Métodos de estudo em patologia 1

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Atua muito no diagnóstico de várias 
doenças, principalmente neoplasias malignas 
e suas lesões; 
 Conseguem identificar agentes infecciosos e 
parasitários. 
Vantagens: 
 Simplicidade (Em situação de recolher a 
amostra da lesão e prepara-la.) 
 Baixo custo (Não há necessidade de 
processamento histológico) 
 Rapidez no resultado. 
 Rapidez no diagnósitco, podendo ainda ser 
utilizado em testes adicionais, como cultura 
para bactérias, fungos e bacilos álcool-
acidorresistentes. 
Desvantagens: 
 Ausência de arquitetura tecidual, o que 
pode impossibilitar um diagnóstico mais 
preciso. 
 Uso uma menor quantidade de material 
para ser analisado. 
 É necessário treinamento diagnósitoc na 
área. 
O material pode ser proveniente de: 
 Raspados da pele ou mucosa 
 Secreções, do conteúdo de cistos, por 
exemplo. 
 Líquidos, de serosas ou urina. 
 Punção aspirativa por agulha fina guiada 
por palpação ou ultrassonografia. 
Para a fixação: 
 O fixador mais utilizado é o álcool etílico a 
95%. 
 Exames cervicovaginais: Esfregaço tem que 
ser fixado imediatamente, ainda úmido no 
álcool a 95%. 
 Esfregaços secos: utiliza-se muito coloração 
hematológica. 
 Secreções ricas em muco ou proteína: pode 
ser guardada em geladeira até 1 dia antes 
de ir ao laboratório. 
 Líquido pobre em porteína: só pode ficar na 
geladeira por poucas horas. 
 
 
 
 
Obs: É importante lembrar que caso o material 
não possa ir diretamente ao laboratório, após a 
coleta ele deve ser colocado em etanol 50%. 
Principal corante: 
 Papanicolau. 
BIÓPSIAS: 
 Servem para diagnóstico ou tratamento. 
 Excisionais: faz corte de toda a lesão; 
 Incisional: Se retira apenas uma parte 
da lesão; 
 Vale lembrar que o material colhido 
deve ser representativo do todo. 
Tipos: 
 Lesão ulcerada: Na amostra deve haver a 
margem de transição entre a úlcera e o 
tecido próximo a ela. 
 Superficial: Pode conter apenas o material 
necrótico inflamatório. 
 Submucosa: pode não conseguir ser 
mostrada, não obter um material 
representativo da lesão, caso seja usado 
uma biópsia superficial. 
OBS: O material para a biópsia deve ser colocado 
em fixador o mais rápido possível, pois por exemplo, 
biópsias pequenas ressecam rapidamente, 
podendo, dessa forma, dificultar o diagnóstico. 
Fixador: Formaldeído a 4%, tamponado 
 Capaz de preservar a morfologia e a 
integridade das moléculas. 
 Deve ser de 6 a 10 vezes mais do que a 
amostra, pois a pressão hirdrostática vai 
atuar para a penetração do formol na 
lesão; 
O material deve ser acompanhado dos dados do 
paciente, informações clínicas relevantes, resultados 
de exames complementares e hipóteses 
diagnósticas. 
 
Giulianna Barreto-S3 
PASSO A PASSO: 
1. Dissecação 
2. Exame macroscópico das amostras 
3. Retirada dos fragmentos representativos 
para o estudo. 
4. Desidratação Em álcool 
5. Diafnização em xilol 
6. Impregnação e inclusão em parafina. 
7. Fragmentos cortados em micrótomo 
8. Desparafinização 
9. Coração 
Coloração universal: Hematoxilina e eosina. 
O congelamento preserva melhor a integridade dos 
ácidos nucleicos e proteínas, pois é capaz de 
interromper a ação de proteases e outras enzimas, 
além disso, ajuda na realização de testes 
moleculares complementares, ao exame de rotina. 
 Vale lembrar que: Quanto menor o tempo 
de retirada do congelamento, mais real será 
o perfil molecular obtido na amostra. 
O microscópio de luz é o mais utilizado nesses 
estudos. 
Os programas (softwares) acoplados a esses 
sistemas permitem ampla análise morfométrica, como 
medições precisas de área, contagem de eventos, 
quantificação automatizada da intensidade de 
corantes, incluindo a imuno-histoquímica, anotações 
e marcação de elementos específicos. 
AUTÓPSIA OU NECRÓPSIA: 
 Objetiva determinar a causa da morte e 
conhecer lesões e doenças existentes no 
falecido. 
 Correlacionar os achados morfológicos com 
os clínicos. 
 Pode ser parcial ou minimamente invasiva; 
quando apenas alguns órgãos são 
removidos por meio de incisões regionais. 
 Atualmente, usa como forma de 
complementação um exame imagenológico. 
 Autópsia médico-legal: feito em casos de 
mortes violentas- Faz-se coleta de sangue e 
de secreções para análise biológica e 
toxicológica. 
IMUNOHISTOQUIMICA: 
Utiliza anticorpos como reagentes específicos para 
detectar antígenos presentes em células ou tecidos. 
Utilizada para identificação de vírus, fungos, 
bactérias e outros agentes infecciosos. 
 Essencialmente qualitativa. 
 Objetivo principal: Encontro e a localização 
topográfica de antígenos em tecidos. 
 Para resultados, é necessário ser 
interpretado juntamente com outros 
achados morfológicos. 
 Os anticorpos empregados em uma reação 
imuno-histoquímica podem ser mono ou 
policlonais. 
 Formas de marcação: Substância 
fluorescente e enzimas. 
IMUNOFLUORESCÊNCIA: 
 Direta: o anticorpo primário é ligado a um 
composto fluorescente, principalmente o 
isotiocianato de fluoresceína. 
 Indireta: Um anticorpo primário liga-se ao 
antígeno de interesse.- Mais específica, pois 
o anticorpo primário encontra-se livre do 
marcador e o sinal só aparece após duas 
ligações antígeno-anticorpo, o que 
possibilita maior especificidade e melhor 
controle da reação. 
 A substância fluorescente é conjugada a um 
anticorpo secundário, que, por sua vez, 
reconhece a porção Fc do anticorpo 
primário e com ele forma reação específica. 
 Lâminas são analisadas em um microscópio 
equipado com luz ultravioleta. 
TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR: 
 Possibilidade de diagnósticos cada vez 
mais rápidos e mais precisos. 
 É muito importante que esse tipo de técnica 
esteja associada a patologia convencional. 
 Promoveram uma grande melhor no estudo 
do câncer, doenças infecciosas e genéticas. 
 Visam detectar alterações em 
macromolécuças, como proteínas e ácidos 
nucleicos, sendo possível identificar a 
existência de um microrganismo patogênico 
ou seu material genético (vírus, bactérias), 
ou ainda de um estado patológico, como o 
câncer. 
Obtenção e processamento da amostra: 
1. Manter as macromoléculas intactas. 
2. Preservar a morfologia das células e dos 
tecidos. 
3. Obter a amostra com o menor tempo de 
isquemia e congela-las em seguida em 
nitrogênio líquido. 
Material biológico pode ser obtido através de: 
 Autópsias 
 Peças cirúrgicas 
 Biópsias 
 Raspados celulares 
 Punções 
 Secreções 
 Culturas celulares 
 Fluidos orgânicos 
Para o isolamento de DNA ou RNA, tecidos ou 
células são digeridos, e os ácidos nucleicos são 
separados dos demais constituintes celulares por 
meio de um processo de extração com solventes 
orgânicos. A extração pode ser feita de modo 
manual ou automatizado. 
 Ao fim é necessário avaliar o grau de 
pureza da macromolécula, sua 
concentração e integridade. 
A microdissecção (feita para extração de moléculas 
de uma população celular mais específica) melhora 
o valor preditivo negativo dos testes moleculares e 
é fundamental em algumas situações. 
PRINCÍPIOS DA BIOLOGIA MOLECULAR: 
Como o DNA é mais estável que o RNA, é comum 
sintetizar DNA complementar (cDNA) a partir do RNA 
de interesse, para ser usado durante os ensaios, em 
vez do RNA propriamente dito. 
ESTRUTURA GÊNICA: 
 Exon: região do gene codificadora. 
 Íntron: região do gene não codificadora. 
(Não codificam proteínas mas são 
importantes para a transcrição de 
pequenas moléculas regulatórias, como o 
Micro-RNA.) 
 5’: Responsável pela modulação da 
intensidade da transcrição do gene. 
 3’: Responsável pela estabilização do 
transcrito. 
HIBRIDAÇÃO CELULAR: 
 DNA é uma molécula dupla hélice, formado 
por A, C,G e T, estabilizada por pontes de 
hidrogênio. 
 Essa dupla-hélice pode ser desfeita pelo 
calor ou por agentes químicos 
(desnaturação), após a retirada do agente 
desnaturanteas duas fitas se ligam 
novamente. 
 
 
REAÇÃO EM CADEIA POLIMERASE: 
Baseia-se em uma amplificação in vitro de 
sequências específicas de DNA, que vão se repetir 
em inúmeros ciclos. 
PASSO A PASSO: 
A amplificação é feita em um termociclador com 
controle automático de variação de temperatura 
em função do tempo. 
1. Fitas de DNA são separas pelo calor 
2. Dois iniciadores amplificam a região. 
3. DNA polimerase, a partir do inciador, copia 
o segmento de DNA desejado. 
4. Depois o ciclo se repete. 
Vantagens: 
 Pode- se detectar a presença de 
sequências de ácidos nucleicos virais, 
bacterianos ou de parasitos em amostras 
biológicas com altíssima sensibilidade. 
 Identificar alterações genômicas e a 
presença de mRNA que podem ser de 
grande utilidade no diagnóstico de câncer, 
por exemplo. 
 Simples realização. 
Desvantagens: 
 Grande possibilidade de contaminação da 
amostra via equipamentos ou ar, podendo 
levar a falsos-positivos. 
 Eminente qualitativa. 
RT-PCR: 
 Quando deseja amplificar o RNA, essa vai 
ser primeiro convertida em cDNA pela enzima 
transcriptase reversa. 
PCR em tempo real: 
 Os nucleotídeos usados para a síntese do 
DNA são marcados com substâncias 
fluorocrômicas. Com isso, cada vez que uma 
nova fita de DNA é sintetizada, uma certa 
quantidade de luz é emitida e captada 
pelo equipamento, que transforma o sinal 
luminoso em um traçado digital. 
 Permite a possibilidade de realizar PCR 
quantitativa, a qual é importante em 
algumas situações, como: 
1. Infecções virais 
2. Detecção de clones neoplásicos residuais 
no sangue periférico do tratamento.