Métodos de diagnósticos - Cap 2 do Bogliolo

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MÉTODOS DE ESTUDO EM 
PATOLOGIA 
A patologia pode ser estudada por 
meio de procedimentos convencionais 
(pela análise macro e microscópica) e 
por novos instrumentos de estudo 
CITOPATOLOGIA 
É o estudo das células doentes que 
estão presentes em coleta de 
secreções, raspagem ou escoriação de 
superfícies, lavagem e coleta de 
líquido, aspiração e líquidos eliminados 
naturalmente 
Importante na detecção de neoplasias 
malignas e agentes infecciosos e 
parasitários 
 Exemplo de neoplasia maligna: 
exame colpocitólogico para 
detecção precoce de câncer do 
colo uterino 
Vantagem: simples, fácil, barato e 
rápido 
Desvantagem: não pega a arquitetura 
tecidual, pouco material coleto e 
necessita de treinamento específico 
O método mais utilizado da 
citopatologia é a PAAF (punção 
aspirativa por agulha fina) 
Líquidos: PAAF 
Fixador: álcool etílico 95% 
 O álcool de 70% matam 
microrganismos, enquanto o de 
95% apenas fixa 
A coleta pode ser feita por espátulas 
cervicais de ayre, swabs, escovas 
cervicais e paaf 
A coloração pelo método de 
Papanicolau exige que o esfregaço 
seja fixado ainda imediatamente, ainda 
úmido, enquanto as colorações pelo 
método hematológico, exige que os 
esfregaços estejam secos antes da 
fixação 
Secreções ricas em muco ou em 
proteínas podem ser guardadas em 
geladeira por até 1 dia antes de serem 
encaminhadas ao laboratório 
 Se for um líquido pobre, só 
deve ser mantido por poucas 
horas 
A coloração universal dos esfregaços 
celulares é a de Papanicolau, mas 
outros corantes também podem ser 
usados 
O resultado do exame citológico é 
fornecido em termos do diagnóstico 
morfológico das doenças e 
complementando, quando possível, 
com outros dados de interesse clínico 
COMO OCORRE A COLETA POR PAAF? 
Penetra-se a agulha na lesão e puxa-
se o embolo, coleta-se o material 
líquido, coloca-se na lamina, fixa-se e 
depois cora-se 
Pode-se usar a ultrassom para fazer a 
coleta de um nódulo 
COLETA DE CITOPATOLOGIA POR 
PAPANICOLAU 
Coloca-se o especulo na vagina e 
através do swabs ou das escovas 
cervicais, eu penetro e faço um 
raspado do colo uterino 
O material precisa ser fixado a álcool 
etílico 95% 
Classificação de Papanicolau: 
Classe 0: material inadequado ou 
insuficiente (repetir a coleta) 
●
 
Classe I: normal 
Classe II: atipias celulares, porém não 
associadas a malignidades 
 Refere-se em geral a processos 
inflamatórios 
Classe III: duvidoso para malignidade 
Classe IV: sugestivo mas não 
conclusivo de malignidade 
Classe V: positivo para malignidade 
ANATOMOPATOLOGIA 
Patologia cirúrgica é o estudo 
anatomopatológico de órgãos ou suas 
partes retirados cirurgicamente 
(biópsias ou peças cirúrgicas) 
Modalidades: material incluído em 
blocos de parafina ou biópsia por 
congelação 
Coloração: hematoxilina-eosina 
O exame histopatológico precedido de 
um procedimento cirúrgico, pode ser 
dividido em: 
• Biópsia incisional (retirada 
parcial) 
• Biópsia excisional ou ablativa 
(retirada total) 
• Peça cirúrgica 
• Autópsia/Necrópsia 
Biopsias de lesões ulceradas devem 
conter a margem de transição entre a 
úlcera e os tecidos adjacentes e 
subjacentes 
Uma biopsia superficial pode conter 
somente material necrótico-
inflamatório, não atingindo as lesões 
graves subjacentes 
Punção-biópsia de lesões nodulares 
viscerais necessita do auxílio de 
equipamentos especiais, como raios X 
e ultrassom 
BIÓPSIA INCISIONAL 
É retirado uma parte da lesão e uma 
área marginal do tecido normal para a 
comparação 
Maior parte da lesão continua no 
paciente 
Esse tipo de biópsia serve para indicar 
qual é o tratamento mais adequado 
para a lesão 
A PAAG é uma biópsia incisional 
BIÓPSIA EXCISIONAL 
É retirado toda a lesão, com uma 
pequena margem de tecido normal, 
como segurança 
PEÇA CIRÚRGICA 
É a retirada total ou parcial de qualquer 
órgão 
Constitui-se tratamento cirúrgico de 
doenças variadas, neoplásicas ou não 
Pode ser simples (retira-se apenas o 
órgão) ou composta (retira-se o órgão 
e o que tem ao redor) 
Fixador: formaldeído 4% (ou seja, 
formol bruto a 10%) 
O QUE DEFINE O TIPO DE PROCEDIMENTO 
UTILIZADO? 
• A clínica do paciente 
• Suposições sobre a lesão 
• Idade do paciente 
Os materiais coletados por 
anatomopatologia são fixados a formol 
bruto a 10% 
 o formol precisa ser de 6 a 10 
vezes o volume da peça 
●
 
 o frasco precisa apresentar a 
boca larga e fechado de modo 
que evite a evaporação do 
fixador 
Peças achatadas ou biópsias de certos 
órgãos podem ser fixadas em placas 
de cortiça ou de papel, a fim de se 
evitarem dobras ou retrações que 
prejudicam a boa avaliação 
Quando o material é encaminhado ao 
laboratório, necessita-se de uma 
requisição que constem os dados do 
paciente, informes clínicos relevantes, 
resultados de exames complementares 
e hipóteses diagnósticas 
PAAG (PUNÇÃO POR AGULHA GROSSA) 
É retirado um fragmento do tecido para 
a análise 
Vantagens: rápida, fácil de realizar, 
anestesia local, dispensa internação e 
diminui os custos 
Normalmente é utilizada em tumores 
na mama, próstata e biópsia da medula 
óssea 
ETAPAS DA TÉCNICA HISTOPATOLÓGICA 
• Cirurgia + preenchimento de 
requisição + exames 
complementares 
• Recepção 
• Análise macroscópica 
• Clivagem (retirada de 
fragmentos representativos) 
• Processamento laboratorial 
(manual ou automático) 
 Desidratação em álcool 
 Diafanização 
(clareamento) em xilol 
 Impregnação 
 Inclusão em parafina 
Os fragmentos de tecido são cortados 
em micrótomo, desparafinizados e 
corados 
Coloração universal: hematoxilina-
eosina (HE) 
• Análise microscópica 
• Resultado – laudo 
Nos casos de urgência pode-se usar o 
método de congelação rápida nos 
tecidos e corte em micrótomos 
especiais (criostatos) 
 O exame por congelação é 
empregado sobretudo no 
diagnóstico pré-operatório 
Microscópio de contraste de fase 
permite a análise de células vivas não 
coradas 
Microscópio invertido é apropriado 
para estudo de células em cultura 
Microscópio de fluorescência serve 
para examinar elementos fluorescentes 
nativos ou em reações de 
imunofluorescência (aumento 1000x) 
Microscópio confocal permite a 
análise morfológica em planos de 
diversas profundidades 
Microscópio eletrônico de varredura 
mostra detalhes da superfície natural 
ou de fratura de diversas estruturas 
AUTÓPSIA OU NECROPSIA 
É a retirada de órgãos (total ou parcial) 
ou partes no post mortem para 
determinar a causa da morte e 
conhecer as lesões e doenças 
existentes no indivíduo 
Médico-científicas: correlaciona os 
achados morfológicos com os clínicos – 
todos os órgãos dissecados são 
examinados detalhadamente 
●
 
Médico-legais: determina a causa da 
morte – exame dos órgãos + coleta de 
sangue e secreções para toxicologia 
 Obrigatória por lei nos casos de 
morte violenta 
A autópsia também pode ser parcial, 
quanto apenas alguns órgãos são 
removidos através de incisões 
regionais, de reabertura de incisões 
cirúrgicas prévias ou de punção com 
agulha 
IMUNO-HISTOQUÍMICA 
Utiliza anticorpos como reagentes 
específicos para detecção de 
antígenos presentes em células ou 
tecidos 
 Técnica essencialmente 
qualitativa 
A imuno-histoquímica também é 
utilizada para identificar elementos 
estranhos, como microrganismos de 
difícil reconhecimento, como vírus, 
fungos, bactérias e outros agentes 
infecciosos 
Objetivo da imuno-histoquímica: 
encontro e a localização topográfica de 
antígenos em tecidos 
O produto da reação imuno-
histoquímica deve ser sempre 
interpretado em conjunto com os 
achados morfológicos, e não 
simplesmente em termos de reação 
positiva ou negativa 
Um antígeno em células ou tecidos 
pode ser reconhecido por sua ligação 
ao anticorpo seguida da aplicação de 
um sistema de detecçãoimunofluorescente preparado para 
identificar a imunoglobulina utilizada 
inicialmente como anticorpo primário 
Os anticorpos devem ser marcados 
com substâncias fluorescentes e 
enzimas 
 A imunofluorescência e as 
técnicas imunoenzimáticas são 
comumente utilizadas em 
microscopia de luz 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
Pode ser direta ou indireta 
Método direto: o anticorpo primário se 
liga a um composto fluorescente 
(isotiocianato de fluoresceína) 
Método indireto: o anticorpo primário 
se liga ao antígeno de interesse 
 Específica, já que o anticorpo 
se encontra livre do marcador 
A substância fluorescente é conjugada 
a um anticorpo secundário que 
reconhece a porção Fc do anticorpo 
primário e com ele forma uma reação 
específica 
TÉCNICAS IMUNOENZIMÁTICAS 
Técnica que emprega imunoglobulinas 
marcadas com enzimas 
Enzima mais utilizada: peroxidase 
O substrato da peroxidase (H2O2), na 
presença de uma substância doadora 
de elétrons, gera um produto 
cromógeno que se precipita no local 
 Exemplo de substância 
cromógena: tetra-hidrocloreto 
de 3,3’ – diaminobenzidina 
(DAB) 
O DAB confere coloração marrom-
escura ao sítio da reação 
 Uma vez corados, os cortes 
podem ser desidratados em 
álcool e xilol, montados entre 
●
 
lâmina e lamínula e 
armazenados indefinidamente 
para análises posteriores 
Além desses métodos 
imunoenzimáticos, há duas novas 
estratégias: a da peroxidase-
antiperoxidase (PAP) e a da avidina-
biotina-peroxidase (ABC) 
Método PAP: 
consiste na reação 
em cadeia de três 
anticorpos 
O anticorpo primário 
reage com o antígeno-
alvo e o anticorpo 
secundário reage com a 
fração Fc do anticorpo 
primário. O anticorpo 
terciário é um complexo 
antígeno-anticorpo 
formado por duas 
imunoglobulinas e três 
moléculas de peroxidase 
 Esse método tem maior 
sensibilidade do que o método 
indireto 
Método ABC: o 
anticorpo primário 
livre reage apenas 
com o antígeno de 
interesse 
O anticorpo secundário fica 
ligado a moléculas de 
biotina, que tem forte 
afinidade por moléculas de 
avidina. 
 Avidina e biotina formam 
complexos estáveis 
Os métodos PAP e ABC apresentam 
elevada sensibilidade, o que permite a 
identificação de um elevado número de 
sítios antigênicos em células e tecidos, 
mesmo em amostras fixadas de modo 
rotineiro 
 São melhores porque 
apresentam excesso de 
moléculas de peroxidase 
Os fixadores paralisam a autólise e 
imobilizam os componentes teciduais, 
mantendo as relações estruturais entre 
seus constituintes e a morfologia 
aproximada de cada célula ou tecido 
O formol tamponado e o fixador de 
Bouin são adequados para a 
preservação dos antígenos 
APLICAÇÕES 
A classificação precisa de muitas 
neoplasias depende essencialmente do 
encontro de marcados antigênicos só 
identificáveis por reações com seus 
anticorpos 
Outra aplicação da imuno-histoquímica 
em neoplasias é a pesquisa de 
receptores para hormônios ou para 
fatores de crescimento em tumores 
malignos 
A imuno-histoquímica também é 
aplicada na identificação da sede 
primária de tumores desconhecidos 
quando se analisam amostras de suas 
metástases 
CULTURA CELULAR 
Consiste na manutenção e na 
multiplicação in vitro de células vivas 
 São populações celulares 
homogêneas, sem interferência 
de outros tipos celulares 
As células obtidas são mantidas no 
interior de recipientes apropriados em 
suspensão ou aderidos a uma 
superfície solida ou semissólida 
Meio mínimo: contém aminoácidos 
essenciais, vitaminas e sais 
●
 
Meio completo: além dos 
componentes mínimos, contém 
outros metabólitos, nutrientes, 
minerais 
Os fracos que contêm as células são 
mantidos em estufas a temperaturas e 
condições ambientais apropriadas 
Para manutenção, o meio deve ser 
trocado a intervalos regulares, de modo 
a garantir a remoção de produtos do 
metabolismo celular e assegurar a 
concentração ideal de todos os 
metabólitos 
APLICAÇÕES 
In vitro: ausência de elementos 
reguladores da homeostase 
 Análise do metabolismo e do 
comportamento celular 
No ambiente em que as células são 
mantidas, a arquitetura tecidual, as 
relações mecânicas e as comunicações 
entre as células ficam perdidas ou 
simplificadas 
CITOMETRIA 
Consiste na determinação 
quantitativa de componentes 
celulares 
O método baseia-se na ligação 
específica de uma substância a 
determinado componente celular 
Existem dois tipos de citometria: 
citofotometria e citometria de fluxo 
Citofotometria: a estrutura ou 
componente celular é corado 
especificamente por meio de uma 
reação histoquímica 
 Se apenas esse elemento for 
corado, vai ocorrer uma 
interferência na passagem de 
luz 
 Um sensor é colocado após a 
preparação corada para captar 
e quantificar a intensidade de 
luz que chega 
Determina-se a quantidade de 
substância presente na amostra que 
reagiu pela comparação com a 
quantidade de luz que passa e pela 
que não passa pela estrutura corada 
A citofotometria permite a análise de 
células individuais 
 Na patologia, determina o 
conteúdo de DNA nuclear 
presente em lesões 
proliferativas, principalmente em 
neoplasias malignas 
Citofotometria: utiliza células coradas 
em esfregaços ou em cortes 
histológicos 
Citometria de fluxo: é realizada com 
células em suspensão 
 Identifica e quantifica as 
populações celulares 
especificas normais ou 
cancerosas, além de fornecer o 
conteúdo de várias moléculas 
 A célula é tratada com 
fluorocromo 
Ao identificar tipos celulares 
específicos por meio de marcadores 
específicos, a intensidade do 
fluorocromo é captada e transferida 
para um computador que fornece os 
resultados quantitativos 
MORFOMETRIA 
A morfometria fornece dados 
numéricos obtidos a partir de 
quantidades, dimensões e cores de 
estruturas celulares/teciduais 
●
 
Identifica a quantidade de leucócitos 
presentes em um corte histológico: 
• (+) inflamação discreta 
• (++) inflamação 
moderada/acentuada 
• (+++) número crescente de 
leucócitos 
HIBRIDAÇÃO MOLECULAR 
As técnicas de hibridação repousam na 
própria estrutura dos ácidos nucleicos 
A estrutura secundária do DNA é 
formada por uma dupla hélice 
estabilizada por pontes de hidrogênios, 
que podem ser desfeitas pelo calor ou 
por agentes químicos: a desnaturação 
 Entretanto, assim que o agente 
desnaturante é retirado, as duas 
fitas voltam a se juntar 
Como o sistema não tem memória, 
uma fita simples de DNA desnaturado 
pode se associar à fita da qual se 
separou ou a outra de sequência 
complementar introduzida no meio: é a 
hibridação 
Sonda é a sequência responsável por 
reconhecer o segmento procurado na 
hibridação 
SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS 
Uma sonda é um segmento de DNA ou 
de RNA obtido por clonagem molecular 
ou por síntese química 
 A sonda é complementar a uma 
sequência alvo (a de interesse) 
 Contém uma marca que permite 
a sua visualização seletiva 
As sondas de DNA são as mais 
comuns e comportam-se como 
anticorpos usados na imuno-
histoquímica 
Vantagens: estabilidade, não depende 
da expressão gênica na amostra em 
estudo 
As sondas são marcadas com 
compostos radioativos, como 32P ou 
33p, ou ainda, pelas chamadas sondas 
frias 
 Sondas frias: é quando o 
composto radioativo é 
substituído por substâncias 
fluorescentes ou acopladas a 
enzimas 
AMOSTRAS 
Qualquer material biológico obtido por 
autópsias, biópsias, raspados 
celulares, punções, secreções e outros 
fluidos orgânicos podem ser analisados 
por técnicas de hibridação 
Com exceção da hibridação in situ, em 
que são analisados tecidos ou células, 
nas demais técnicas trabalha-se com 
os ácidos nucleicos em suspensão 
REAÇÃO DE HIBRIDAÇÃO 
Nessa reação, tanto a sonda como a 
sequência-alvo são desnaturadas 
pelo calor e em seguida, ambas ficam 
em contato para que ocorra a 
hibridaçãopropriamente dita 
Nas sondas radioativas, a revelação é 
feita por autorradiografia. Já nas 
sondas frias, o resultado aparece 
como composto fluorescente ou 
corado 
Hibridação in situ: a sequência-alvo 
encontra-se no seu sítio nativo (célula 
ou tecido) 
 Indica a localização precisa da 
sequência de interesse em um 
tecido ou célula 
 Se a reação de hibridação 
utilizar compostos 
●
 
fluorescentes, a hibridação in 
situ com fluorescência, a 
técnica identifica a localização 
de um gene em cromossomos 
Blot ou transferência: é quando o 
DNA ou RNA alvo é extraído das 
amostras e imobilizado por absorção 
em membranas de náilon ou 
nitrocelulose 
Southern Blot: o material imobilizado 
e a sonda são de DNA 
 O DNA é clivado por enzimas 
de restrição e os fragmentos 
são separados por eletroforese 
Northern Blot: o material fixado é um 
RNA e a sonda é um cDNA 
 O RNA é clivado por enzimas 
de restrição e os fragmentos 
são separados por eletroforese 
Western Blot: o material e a sonda 
são proteínas, geralmente um anticorpo 
South Western Blot: o material é uma 
proteína e a sonda é um DNA 
As hibridações em membranas, 
Southern ou Northern Blot, apresentam 
altas sensibilidade e especificidade 
REAÇÃO EM CADEIA DA 
POLIMERASE(PCR) 
A técnica se baseia em uma reação de 
amplificação de sequências específicas 
de DNA, que se repetem por inúmeros 
ciclos 
Para essa amplificação de RNA 
acontecer, o RNA precisa ser 
convertido em DNA complementar 
(cDNA) 
 Essa conversão acontece pela 
enzima transcriptase reserva 
Na reação de amplificação, as duas 
fitas de DNA são separadas pelo calor 
e, em seguida, dois iniciadores ligam-
se à essas duas fitas e flanqueiam a 
região a ser amplificada 
 A partir do iniciador, a DNA 
polimerase vai copiar o 
segmento de DNA desejado 
Desnaturação – hibridação com 
iniciador – copias de DNA 
Essa técnica permite identificar as 
alterações genômicas e a presença de 
mRNA que podem ser úteis no 
diagnóstico de câncer ou de doenças 
geneticamente transmissíveis 
A técnica de PCR serve para 
diagnostico de doenças infecciosas, 
doenças genéticas e neoplasias