Trabalho das aulas praticas

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UNIPLAC - Universidade do Planalto Catarinense
Aluna: Melissa Amarante
Curso: Biomedicina
Fase: 5°
Disciplina: Microbiologia
Tema: Trabalho para os alunos que não participaram das aulas práticas
· Descrever como é realizado a classificação das bactérias gram negativas pelo sistema bactray I,II e III, citando todas as provas bioquímicas e explicando a função de cada uma delas.
· Descrever como é realizado o antibiograma pelo BRCAST, e quais antimicrobianos devem ser utilizados nas infecções urinárias e como deve ser realizado o controle de qualidade do antibiograma pelo BRCAST 
A classificação das bactérias gram negativas pelo sistema Bactray se dá pelo composto de três conjuntos de provas bioquímicas, denominadas respectivamente Bactray I, II e III, sendo assim totalizando substratos à identificação de bacilos gram negativos oxidase negativo, fermentadores ou não da glicose e BGN oxidase positiva não fermentadores da glicose. Sendo utilizada a Bactray I e II para a identificação de Bacilos BGN oxidase negativa, e a Bactray III para oxidase positiva. Cada conjunto é composto por um suporte de poliestireno descartável que contém 10 compartimentos para execução das provas bioquímicas.
	A Bactray I possui os testes de ONPG, ADH, LDC, ODC, H2S, URE,VP, PD, IND, CIT; possuindo como componente ativo orto-nitrofenil-galactopiranoside, arginina, lisina, ornitina, tiossulfato de sódio, uréia, glicose, fenilalanina, triptona, citrato respectivamente.
Por sua vez, a Bactray II possui os testes de MAL, RHA, ADO, ARA, SAL, INO, SOR, SAC, MAN, RAF; possuindo como componente ativo malonato, ramnose, adonitol, arabinose, salicina, inositol, sorbitol, sacarose, manitol, rafinose respectivamente.
E sendo assim a Bactray III possui os testes de CET, ACE, MAL, CIT, MLT, ESC, CTL, ARG, URE, IND; possuindo como componente ativo cetrimide, acetamide, malonato, citrato, maltose, esculina, controle de arginina, arginina, uréia,triptona respectivamente.
Logo, o princípio do sistema bactray se trata de um software de geração de algoritmos, onde dados são compilados a partir de diferentes princípios bioquímicos, gerando códigos para identificação de espécies bacterianas. 
A atividade da ß-galactosidade, ONPG, onde a hidrólise da beta-galactosidase, o-nitrofenol-ß-galactopiranoside, para galactose na presença do o-nitrofenol desenvolvendo coloração amarela.
A arginina, ADH, onde a arginina dehidrolase transforma a arginina em citrulina e amônia, sendo assim acaba ocasionando uma elevação do pH do sistema que gera como consequência a mudança do indicador de amarelo para púrpura.
A lisina, LDC, onde a lisina descarboxilase transforma a lisina num composto básico de amina primária, cadaverina, e CO2, sendo assim esta amina produz uma elevação do pH do sistema com a consequente mudança do indicador de amarelo para púrpura.
A ornitina, ODC, ornitina descarboxilase transforma a ornitina num composto básico de amina primária (putrescina) e CO2, sendo assim esta amina produz uma elevação do pH do sistema com a conseqüente mudança do indicador de amarelo para púrpura.
O tiossulfato de sódio, H2S, o sulfeto de hidrogênio é produzido pela hidrólise enzimática do tiossulfato, na presença do citrato férrico forma um precipitado negro.
A ureia, URE, a urease hidrolisa enzimaticamente a uréia com produção de amônia e CO2.
A vogues-proscauer, VP, este é um teste para verificação da produção de acetoína, produto este intermediário da degradação da glicose, tendo sua presença é indicada pela cor vermelha ou rosa, formada pela reação do complexo hidróxido de potássio e alfa naftol.
A l-fenilalanina, PD, a desaminação da fenilalanina, produzida pelo ácido fenil pirúvico, forma uma cor verde na presença de cloreto férrico.
A reação de indol, IND, a metabolização do triptofano pela triptofanase resulta na produção de indol formando um complexo de cor rosa ou vermelho com o reagente de Kovac's.
O citrato de sódio, CIT, consiste na utilização de citrato como única fonte de carbono, o qual quando metabolizado, resulta num produto alcalino de coloração azul ou verde azulado.
O malonato, MAL, consiste na utilização de malonato como única fonte de carbono, o qual quando metabolizado, resulta num produto alcalino de coloração azul ou verde azulado.
A ramnose (RHA), o adonitol (ADO), a salicina (SAL), a arabnose (ARA), o inositol (INO), o sorbitol (SOR), a sacarose (SAC), o manitol (MAN), a rafinose (RAF), onde todos esses consiste na utilização de carboidratos com a concomitante produção de ácido, mudando o indicador de azul para amarelo.
A cetrimide, CET, sendo a capacidade do microrganismo em tolerar o cetrimide e se desenvolver no meio de cultura.
A acetamida, ACE, a utilização destas substâncias como única fonte metabólica de carbono, produz a alcalinização do meio, onde uma elevação do pH muda o indicador de amarelo para vermelho.
A malonato, MAL, onde a utilização do malonato como única fonte metabólica de carbono, produz a alcalinização do meio, elevando o pH e consequentemente mudando o indicador de verde para azul.
O citrato, CIT, onde a utilização do citrato como única fonte metabólica de carbono, produz a alcalinização do meio, elevando o pH e consequentemente mudando o indicador de verde para azul.
A maltose, MLT, onde a utilização de carboidratos resulta na produção de ácido, mudando o indicador (vermelho de fenol) de vermelho para amarelo, ou amarelo-alaranjado.
A esculina, ESC, onde a hidrólise da esculina é detectada pelo citrato férrico amoniacal, formando um precipitado negro.
O controle, CTL, esta prova serve de branco para leitura da arginina, onde deve-se observar a coloração deste controle, se a cor obtida na arginina seja de maior intensidade (vermelho, laranja ou rosa), esta é considerada positiva.
A l-arginina, (ARG), a arginina dehidrolase transforma a arginina em citrulina e amônia, isto ocasiona uma elevação do pH do sistema, mudando o indicador de amarelo para alaranjado ou vermelho. 
	Em contra partida, a realização do antibiograma pelo BRCAST, se inicia pelo preparo e armazenamento de meios, deve-se preparar o ágar Müeller Hinton de acordo com as instruções do fabricante, onde deve-se homogeneizar o pó contido no frasco, realizando a devida diluição para o tanto de meios de cultura desejados, em seguida, esterilizado na autoclave a 121°C durante 15 minutos, isso para que seja possível assegurar a morte de todas as formas de vida bacterianas, incluindo a dos endósporos bacterianos mais resistentes ao calor que as células vegetativas.
	O meio deve possuir uma espessura de aproximadamente 4,0 milímetros, podendo variar 0,5 milímetros para mais ou para menos, isso utilizando 25 mililitros em uma placa circular de aproximadamente 90 milímetros de diâmetro, 31 mililitros em uma placa circular de 100 milímetros de diâmetro, 71 mililitros em uma placa de 150 milímetros de diâmetro, e 40 mililitros em uma placa quadrada de 100 milímetros.
	A superfície do ágar deve estar seca antes do uso e sem nenhuma irregularidade, para isso se realiza a seguinte atividade, após a retirada do meio já homogêneo da autoclave, deve-se utilizar um bico de bunsen para caso fique alguma irregularidade se utiliza a chama para fechar gotas ou bolhas que se formem, além do bico auxiliar na não contaminação das placas. Nenhuma gota de água deve estar visível na superfície do ágar ou no interior da tampa. Onde, as mesmas, devem ser armazenadas em uma temperatura entre 4 e 8°C. 
Em seguida, deve-se realizar a preparação do inóculo, utilizando o método de suspensão direta das colônias em salina para fazer a suspensão de microrganismos de modo a obter densidade equivalente ao padrão de turbidez 0,5 da escala de McFarland, que corresponde aproximadamente a 1-2 x108UFC/mL para Escherichia coli, o método da suspensão direta das colônias é apropriado para todos os microrganismos, incluindo os microrganismos fastidiosos. Para preparar a suspensão a partir de um crescimento overnight em um meio não seletivo, deve-se usar várias colônias morfologicamente similares,isso quando possível, para evitar selecionar variantes atípicas e suspender as colônias em salina com alça estéril ou swab de algodão.
Possuindo ainda a necessidade de ajustar a suspensão do inóculo de modo a obter turbidez equivalente ao padrão 0,5 da escala de McFarland adicionando salina ou mais bactérias, um inóculo mais denso pode resultar em halos menores e inóculo com menor densidade terá um efeito oposto, sendo assim, é recomendado que um dispositivo fotométrico seja utilizado para ajustar a densidade da suspensão, o fotômetro em questão deve ser calibrado como padrão 0,5 da escala de McFarland, de acordo com as instruções do fabricante, a densidade da suspensão pode ser comparada visualmente com a turbidez do padrão 0,5 da escala de McFarland., para auxiliar a comparação, comparar o teste e padrão contra um fundobranco com linhas pretas. As suspensões de Streptococcus pneumoniae devem ser preferencialmente preparadas a partir de cultura obtida em de ágar sangue de modo a obter densidade equivalente ao padrão 0,5 da escala de McFarland. Quando a suspensão foi preparada a partir de cultura em ágar chocolate, a turbidez do inóculo deve ser equivalente ao padrão 1.0 da escala de McFarland.
A inoculação das placas de ágar, primeiramente deve-se garantir que as placas estejam em temperatura ambiente antes da inoculação, onde deve-se, preferencialmente, utilizar a suspensão ajustada do inóculo em até 15 minutos após a preparação, logo a suspensão deve ser obrigatoriamente utilizada em até 60 minutos após a preparação; em seguida, deve-se mergulhar um swab de algodão estéril na suspensão, a fim de evitar a inoculação excessiva das placas de microrganismos gram-negativos, também é necessário remover o excesso de líquido pressionando e girando o swab contra a parte interna do tubo acima do nível da suspensão, já em contra partida, para bactérias gram-positivas, não pressione o swab contra a parte interna do tubo.
Ao se inocular várias placas com a mesma suspensão do inóculo, deve-se repetir o procedimento onde se deve mergulhar um swab de algodão estéril na suspensão, a fim de evitar a inoculação excessiva das placas de microrganismos, para cada placa de ágar, sendo assim as placas podem ser inoculadas tanto espalhando o inóculo uniformemente em três direções como por um inoculador automatizado, ao se espalhar o inóculo uniformemente sobre toda a superfície assegurando que não haja falhas; para bactérias gram-positivas, deve-se ter uma atenção especial a fim de garantir que não exista diferença na semeadura.
Aplicar os discos em até 15 minutos após a inoculação da placa, se as placas inoculadas foram deixadas em temperatura ambiente por períodos prolongados de tempo antes da aplicação dos discos, os microrganismos podem começar a crescer, resultando em redução errônea do tamanho dos halos de inibição.
Em seguida, a aplicação dos discos de antimicrobianos, onde deve-se permitir que os discos alcancem a temperatura ambiente antes da abertura dos recipientes utilizados para o armazenamento dos discos, pois isto previne a condensação, que por sua vez leva a rápida deterioração de alguns agentes.
Deve-se aplicar os discos firmemente na superfície da placa de ágar dentro de 15 minutos de inoculação, o contato dos discos com a superfície do ágar deve ser completo, os discos não podem ser removidos do ágar após serem aplicados na placa, pois uma vez que a difusão dos agentes antimicrobianos dos discos é extremamente rápida. 
O número de placas deve ser limitado para impedir sobreposição dos halos e a interferência entre os antimicrobianos, o que gera a importância dos halos de serem medidos corretamente, o número máximo de discos varia de acordo com o microrganismo e a seleção dos discos, os quais, normalmente, possuem entre 6 e 12 discos, em placas de 90 e 150 milímetros respectivamente. Para detecção da resistência induzível à clindamicina em estafilococos e estreptococos, os discos de eritromicina e clindamicina devem ser posicionados em uma distância de 12 a 20 milímetros borda a borda para os estafilococos e 12 a 16 milímetros para estreptococos.
Quando a perda de potência dos agentes antimicrobianos acaba por resultar na redução dos diâmetros dos halos, e é uma fonte comum de erro, os cuidados mais comuns incluem, descartar os discos na data de expiração indicada na embalagem, realizar frequentemente o controle de qualidade dos insumos em uso para garantir que os discos antimicrobianos não perderam a potência durante o armazenamento, entre outros.
Posteriormente se faz necessário a incubação das placas, onde se inverte as placas, a fim de assegurar que os discos não caiam na superfície do ágar, e deve se incubar em até 15 minutos após a aplicação dos discos, se as placas foram deixadas em temperatura ambiente após a aplicação dos discos, a pré-difusão pode resultar em halos de inibição erroneamente aumentados.
O empilhamento das placas na estufa pode alterar os resultados devido ao aquecimento desigual entre elas. A eficiência das estufas varia e dessa forma o controle de incubação, incluindo o número apropriado de placas empilhadas deve fazer parte do programa de garantia de qualidade do laboratório. 
Incuba-se as placas de acordo com as condições preestabelecidas. A incubação além do limite de tempo recomendado não é permitido uma vez que resulta no crescimento dentro do halo de inibição e reporte de isolados falso-resistentes. Para testes de sensibilidade dos glicopeptídeos com algumas cepas de Enterococcus spp. colônias resistentes não são visíveis até que as placas tenham sido incubadas por 24 horas completas. Mesmo assim, as placas podem ser examinadas depois de 16-20 horas e qualquer resistência reportada, mas placas de isolados aparentemente sensíveis devem ser incubadas novamente e lidas com 24h.
Se faz necessária a observação das placas após incubação, onde um inóculo correto gera uma placa satisfatoriamente semeadas, os resultados devem resultar em um crescimento confluente, quando ocorre colônias isoladas o inóculo é muito escasso e o teste deve ser repetido, a placa perfeita apresenta o crescimento deve ser uniformemente distribuído na superfície do ágar para obter halos de inibição uniformemente circulares, ou seja, sem distorções.
Por fim, deve ser feito a aferição e interpretação dos diâmetros dos halos de inibição, para todos os antimicrobianos as bordas dos halos devem ser lidas no ponto de completa inibição do crescimento, visto a olho nu, com a placa posicionada a cerca de 30 centímetros dos olhos.
deve-se ainda ler as placas de ágar Müeller-Hinton não suplementadas pelo seu fundo, com luz refletida contra um fundo escuro, e ler as placas de ágar Müeller-Hinton suplementadas com a tampa removida, observando a superfície contendo os discos, sob luz refletida, não utilizar luz transmitida ou lupa, exceto quando indicado, aferir os diâmetros dos halos de inibição em milímetros com uma régua calibrada ou paquímetro, em caso de um leitor automatizado seja utilizado, ele deve ser calibrado com a leitura manual.
Os antimicrobianos mais comuns a serem utilizados em casos de infecções urinárias são Fosfomicina, Nitrofurantoína, Amoxicilina com Clavulonato, Norfloxacino ou Ciprofloxacino.
O controle de qualidade se dá pela utilização de cepas de controle específicas para monitorar o desempenho do teste, tendo como as principais cepas controle recomendadas são cepas tipicamente sensíveis, mas cepas resistentes, isolados-desafio, também podem ser utilizadas para confirmar que um método é capaz de detectar resistência mediada por mecanismos de resistência conhecidos, estas cepas em questão, podem ser adquiridas de coleções de cultura ou através de fontes comerciais.
Para o controle dos componentes inibidores nos discos combinados de ẞ-lactâmico-inibidor de ẞ-lactamase, é recomendado utilizar cepas produtoras de ẞ-lactamases específicas, estas devem fazer parte da rotina do controle de qualidade. Sendo o componente ativo é avaliado com uma cepa sensível do Controle de Qualidade.
A ativação dascepas controles deve seguir as recomendações do fornecedor, realizar o maior número possível de tubos contendo a cepa controle e sugere-se ainda armazenar as cepas controle em condições que mantenham a viabilidade e característica dos microrganismos. O armazenamento em miçangas com caldo glicerol a -70°C é um método conveniente. Microrganismos não fastidiosos podem ser armazenados a temperatura inferior ou igual a -20°C. Pelo menos dois tubos de cada cepa controle devem ser armazenados, um para uso e outro como reserva para reposição do tubo em uso quando necessário.
Periódicamente deve-se retirar um criotubo do freezer e subcultivar uma miçanga ou alíquota em meio não seletivo apropriado e verificar a pureza, sendo assim desta cultura pura, preparar um subcultivo a cada dia de teste. Para microrganismos fastidiosos que não sobrevivem na placa por 5 a 6 dias, se necessário, sub-cultivar com maior frequência e, por não mais do que uma semana. Quando subcultivar uma cepa controle, utilize várias colônias para evitar a seleção de mutantes.
Nas tabelas de controle de qualidade do BrCAST-EUCAST, são listados tanto o intervalo esperado quanto o valor do alvo. A repetição dos testes das cepas de controle de qualidade do BrCAST-EUCAST devem fornecer valores de halos de inibição randomicamente distribuídos dentro do intervalo recomendado. Se o número de testes for ≥ 10, a média dos halos de inibição deve ser próxima do valor alvo (±1 mm).
Utilizar as cepas recomendadas para o controle de qualidade de rotina para monitorar o desempenho dos testes. Os testes controle devem ser realizados verificados semanalmente para os antibióticos que fazem parte dos testes de rotina. A cada dia que os testes forem realizados, além de verificar o intervalo daquele resultado, verificar os resultados de pelo menos vinte testes consecutivos pregressos. Onde também deve-se verificar os resultados quanto à ocorrência de tendência ou diâmetros de halos consistentemente acima ou abaixo do alvo. As cepas de controle de qualidade devem mostrar desempenho satisfatório, ou seja, não mais que um em vinte testes fora dos limites estabelecidos. Em caso de haver dois ou mais testes fora do intervalo aceitável, é necessária uma investigação, a fim de facilitar a análise dos resultados de CQ, é recomendado que se utilize o gráfico de Levey-Jennings. 
	Em adição com o CQ de rotina, testar cada novo lote ou remessa de ágarMüeller-Hinton ou de discos de sensibilidade, para garantir que os halos estejam dentro dos limites aceitáveis. Aminoglicosídeos podem evidenciar variação inaceitável de cátions divalentes no meio; tigeciclina pode evidenciar variação no magnésio; sulfametoxazol-trimetoprim apresentará problemas com o conteúdo de timina e eritromicina pode evidenciar pH fora do aceitável.
	Ao analisar problemas de controle de qualidade deve-se considerar que problemas com o ágar Müeller-Hinton usualmente afetam toda uma classe de antimicrobianos, enquanto problemas com a potência do disco restringem-se ao disco em questão.
	Ao iniciar um programa de CQ, ou sempre que houver mudança na potência do disco, formulação ou fabricante de insumos, sendo esses meios de cultura e ou discos,mudança no preparo do inóculo ou mesmo adição de um novo antimicrobiano,deve-se realizar a verificação ou validação deste procedimento.
	A verificação ou validação requer a realização de vinte testes com as mesmas combinações de cada uma das cepas controle e discos de antimicrobianos, os testes podem ser realizados em cinco replicatas, ou seja, devem ser preparadas cinco suspensões distintas de cada cepa controle, sendo que todo o procedimento deve ser realizado de forma independente, durante quatro dias consecutivos.
Referencias biográficas:
	<http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/inserts/CDG/pt/Literature/inserts/56137_06_2010_PT.pdf>
<http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:VtEhk_V6lDAJ:brcast.org.br/download/documentos/Manual-Disco-Difusao-BrCAST-21092018.pdf+&cd=1&hl=pt-BR&ct=clnk&gl=br>
<https://www.tuasaude.com/antibiograma/>
<https://www.tuasaude.com/urocultura-com-antibiograma/>
<http://boaspraticasnet.com.br/autoclaves-e-a-esterilizacao-por-calor-umido/#:~:text=No%20laborat%C3%B3rio%20de%20microbiologia%2C%20%C3%A9,calor%20que%20as%20c%C3%A9lulas%20vegetativas.>
<https://www.tuasaude.com/tratamento-para-infeccao-urinaria/>
<https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/05/sistema_bactray_880108_880109_880110.pdf>