico. 
Quanto maior o caminho, mais a radiação irá 
interagir com as espécies presentes, mais irá 
absorver. 
Quanto maior a concentração do analito, mais 
radiação irá interagir com as espécies presentes, 
mais irá absorver. 
Absorbância → diretamente proporcional a 
concentração e ao caminho optico. 
 
 
 
 
ε→ (épsilon) constante de proporcionalidade → 
absortividade. 
→A absorbância é diretamente proporcional a 
concentração. 
➔ É possível fazer um gráfico e determinar 
uma equação das soluções padrões. Para 
determinar a concentração de outras 
amostras (com a mesma solução padrão) 
basta substituir o valor da absorbância na 
equação. 
 
→Espectro de absorção da substância → gráfico 
que mostra como a referida substância absorve 
em cada um dos comprimentos de onda. Identifica 
o fotopíco, ou seja, o comprimento de onda onde 
há maior absorção da energia. 
→Curva padrão dasubstância/Curva de 
calibração→ gráfico que relaciona a absorbância 
com os valores de concentração a partir de um 
comprimento de onda especifico. 
Transmitância → expressa a quantidade de luz que 
se transmite através de uma solução. 
Absorbância → expressa a capacidade de uma 
solução de absorver uma quantidade de energia 
do feixe de luz incidente. 
Calibração do aparelho 
- Deve ser calibrado sempre que for ligado e 
sempre que tiver mudança no comprimento de 
onda. 
- Garantir que apenas a absorbância e 
transmitância da substância em análise seja 
medida. 
- O ajuste é feito baseado na transmitância (0% e 
100%). 
Ajuste de 100% → deve ser feito para que o 
espectrofotômetro desconsidere a luz absorvida 
pela cubeta e pelo solvente da solução. De modo 
que apenas o soluto da solução seja analisado. → 
branco 
Ajuste de 0% → é feita retirando a cubeta da porta 
cubetas. Ao retirar nenhuma luz vai atingir a 
fotocélula, o que significa que se tivesse uma 
solução, toda a luz teria sido absorvida.