Exame andrológico - prova prática

Prévia do material em texto

LIANA T. RIBEIRO
MANUAL DE ESPERMOGRAMA EM ANIMAIS
Manual referente ao espermograma em animais
apresentado ao Curso de Medicina Veterinária, Área das
Ciências Agrárias, da Universidade do Oeste de Santa
Catarina – UNOESC, como requisito parcial para aprovação
na componente curricular Fisiopatologia da Reprodução II.
Professor: Fabio José Gomes
Campos Novos – SC
2021
Introdução 3
Exame andrológico 4
Espermograma 4
Resfriamento e envasamento de sêmen 11
1. Introdução
A morfologia espermática está diretamente relacionada ao sucesso da interação
espermatozóide-ovócito e do desenvolvimento embrionário inicial, sendo necessário
que os gametas sejam morfologicamente normais. Em critérios práticos, a avaliação
individualizada do animal é uma das formas mais comuns de definir quando o macho
está apto à reprodução. Para isto, desenvolveu-se uma série de padrões seminais que
podem estar correlacionados com a fertilidade ou infertilidade dos animais. Nesta
análise são considerados diversos aspectos, entre eles podemos citar os
macroscópicos, como: cor, odor, volume e aspecto; microscópicos, como:
turbilhonamento, concentração espermática, motilidade, morfologia, vigor e aglutinação
espermática. A identificação de anormalidades na morfologia refletem a funcionalidade
do espermatozóide e consequente seleção do reprodutor.
2. Exame andrológico
A análise dos espermatozoides inicia com exame físico geral e específico do
animal com a coleta de dados referente a idade, raça, doenças prévias, palpação de
aprumos, análise de comportamento, se há ou não presença de ferimentos, avaliação
de boca e dentição e escore corporal. O objetivo nessa etapa é descartar qualquer
anormalidade a fim de evitar consequências indesejáveis e eliminar reprodutores
inaptos. O exame específico é realizado diretamente na bolsa escrotal com a palpação
e inspeção testicular, plexo pampiniforme, escroto, epidídimo, prepúcio, pênis e se há
ou não presença de hérnias. Nessa etapa, verifica-se dimensões, simetria, consistência
e a mobilidade de cada órgão, sendo que qualquer alteração observada deverá ser
anotada.
Na avaliação dos testículos, é importante que ambos estejam dentro da bolsa
escrotal, além disso, avalia-se tamanho, consistência, aderências, sensibilidade e
temperatura, sendo esta muito importante na maturação dos espermatozóides, visto
que uma temperatura maior que a normal inviabiliza a qualidade espermática.
A palpação do plexo pampiniforme visa buscar presença de estruturas anormais,
como nódulos (geralmente se formam por problemas de irrigação, consequentemente
diminui o controle de temperatura) ou presença de hérnias, sendo que qualquer
alteração deve ser anotada.
O escroto deve ser avaliado a fim de descartar qualquer lesão de pele, presença
de sensibilidade, aumento de temperatura, aderências e em relação ao perímetro,
sendo que o tamanho varia de acordo com a raça e espécie (região mais larga possui
maior produção espermática e maior precocidade).
O epidídimo deve estar aderido aos testículos, sendo que qualquer alteração ou
sensibilidade representa falha na maturação dos espermatozóides, e o exame é o
mesmo feito nos testículos.
Para avaliação do pênis e prepúcio, é observado se há exposição correta do
pênis, coloração da mucosa, aumento de volume, temperatura, presença de abcessos
e secreções anormais.
Os animais que não possuírem alterações e anormalidades durante o exame
físico geral e específico estão aptos para a realização de coleta do sêmen. Para a
coleta, é feita a limpeza do prepúcio com gaze e solução fisiológica a fim de minimizar
qualquer sujeira existente que possa prejudicar a avaliação seminal. A coleta é feita
com o uso do eletroejaculador (a longo prazo pode causar lesão) ou vagina artificial. O
eletroejaculador é inserido na região do reto e iniciado os estímulos elétricos que
variam de 1 a 3. Após o primeiro estímulo, é feita uma pausa de 20 a 30 segundos e
posteriormente inicia novamente o estímulo de forma mais intensa, sempre fazendo
pausas entre um e outro até o animal ejacular.
3. Espermograma
Após a coleta, o tubo contendo o ejaculado deve ser encaminhado
imediatamente ao laboratório e armazenado a 37 graus. Dentro do próprio tubo de
coleta é feita a avaliação macroscópica do volume, cor, odor e aspecto. O volume é
relativo e depende do método da coleta. O aspecto, odor e cor se referem a presença
de sangue, urina, pus ou qualquer outra alteração visual que possa indicar alterações
no ejaculado.
Após a análise macroscópica, segue-se para a avaliação microscópica iniciando
pelo turbilhonamento (somente em ruminantes). Para isso, é colocado uma gota de
sêmen puro sobre uma lâmina pré-aquecida a 37 graus e observado no microscópio na
objetiva de 10 ou 40 vezes a presença de ondas espermáticas. A escala de avaliação
varia de zero (ausência de movimento) a cinco (presença de movimentação),
entretanto, o turbilhonamento acentuado pode ser afetado pelo método de coleta,
tempo da coleta até a análise e temperatura.
A escala da avaliação de motilidade e vigor também variam de 0 a 5, porém,
para fazer a análise é necessário fazer uma solução de 2,9g de citrato de potássio
diluído em 1 litro de água destilada. Após isso, com o uso da pipeta, utiliza-se em
ovinos 1 microlitro de sêmen para 10 microlitros da solução, e com o uso de lâminula
observa-se no microscópio com objetiva de 10 ou 40 vezes a motilidade, referente a
movimentação dos espermatozoides (o ideal é todos no mesmo sentido até o oócito), e
o vigor, referente a força e a qualidade do movimento.
Posteriormente a isso, faz-se a análise da concentração do espermatozóide,
para avaliar o número de espermatozoides por unidade de ejaculado. É utilizado
solução formol salina, composta de 96 mL de solução usada para avaliar motilidade e
vigor com 4 mL de formol. Em sêmen fresco, utiliza-se 1 microlitro de sêmen para 200
microlitros de solução formol salina, e para sêmen congelado, utiliza-se 1 microlitro de
sêmen fresco para 20 microlitros de solução formol salina. Após isso, coloca-se uma
lamínula sobre uma câmera de neubauer com 10 microlitros da amostra e aguarda 5
minutos para que os espermatozoides decantem.
Após esse tempo, visualiza-se a câmera de neubauer no microscópio na objetiva
de 10 ou 20 vezes e conta-se 5 quadrados em diagonal nos dois compartimentos,
direito e esquerdo, e então, soma-se o resultado de ambos os lados e divide por 2 para
encontrar a média, sendo que a diferença entre os dois compartimentos não poderá
passar de 10%. Posteriormente, utiliza-se a fórmula de concentração para o resultado
final (concentração = média x diluição utilizada x altura da câmara de neubauer x
5 (número de quadrados contados) x 1000) e multiplica-se pelo valor em mL do
ejaculado total, para encontrar o número de espermatozoides naquele ejaculado, como
mostra o exemplo na imagem 1.
Imagem 1. exemplo utilizando a fórmula da concentração, onde:
Média = 210
Diluição utilizada no dia de aula prática = 100
Número de quadrados contados = 5
Altura da câmera de neubauer = 10
Volume do ejaculado = 0,8 mL
Para análise morfológica dos espermatozóides, deve-se levar em consideração
a morfologia normal do espermatozóide (imagem 2). Utiliza-se 100 microlitros de
solução formol salina para 1 microlitro de ejaculado. A diluição é colocada sobre a
lâmina e realizado o esfregaço e coloração com panótico rápido. É observado no
microscópio na objetiva de 100 vezes com o uso de óleo de imersão. É contado 200
espermatozoides em campos aleatórios e feito a média de espermatozoides
defeituosos.
Os defeitos dos espermatozoides são divididos em defeitos maiores e menores.
Alguns dos defeitos observados em aula prática estão listados na tabela 1 e ilustrados
nas imagens 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9.
Outros métodos utilizados em aula prática para avaliar morfologia foi a coloração
de rosa bengala, eosina e nigrosina. Para a coloração de rosa bengala, foram utilizados
5 microlitros de sêmen e 5 microlitros de rosa bengala e colocados sobre uma lâminae
observado na objetiva de 100 vezes com óleo de imersão. Na coloração com eosina e
nigrosina, foi utilizado 20 microlitros de sêmen para 20 microlitros de eosina e nigrosina
em uma lâmina, seguida de esfregaço, secagem e visualização, onde somente os
espermatozóides com coloração esbranquiçada foram ser considerados vivos.
Tabela 1. Principais defeitos espermáticos observados em aula prática.
Defeitos observados Provável causa
Knobbed sperm Estresse térmico ou má formação no
acrossoma
Cabeça piriforme Genética ou estresse térmico
Cabeça estreita Genética ou estresse térmico
Cabeça isolada Estresse térmico
Cabeça microcefálica Estresse térmico
Gota citoplasmática proximal Desenvolvimento incompleto
Estreito na base Genética ou estresse térmico
Cauda fortemente enrolada ou dobrada Estresse térmico
Imagem 2. morfologia espermática normal.
Imagem 3. knobbed sperm.
Imagem 4. cabeça piriforme.
Imagem 5. cabeça isolada.
Imagem 6. cabeça microcefálica.
Imagem 7. gota citoplasmática proximal.
Imagem 8. estreito na base.
Imagem 9. cauda fortemente enrolada.
4. Resfriamento e envasamento de sêmen
Para o resfriamento do sêmen, foi feita uma solução básica de diluição, também
chamada de extensor. A composição e valores utilizados estão descritos na tabela 2.
Tabela 2. composição da solução para o resfriamento do sêmen.
Composição Quantidade (g)
Frutose 2,024
Ácido cítrico 1,488
Triz 3,605
Água deionizada 90 mL
Gema de ovo 10 mL
Primeiro, pesou-se cada um dos componentes colocando-os em um becker,
após isso, misturou-se 90 mL de água deionizada, 10 mL de gema e o sêmen do
animal (a quantidade utilizada depende da espécie), levando para a refrigeração de 5 a
10 graus. Próximo ao envasamento (a fresco) deve ser colocado o restante dos
diluentes e por último o glicerol (em caso de congelamento) e a penicilina, mas em aula
prática foi utilizado 3 mL de gentamicina.
Após esse processo, foi utilizado em aula prática uma caixa de isopor com
bandejas de gelo e a solução preparada com o objetivo de manter a mesma
temperatura da refrigeração. No mesmo instante, foi feito o envase das pipetas com o
fechamento das mesmas. Posteriormente a isso, as pipetas preparadas foram
mergulhadas em nitrogênio líquido durante 20 minutos com o objetivo de atingir 196
graus negativos. Após esse tempo, as pipetas foram retiradas e armazenadas em um
botijão de nitrogênio.