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ELABORADO POR LÚCIA LEMOS GUIA DE ANÁLISE DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS ÍNDICE 1 - NORMAS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO 2 - EQUIPAMENTOS BÁSICOS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 3 - UTENSÍLIOS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 4 - MEIO DE CULTURA 5 - DILUIÇÃO SERIADA 6 - ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE SUPERFÍCIES 7 - PLAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE (PUR PLATE) 8 - PLAQUEAMENTO EM SUPERFÍCIE (SPREAD PLATE) 9 - PLAQUEAMENTO EM GOTAS (DROP PLATE) 10 - TÉCNICAS BÁSICAS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS PELO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) 11 - ESCHERICHIA COLI 12 - PESQUISA DE SALMONELLA 13 - STAPHYLOCOCCUS AUREUS 14 - MICRORGANISMOS MESÓFILOS TOTAIS 15 - BOLORES E LEVEDURAS 16 - CLOSTRÍDIOS SULFITO REDUTORES - CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 17- FATORES INTRÍNSECOS QUE CONTROLAM O CRESCIMENTO MICROBIANO EM ALIMENTOS 18 - FATORES EXTRÍNSECOS QUE CONTROLAM O CRESCIMENTO MICROBIANO EM ALIMENTOS NORMAS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO Trabalhar em um laboratório de microbiologia de alimentos requer aderência rigorosa a normas de segurança e procedimentos. Aqui estão algumas das principais normas e diretrizes que devem ser seguidas: 1. Vestimenta Adequada: Use sempre jaleco, luvas, óculos de proteção e máscara quando necessário. Isso ajuda a evitar a contaminação cruzada e protege você de possíveis agentes patogênicos. 2. Higienização das Mãos: Lave as mãos com frequência, especialmente antes e depois de manusear amostras, alimentos ou utensílios. Isso ajuda a evitar a transferência de micro- organismos. 3. Desinfecção: Limpe e desinfete regularmente as superfícies de trabalho e equipamentos com produtos apropriados. Isso minimiza o risco de contaminação. 4. Manuseio Adequado de Amostras: Utilize técnicas assépticas ao manusear amostras. Isso inclui a esterilização de instrumentos e materiais antes do uso. 5. Descarte Seguro: Descarte corretamente resíduos biológicos, químicos e outros materiais de acordo com as regulamentações locais. 6. Rotulagem: Rotule adequadamente todas as amostras e reagentes para evitar confusões e garantir rastreabilidade. 7. Equipamentos de Proteção Individual (EPIs): Use EPIs sempre que necessário, incluindo jalecos, luvas, óculos de proteção, máscaras e calçados fechados. 8. Não Coma, Beba ou Fume: Não coma, beba ou fume dentro do laboratório, pois isso evita a ingestão acidental de microrganismos ou substâncias químicas. 01 @tecno_alimentos 02 NORMAS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO 9. Manipulação de Culturas: Ao trabalhar com culturas, utilize técnicas de manipulação adequadas para evitar contaminação e dispersão de micro- organismos. 10. Registro Preciso: Mantenha registros detalhados e precisos de todas as atividades realizadas no laboratório, incluindo datas, procedimentos e resultados. 11. Normas de Biossegurança: Siga as normas de biossegurança estabelecidas para proteger a saúde dos trabalhadores, minimizar riscos e prevenir acidentes. 12. Conhecimento dos Microrganismos: Esteja ciente dos riscos associados aos diferentes micro-organismos e patógenos com os quais você está trabalhando. 13. Calibração de Equipamentos: Mantenha os equipamentos de medição e análise devidamente calibrados para garantir resultados precisos. 14.Procedimentos Padrão: Siga os procedimentos padrão estabelecidos para todas as análises e testes microbiológicos. 15.Comunicação: Mantenha uma comunicação clara com outros membros da equipe, relatando quaisquer problemas, acidentes ou preocupações de segurança. Lembre-se de que as normas específicas podem variar de acordo com o laboratório, os regulamentos locais e o tipo de análises realizadas. É importante receber treinamento adequado e estar ciente das normas específicas do laboratório em que você trabalha. A segurança e a precisão dos resultados são prioridades fundamentais ao trabalhar em microbiologia de alimentos. @tecno_alimentos 03 Microscópio: Usado para visualizar micro-organismos em detalhes, como bactérias, fungos e protozoários. Existem diferentes tipos de microscópios, como microscópios ópticos e microscópios de contraste de fase. Incubadora: Um equipamento para controlar temperatura, umidade e condições de crescimento, permitindo o cultivo de micro-organismos sob condições controladas. Estufa: Utilizada para incubar placas de cultura e meios de cultura sólidos a temperaturas específicas, favorecendo o crescimento de bactérias e outros micróbios. Autoclave: Usada para esterilizar equipamentos, meios de cultura e outros materiais por meio de vapor sob pressão, eliminando micróbios patogênicos. Câmara de Fluxo Laminar: Fornece um ambiente livre de partículas para manipulação asséptica de amostras e culturas, minimizando a contaminação. Agitador Magnético: Utilizado para agitar líquidos e culturas, permitindo o crescimento uniforme dos micróbios. Centrífuga: Separa líquidos de diferentes densidades, como centrifugação de culturas para coletar células microbianas. Balanças Analíticas: Utilizadas para medir precisamente a massa de reagentes e materiais em experimentos. Espectrofotômetro: Utilizado para medir a densidade óptica de culturas microbianas, permitindo a quantificação de micróbios em uma amostra. Freezer e Geladeira: Usados para armazenar reagentes, meios de cultura e amostras a temperaturas controladas. EQUIPAMENTOS BÁSICOS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 04 @grandesite 02 Um laboratório de microbiologia de alimentos utiliza uma variedade de equipamentos básicos para realizar análises, identificação e cultivo de micro-organismos. Aqui estão alguns dos equipamentos mais comuns utilizados nesse tipo de laboratório: Microcentrífuga: Uma centrífuga de pequeno porte usada para realizar centrifugação de pequenas amostras, como para separação de componentes celulares. Bico de Bunsen: Utilizado para esterilizar bocas de tubos, frascos Erlenmeyers, alças de platina, entre outros, no momento do preparo da amostra e da inoculação. Além disso, promove um ambiente asséptico ao redor da chama. Contador de Colônias: Consiste em um suporte para a placa de Petri, conectado a uma lupa e uma lâmpada para melhor visualização e contagem das colônias. A contagem é realizada pressionando uma sonda contra a placa, que registra automaticamente o número de colônias. Homogeneizador (Bag Mixer ou Stomacher): A amostra, junto com o diluente, é colocada em sacos plásticos estéreis e introduzida no equipamento. Por meio de um movimento de vai e vem de duas pás, ocorre a homogeneização. Banho-Maria: Utilizado para incubação de culturas. Balanças: Usadas para a pesagem precisa de amostras e meios de cultura durante a preparação. Destilador de Água: Essencial para destilar toda a água usada na preparação de soluções e meios de cultura. O agitador de tubos: Também conhecido como vortex, é um equipamento fundamental nos laboratórios, especialmente na microbiologia de alimentos. Sua principal função é promover a agitação e a mistura eficaz de amostras líquidas contidas em tubos de ensaio ou frascos. EQUIPAMENTOS BÁSICOS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 05 @tecno_alimentos Pipetas e Micropipetas: Usadas para medir e transferir volumes precisos de líquidos, essenciais em experimentos de preparação de meios de cultura e análises. Placas de Petri e Meios de Cultura: Usados para cultivar e isolar micro- organismos a partir de amostras. Termômetros de Precisão: Utilizados para monitorar a temperatura de incubadoras, estufas e outros equipamentos. Alça de Platina: Composta por um cabo metálico, também conhecido como cabo de Kolle, que abriga um fio de platina moldado em um formato circular aberto na extremidade. Essa ferramenta é empregada para isolar e transferir bactérias para meios de cultura. Agulha de Platina: Similar à alça de platina, a agulha de platina é usada para transferir micro-organismos, facilitando o processo de repicagem. Pinça de Dissecação: Essencial para manipular materiais sem o contato direto das mãos, desempenhando um papel crucial na coleta de amostras para pesagem. Bisturi: Uma ferramentaempregada no corte de embalagens e amostras que serão submetidas à pesagem. Alça de Drigalsky: Constituída por um bastão de vidro moldado em formato de triângulo isósceles, com cerca de 3 cm de comprimento em cada lado. Este utensílio é dobrado em um ângulo de aproximadamente 130° em relação ao cabo e é usada para uniformizar a distribuição de micro-organismos em meio sólido dentro de placas de Petri, durante o processo de semeadura em superfície. UTENSÍLIOS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 06 03 @tecno_alimentos BISTURI ALÇA DE DRIGALSKYPLACA DE PETRITERMÔMETROS DE PRECISÃOPIPETAS Um meio de cultura é uma substância ou mistura de substâncias utilizada em laboratórios de microbiologia para promover o crescimento, multiplicação e estudo de microrganismos, como bactérias, fungos e vírus. Esses meios são desenvolvidos para fornecer os nutrientes essenciais necessários para o desenvolvimento dos micro-organismos em condições controladas. Os meios de cultura são uma ferramenta fundamental na pesquisa microbiológica, diagnóstico de doenças infecciosas, testes de sensibilidade a antimicrobianos e várias outras aplicações. Eles são projetados de acordo com as necessidades específicas dos micro-organismos que se pretende cultivar, levando em consideração fatores como fontes de carbono, nitrogênio, minerais, pH e temperatura. Existem dois principais tipos de meios de cultura: 1. Meio de Cultura Sólido (Ágar): Nesse tipo de meio, substâncias solidificantes, como o ágar-ágar, são adicionadas ao líquido nutritivo para criar uma consistência sólida. Os meios de cultura sólidos são usados para o isolamento de colônias puras de micro-organismos e para observar características específicas do crescimento, como forma, cor e textura das colônias. 2. Meio de Cultura Líquido (Caldo): Os meios de cultura líquidos são utilizados quando se deseja cultivar microrganismos em suspensão. Eles podem ser usados para cultivos em grande escala, para determinar a viabilidade de micro-organismos ou para observar seu crescimento em solução. Os meios de cultura também podem ser classificados de acordo com o tipo de microrganismo que se deseja cultivar, como meios seletivos, diferenciais, enriquecidos, entre outros. Meios seletivos favorecem o crescimento de um grupo específico de microrganismos, enquanto meios diferenciais permitem a identificação de características distintas. Meios enriquecidos contêm nutrientes adicionais para favorecer o crescimento de microrganismos fastidiosos. MEIO DE CULTURA 07 04 @tecno_alimentos Esterilização: Esterilize, equipamentos e recipientes que serão utilizados no processo. Isso pode ser feito através de autoclavação ou outros métodos de esterilização. Reúna os Materiais: Separe os reativos necessários, como pó de meio de cultura, ágar (se necessário), nutrientes específicos, indicadores de pH, etc. Prepare água destilada ou desionizada para uso. Medição e Pesagem: Pese a quantidade adequada do pó de meio de cultura de acordo com a fórmula e o volume desejado. A proporção você pode encontrar no rótulo do produto. Adicione o pó de meio de cultura à água destilada enquanto agita para garantir a dissolução uniforme. Ágar (se necessário): Ajuste de pH (Para alguns meios isso não é necessário): Meça o pH do meio de cultura e ajuste-o conforme a fórmula ou requisitos do experimento. Adicione ácido ou base para ajustar o pH até atingir o valor desejado. Preparar meios de cultura é uma parte fundamental da microbiologia e envolve a criação de um ambiente adequado para o crescimento de microrganismos. Aqui está um passo a passo geral para o preparo de meio de cultura: Se o meio de cultura precisar de ágar para solidificação. Certifique-se de que o ágar esteja completamente dissolvido. PASSO A PASSO GERAL PARA PREPARO DE MEIO DE CULTURA 08 @tecno_alimentos Autoclavar: Resfriamento: Após a autoclavação, retire o meio de cultura do autoclave com cuidado, pois estará quente. Deixe o meio de cultura esfriar a uma temperatura segura para manuseio antes de prosseguir. Adição de Suplementos (se necessário): Se o meio de cultura requer suplementos sensíveis ao calor, como sangue ou nutrientes termossensíveis, adicione-os após o resfriamento. Armazenamento: Selecione apropriados meios de cultura para seus microrganismos- alvo (por exemplo, meios seletivos ou diferenciais). Rotule os recipientes com informações importantes, como a data de preparo, tipo de meio e qualquer outro detalhe relevante. Se for usar em outro dia, armazene na geladeira sob refrigeração. Lembrando que a preparação de meios de cultura pode variar dependendo do tipo de meio e dos microrganismos que você está cultivando. É importante seguir as instruções específicas do protocolo ou da literatura técnica correspondente. Além disso, garantir a assepsia durante o processo é crucial para evitar contaminação indesejada. Coloque o meio de cultura em frascos ou tubos de ensaio apropriados, garantindo espaço para expansão durante a autoclavação. Autoclave o meio de cultura para esterilização. A temperatura e o tempo de autoclavação dependerão do meio e das especificações do fabricante. PASSO A PASSO GERAL PARA PREPARO DE MEIO DE CULTURA 09 @tecno_alimentos DILUIÇÃO SERIADA Pipetas volumétricas ou pipetas automáticas Tubos de ensaio estéreis Meio de cultura estéril (caldo ou ágar) Água destilada estéril Prepare a solução salina ou água petonada de acordo com seu protocolo. Adicione a solução anterior (9mL) previamente preparada e adicione em tubos de ensaios. Esterilize os tubos de ensaio e as pipetas volumétricas em um autoclave. Rotule os tubos de ensaio de acordo com as diluições que você deseja criar. Comece com a amostra original (por exemplo, 1 ml da amostra) e pipete-a para o primeiro tubo de ensaio, contendo um volume específico de solução salina (por exemplo, 9 ml). Misture bem o conteúdo do primeiro tubo de ensaio para obter uma diluição de 1:10. Transfira 1 ml da diluição 1:10 para o segundo tubo de ensaio, adicionando novamente um volume específico de solução salina (por exemplo, 9 ml). Isso resulta em uma diluição de 1:100. Continue esse processo de transferência e diluição para os próximos tubos, criando uma série de diluições. Veja o esquema a seguir. A diluição seriada é uma técnica utilizada em microbiologia para obter uma variedade de diluições a partir de uma amostra original, permitindo a contagem de microrganismos em quantidades mensuráveis. Isso é especialmente útil quando a concentração de microrganismos na amostra é alta e precisa ser reduzida para contagem. 1. Materiais Necessários: 2. Procedimento: 3. Preparação das Diluições: 10 @tecno_alientos 05 11 Após a preparação das diluições, você pode usar pipetas estéreis para retirar alíquotas das diferentes diluições e inoculá-las no meio de cultura correspondente (caldo ou ágar). O meio deve estar em uma placa de Petri ou tubo de ensaio, dependendo do seu objetivo. Incube os meios inoculados a uma temperatura e período de tempo apropriados para permitir o crescimento dos micro- organismos. Após a incubação, observe as placas ou tubos e conte as colônias que cresceram. Para calcular a contagem de micro-organismos na amostra original, leve em consideração as diluições feitas e a quantidade de colônias em cada diluição. É importante manter a assepsia durante todo o processo para evitar contaminações. Anote cuidadosamente as diluições realizadas e os resultados obtidos para uma interpretação precisa. 4. Inoculação 5. Incubação 6. Contagem de Colônias: Dicas: PROCEDIMENTO DE DILUIÇÃO SERIADA @tecno_alimentos A M O S T R A + s o l u ç ã o s a l i n a e s t é r i l 1:10 (10- ) 1:100 (10- ) 1:1000 (10 - ) 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL INCUBAÇÃO INOCULAÇÃO 1 2 3 Tubos de diluição com 10mL de água peptonada 0,1% ou solução salina Limitadores de área Swabes Placas de Petri estéreis Pipeta automática de 100-1000 µL Ponteiras descartáveis Alçade Drigalski 1. Objetivo: Realizar a análise microbiológica de superfícies para determinar a presença e quantidade de microrganismos viáveis, avaliando a higiene e condições de limpeza em ambientes diversos. 2. Aplicação: Esta análise é aplicada em diferentes setores, como indústrias alimentícias, hospitais, instalações farmacêuticas, ambientes de processamento de alimentos e áreas de produção, para garantir que as superfícies estejam livres de contaminação microbiológica que possa afetar a qualidade dos produtos ou a saúde dos usuários. 3. Princípio: A análise microbiológica de superfícies é baseada na coleta de amostras das superfícies a serem testadas, seguida pelo cultivo dos micro-organismos presentes em meios de cultura adequados. A contagem de colônias formadas permite a quantificação dos micro- organismos viáveis presentes. 4.Material: 12 ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE SUPERFÍCIES @tecno_alimentos 06 ROTEIRO PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE SUPERFÍCIES Estufa incubadora a 35-37°C Bico de Bunsen Vortex Água peptonada 0,1% Ágar padrão de contagem (PCA) Ágar batata dextrose (PDA) Delimite a área a ser amostrada com um molde estéril, anotando a área. Segure o "swab" na parte distante do algodão. Para superfícies secas, umedeça o "swab" na solução diluente (10 mL) antes de usá-lo e retire o excesso de líquido pressionando-o contra a parede do tubo. Aplique o "swab" com pressão na superfície a ser analisada, inclinando-o a 45° e fazendo movimentos da esquerda para a direita e de cima para baixo. Gire continuamente o "swab" para que toda a superfície do algodão entre em contato com a amostra. Devolva o "swab" ao tubo, quebrando a parte manuseada da haste antes de mergulhá-lo na solução diluente. Agite a solução diluente contendo o "swab" no vortex por 2 minutos. Inocule 0,1 mL da solução diluente em uma placa de Petri estéril contendo o meio PCA, abrindo a placa apenas o suficiente para introduzir o inóculo e espalhar com a alça de Drigalski, próximo ao bico de Bunsen. Inverta as placas e incube a 35°C por 48 horas. 5. Equipamentos Utilizados 6. Meios de Cultura 7. Método Técnica do Esfregaço de Superfície: 8.Contagem pelo Método de Plaqueamento em Superfície: 13 @tecno_alimentos 14 45° ROTEIRO PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE SUPERFÍCIES @tecno_alimentos 0,1mL 35°C POR 48 HORAS Cálculo: Contar as colônias com auxílio de uma lupa em um contador. Calcular o número de unidades formadoras de colônias por centímetro quadrado (UFC/cm ) UFC/cm = UFC/mL da suspensão x Área amostrada 2 2 Volume do diluente de coleta PLAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE (PUR PLATE) Amostra de alimento Meio de cultura adequado (como Agar Nutriente) Pipetas automática ou volumétrica Placas de Petri estéreis Agar derretido (meio fundente) Estufa Incubadora microbiológica Contador de colônias ou software de análise de imagem (opcional) Pese ou meça a amostra de alimento de acordo com a metodologia padrão. Se necessário, dilua a amostra em água peptonada para obter uma concentração apropriada de microrganismos. Objetivo da Análise: O objetivo do plaqueamento em profundidade, também conhecido como técnica de "pour plate" ou Pur Plate, é determinar o número total de microrganismos viáveis presentes em uma amostra de alimento. Essa técnica é usada para avaliar a contagem total de bactérias e outros microrganismos na amostra, fornecendo informações sobre a qualidade microbiológica do alimento. Materiais Necessários: 1. Preparação da Amostra: 15 @tecno_alimentos 07 PLAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE (PUR PLATE) Rotule as placas de Petri no fundo com informações relevantes, como a amostra e a diluição. Mantenha as placas abertas em uma bancada estéril. Mantenha o meio de cultura preparado em banho-maria para evitar a solidificação. Verter de 12 a 15 mL cuidadosamente de meio de cultura derretido em cada placa inoculada, cobrindo completamente a superfície. Agite suavemente em movimentos na forma de oito ou movimentos circulares. Deixe as placas em repouso até que o meio solidifique. Incube as placas invertidas em estufa bacteriológica a uma temperatura e por um tempo adequados para permitir o crescimento dos microrganismos (geralmente entre 30°C e 37°C, dependendo do microrganismo em questão). Após a incubação, observe e conte as colônias visíveis nas placas. Use um contador de colônias ou software de análise de imagem, se disponível. Calcule a contagem de microrganismos viáveis na amostra com base na diluição feita e no número de colônias nas placas. Relate os resultados em unidades formadoras de colônias por grama ou mililitro (UFC/g ou UFC/mL), de acordo com a concentração inicial da amostra. 2. Preparação das Placas: 3. Inoculação: Geralmente a inoculação é feita para vários ensaios simultaneamente. Para o ensaio conduzido, selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 1 mL de cada diluição em placas de petri vazias, abrindo as placas suficiente para inserir a pipeta. Trabalhar em uma capela de fluxo laminar próximo à chama do bico de Busen. 4. Adição do Agar Derretido: 5. Incubação e Contagem de Colônias: 6. Cálculo e Relatório de Resultados: Para calcular a contagem de UFC/mL, use a fórmula: UFC/mL = (Número de colônias contadas) / (Volume da diluição inoculado na placa, em mL) Por exemplo, se você contou 50 colônias em uma placa e inoculou 1 mL da diluição, o cálculo seria: UFC/mL = 50 / 1 = 50 UFC/mL 16 @tecno_alimentos 17 Amostra de alimento Meio de cultura adequado (como Agar Nutriente) Pipetas estéreis Placas de Petri estéreis Alça bacteriológica estéril Incubadora microbiológica Contador de colônias ou software de análise de imagem (opcional). Prepare o meio de cultura de acordo com as instruções do fabricante. Certifique-se de que o meio esteja devidamente dissolvido e autoclavado para esterilização. Pese ou meça a amostra de alimento de acordo com a metodologia padrão. Se necessário, dilua a amostra em água peptonada ou solução salina para obter uma concentração apropriada de microrganismos. Objetivo da Análise: O objetivo do plaqueamento em superfície, também conhecido como técnica de "spread plate", é determinar o número total de microrganismos viáveis presentes em uma amostra de alimento. Essa técnica é usada para avaliar a contagem total de bactérias e outros microrganismos na amostra, fornecendo informações sobre a qualidade microbiológica do alimento. Materiais Necessários: Procedimento: 1. Preparação do Meio de Cultura: 2. Preparação da Amostra: PLAQUEAMENTO EM SUPERFÍCIE (SPREAD PLATE) @tecno_alimentos 08 PLAQUEAMENTO EM SUPERFÍCIE (SPREAD PLATE) 3. Preparação das Placas: Prepare as placas previamente com meio de cultura. Rotule as placas de Petri com informações relevantes, como a amostra e a diluição. Para cada ensaio em andamento, é necessário escolher três diluições apropriadas da amostra para a inoculação. Utilizando uma pipeta com capacidade máxima de 1 mL (com divisões de 0,1 mL), injete 0,1 mL de cada diluição na superfície das placas previamente preparadas. É essencial observar com precisão se a placa usada corresponde à amostra e à diluição que está sendo inoculada, bem como se possui o meio de cultura adequado. Incube as placas a uma temperatura e por um tempo adequados para permitir o crescimento dos microrganismos (geralmente entre 30°C e 37°C, dependendo do microrganismo em questão). Após a incubação, observe e conte as colônias visíveis nas placas. Use um contador de colônias ou software de análise de imagem, se disponível. Calcule a contagem de microrganismos viáveis na amostra com base na diluição feita e no número de colônias nas placas. Relate os resultados em unidades formadoras de colônias por grama ou mililitro (UFC/g ou UFC/mL), de acordo com a concentração inicial da amostra. 4. Inoculação da Amostra: 5. Incubação e Contagem de Colônias: 6. Cálculo e Relatório de Resultados: 18@tecno_alimentos Número de Colônias Contadas: Conte o número total de colônias visíveis nas placas após a incubação. Volume da Amostra Inoculada em mL: Este é o volume da amostra que você inoculou na placa no início do procedimento. É importante usar o volume correto. Fator de Diluição: Se você fez diluições da amostra antes da inoculação, você precisará considerar o fator de diluição. O fator de diluição é o inverso da diluição aplicada. Por exemplo, se você fez uma diluição de 1:10, o fator de diluição é 10. Compare os resultados obtidos com os limites aceitáveis de contagem microbiológica para alimentos, de acordo com as regulamentações e padrões locais Cálculo do número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por grama ou mililitro com base na contagem de colônias nas placas. Para isso, siga este cálculo: Fórmula de Cálculo: UFC/g ou mL = (N° de colônias contadas)/ (Volume da amostra Inoculada em mL) x (Fator da diluição) Passo a Passo: 1. 2. 3. Interpretação dos Resultados: PLAQUEAMENTO EM SUPERFÍCIE (SPREAD PLATE) 19 @tecno_alimentos 20 PLAQUEAMENTO EM GOTAS (DROP PLATE) Amostra de alimento Meio de cultura adequado (como Agar Nutriente) Pipetas estéreis com capacidade para gotas Placas de Petri estéreis Incubadora microbiológica Contador de colônias ou software de análise de imagem (opcional) Preparação do Meio de Cultura: Prepare o meio de cultura de acordo com as instruções do fabricante. Certifique-se de que o meio esteja devidamente dissolvido e autoclavado para esterilização. Preparação da Amostra: Pese ou meça a amostra de alimento de acordo com a metodologia padrão. Se necessário, dilua a amostra em água estéril para obter uma concentração apropriada de microrganismos. Preparação das Placas: Coloque meio de cultura nas placas. Deixe as placas em repouso até que o meio solidifique. Rotule as placas de Petri no fundo com informações relevantes, como a amostra e a diluição. Inoculação da Amostra: Dividir a placa em 9 setores (ou 4 conforme a necessidade), delineando o fundo com uma caneta vidrográfica através da criação de três linhas horizontais e três linhas verticais. 1. Objetivo da Análise: O objetivo do plaqueamento em gotas, também conhecido como técnica de "drop plate", é determinar o número total de microrganismos viáveis presentes em uma amostra de alimento. Essa técnica é usada para avaliar a contagem total de bactérias e outros microrganismos na amostra, fornecendo informações sobre a qualidade microbiológica do alimento. 2. Materiais Necessários: 3. Procedimento: @tecno_alimentos 09 21 Antes de coletar o volume de cada diluição para a inoculação nas placas, é fundamental agitar vigorosamente os tubos de diluição, fazendo 25 inversões em um arco de 30 cm ou usando um agitador do tipo "vortex". Coloque três gotas de 0,01 mL de cada diluição em três quadrados adjacentes da placa (triplicata). Execute esse procedimento com cuidado para evitar que as gotas se espalhem para fora dos quadrados designados. Não é necessário espalhar as gotas. Mantenha as placas em uma superfície plana e aguarde cerca de 30 minutos até que o líquido seja completamente absorvido pelo meio de cultura. 4. Observação: Para cada ensaio em andamento, é necessário selecionar três diluições adequadas da amostra para a inoculação. A seleção das diluições deve ser baseada na estimativa do nível de contaminação da amostra, com o objetivo de obter gotas contendo, no máximo, 30 colônias. No entanto, deve-se considerar que a técnica de plaqueamento em gotas não é apropriada para amostras com um nível de contaminação inferior a 1.000 UFC/g ou 100 UFC/mL. 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL PLAQUEAMENTO EM GOTAS (DROP PLATE) @tecno_alimentos 10-1 10-2 10-3 10-4 Amostra 10-1 10-2 10-3 10-4 Para contar as colônias presentes nas gotas com um máximo de 30 colônias, siga o procedimento a seguir para calcular o número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por grama ou mililitro: Calcule a média do número de colônias presentes nas três gotas da diluição que foi inoculada. Multiplique essa média pelo inverso da diluição utilizada. Em seguida, multiplique o resultado por 100 para levar em consideração o volume inoculado. A fórmula para o cálculo é a seguinte: (UFC/g ou ml = Número de Colônias X 100/diluição). Esse cálculo permitirá determinar a contagem de Unidades Formadoras de Colônias por grama ou mililitro com base nas colônias presentes nas três gotas inoculadas e na diluição aplicada. Descarte as placas de Petri de acordo com as normas de segurança e regulamentações. 5. Incubação e Contagem de Colônias: Incube as placas a uma temperatura e por um tempo adequados para permitir o crescimento dos microrganismos (geralmente entre 30°C e 37°C, dependendo do microrganismo em questão). Após a incubação, observe e conte as colônias visíveis nas placas. Use um contador de colônias ou software de análise de imagem, se disponível. 6. Cálculo e Relatório de Resultados: As orientações fornecidas neste tópico são aplicáveis a ensaios nos quais todas as colônias que se desenvolvem nas placas, após o período de incubação, são contadas e incluídas no cálculo. 7. Descarte Adequado: 22 PLAQUEAMENTO EM GOTAS (DROP PLATE) @tecno_alimentos Amostras a serem testadas Meio de cultura seletivo apropriado Tubos de ensaio Tubo de Durhan Pipetas graduadas Incubadora Tabela de NMP Água estéril Bico de Bunsen Rack para tubos de ensaio Objetivo: Demonstrar o processo de contagem de coliformes usando a técnica do Número Mais Provável (NMP). Materiais Necessários: Procedimento: Preparação dos Tubos de Ensaio Colocar no fundo do tubo de ensaio, um tubo invertido para coleta de gás (tubo de Durhan). Preparação do Meio de Cultura Prepare o meio de cultura seletivo de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar o meio no tubo de ensaio. Esterilize os tubos de ensaio na autoclave. 23 TÉCNICAS BÁSICAS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS PELO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) @tecno_alimentos 10 Quantidade de Amostra Transferida: Geralmente, transfere-se 10 mL, 1 mL e 0,1 mL da amostra para o tubo contendo meio de cultura. Essa alíquota é cuidadosamente medida e adicionada ao tubo para permitir o crescimento dos coliformes totais, caso estejam presentes na amostra. Capacidade do Tubo de Ensaio: O tubo de ensaio utilizado para essa fase geralmente tem uma capacidade de 10 mL. 1. Procedimento: A fase presuntiva da análise de coliformes totais envolve a transferência de uma alíquota da amostra para um tubo contendo meio de cultura. Embora a quantidade específica de amostra a ser transferida e a capacidade exata do tubo possam variar dependendo do protocolo e dos padrões do laboratório, as quantidades típicas são as seguintes: 24 10 mL por tubo 1 mL por tubo 0,1 mL por tubo Incubação a 35 °C/24 h: formação de gás: NMP @tecno_alimentos Amostra 10 mL de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) 25 2. Fase Confirmatória: Nesta etapa conhecida como análise de coliformes termotolerantes, realiza-se o repique dos tubos presuntivos que apresentaram resultado positivo. O repique envolve a transferência de alíquotas desses tubos, usando alças de platina, para tubos preparados da mesma maneira que na fase anterior, com a diferença de que agora eles contêm caldo verde brilhante. Todos os tubos são então incubados a uma temperatura de 35°C por um período de 24 h. Após a incubação, procede-se à identificação daqueles tubos que apresentaram crescimento positivo de coliformes totais. Essa identificação é feita com base na ocorrência de produção de gás nos tubos de Durhan. A técnica do NMP, que envolve a combinação de tubos positivos e negativos, possibilita estimar a densidade do(s) microrganismo(s) alvo na amostra através de cálculos de probabilidade. Esses cálculos podem ser realizados utilizando diversas fórmulas. No entanto, para as combinações de tubos positivos e negativos mais comuns, os valores já foram previamente calculados e estão disponíveis em tabelas de NMP, eliminando anecessidade de aplicar fórmulas. Em casos em que ocorrem combinações menos frequentes e não estão listadas nas tabelas, é recomendável repetir o ensaio para confirmar a ocorrência da combinação antes de calcular o resultado utilizando as fórmulas. CONTAGEM DE COLIFORMES USANDO A TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) @tecno_alimentos 26 Combinação de tubos + NMP/g ou mL 0-0-0 <3,0 0-0-1 3,0 0-1-0 3,0 0-1-1 6,1 0-2-0 6,2 0-3-0 9,4 1-0-0 3,6 1-0-2 7,2 1-1-0 11 1-1-1 7,4 1-2-0 11 1-2-1 11 1-3-0 15 2-0-0 16 2-0-1 9,2 2-0-2 20 2-1-0 15 CONTAGEM DE COLIFORMES USANDO A TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) @tecno_alimentos Combinação de tubos + NMP/g ou mL 0-0-0 <3,0 0-0-1 3,0 0-1-0 3,0 2-1-1 20 2-1-2 27 2-2-0 21 2-2-1 28 2-2-2 35 2-3-0 29 2-3-1 36 3-0-0 23 3-0-2 64 3-1-0 43 3-1-1 75 3-1-2 120 3-1-3 160 3-2-0 93 Combinação de tubos + NMP/g ou mL 3-2-1 150 3-2-2 210 3-2-3 290 3-3-0 240 3-3-1 460 3-3-2 1100 3-3-3 >1100 Fonte: Bacteriological Analytical Manual (Blodgett, 2006). 27 @tecno_alimentos A Escherichia coli (E. coli) é um microrganismo que pertence tanto ao grupo dos coliformes totais quanto dos coliformes termotolerantes. Seu habitat natural é o trato intestinal de animais de sangue quente, como humanos e mamíferos. No entanto, essa bactéria também pode ser introduzida em alimentos a partir de fontes não fecais. A distinção tradicional da E. coli dos demais coliformes termotolerantes é baseada em características de crescimento em meios de cultura específicos, como o Ágar L-EMB (Levine Eosina Azul de Metileno), bem como em perfis de testes bioquímicos, incluindo testes de indol, vermelho de metila, Voges Proskauer e citrato (conhecido como IMViC). Esses métodos permitem identificar e diferenciar a E. coli de outros coliformes termotolerantes, sendo essenciais para avaliar a qualidade e a segurança dos alimentos. 1. Após a análise coliformes termotolerantes A partir de cada tubo de EC que apresentar turvação e produção de gás em 24 ou 48 horas, realize uma semeadura de uma alça desses tubos positivos em placas de Ágar MacConkey Eosina Azul de Metileno (EAM), identificando-as adequadamente. Incube as placas a uma temperatura de 35-37°C por 24 horas e observe se ocorre o crescimento de colônias com características típicas de E. coli, as quais são nucleadas com centro preto e podem ou não apresentar brilho metálico. Na presença de colônias com características típicas, faça a transferência de colônias bem isoladas de cada placa para tubos contendo Ágar Padrão para Contagem (PCA) inclinados e incubados a uma temperatura de 35-37°C por 24 horas. A partir das colônias puras cultivadas em PCA, realize os testes bioquímicos, que incluem os testes de Indol, Voges-Proskauer (VP), Vermelho de Metila (VM) e Citrato (IMViC). Alternativamente, os testes bioquímicos podem ser conduzidos diretamente a partir das colônias com características distintivas presentes nas placas de EAM, contanto que essas colônias estejam devidamente isoladas. ESCHERICHIA COLI Fo nt e: G oo gl e im ag en s 11 Teste de Citrato Teste de Indol 2. Confirmação Realize a transferência de uma pequena quantidade da cultura para a superfície inclinada dos tubos de citrato de Simmons e incube a uma temperatura de 35°C por 96 horas. A presença de crescimento acompanhado pela mudança de coloração do meio de verde para azul indica um resultado positivo no teste. Caso não haja crescimento e a coloração do meio permaneça inalterada (verde), o resultado é negativo. Vale destacar que E. coli demonstra resultado negativo para o teste de citrato. Inocule uma alça com inóculo da cultura em caldo de triptona a 1% e incube a uma temperatura de 35-37°C por 24 horas. Adicione aproximadamente 5 gotas do reagente de Kovacs a cada 4,0 mL da cultura. Observe se ocorre o desenvolvimento de um anel na cor vermelho-violeta na superfície do meio de cultura, o que indica um teste positivo. Caso o anel permaneça na cor amarela do reagente, o resultado é negativo. E. coli típica demonstra resultado positivo para o teste de indol, enquanto as atípicas apresentam resultado negativo. 28 @tecno_alimentos Fo nt e: re ny la b Fo nt e: h ttp s: //w w w .u frg s. br /a ul as pr at ic as de m ip https://www.renylab.ind.br/wp-content/uploads/2018/05/%C3%81GAR-CITRATO.pdf https://www.ufrgs.br/aulaspraticasdemip 3. Confirmação Teste VM-VP Inocule uma alça com inóculo da cultura e incube a 35-37°C por 48 horas. Para o teste de VP, transfira 1 mL da cultura de forma asséptica para um tubo de ensaio e adicione 0,6 mL de solução de alfa-naftol a 5%, agitando a mistura. Em seguida, acrescente 0,2 mL de solução de KOH a 40% e continue agitando. Deixe a mistura em repouso e observe periodicamente, por até 1 hora, o desenvolvimento de uma coloração vermelha ou rosa no meio da cultura, o que indica um resultado positivo. A permanência da coloração amarela ou levemente esverdeada indica um resultado negativo. É importante mencionar que as cepas de E. coli são negativas para o teste de VP. Reincube a cultura restante no caldo VM-VP por mais 24 horas adicionais e realize o teste VM com 96 horas de incubação. Para conduzir o teste, adicione 2,5 mL da cultura e 5 gotas da solução de vermelho de metila, observando imediatamente se o meio adquire uma coloração vermelha (resultado positivo) ou amarela (resultado negativo). As cepas de E. coli demonstram resultado positivo no teste VM. 29 @tecno_alimentos ht tp s: //w w w .ib b. un es p. br /H om e/ en si no /d ep ar ta m en to s/ m ic ro bi ol og ia ei m un ol og ia /a ul a- en te ro ba ct er ia ce ae -p ar a- ve te rin ar ia -2 01 9. pd f Resultado do teste do Vermelho de Metila (VM). Tubo à esquerda: VM negativo. Tubo à direita: VM positivo ht tp s: //w w w .u frg s. br /a ul as pr at ic as de m ip /? pa ge _i d= 27 https://www.ibb.unesp.br/Home/ensino/departamentos/microbiologiaeimunologia/aula-enterobacteriaceae-para-veterinaria-2019.pdf https://www.ibb.unesp.br/Home/ensino/departamentos/microbiologiaeimunologia/aula-enterobacteriaceae-para-veterinaria-2019.pdf https://www.ibb.unesp.br/Home/ensino/departamentos/microbiologiaeimunologia/aula-enterobacteriaceae-para-veterinaria-2019.pdf https://www.ufrgs.br/aulaspraticasdemip/?page_id=27 https://www.ufrgs.br/aulaspraticasdemip/?page_id=27 Esquema geral Teste presuntivo 35 °C/ 24 h-48 h Teste confirmativo Coliformes Termotolerantes 30 @tecno_alimentos Homogeneização 10-1 1 mL 1 mL 9 mL H2Op 9 mL H2Op 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL1 mL 25g de amostra + 225 mL de água peptonada (H2Op) Tubos de LST Crescimento e produção de gás 1 alçada 1 alçada Banho-maria Contagem de coliformes termotolerantes NMP/g 1 alçada Após 24 h de incubação Confirmação de E.coli Teste confirmativo Coliformes Totais Caldo verde Brilhante Bile (VB) 2% 35 °C 24-48 h Contagem de coliformes totais Ágar Levine Eosina Azul de Metileno (L-EMB) SÉRIE BIOQUÍMICA TESTE DE CITRATO (-) Tubos confirmados CONTAGEM DE E. coli NMP/g 35° C/48h (VP) 35 °C/96 h (VM) TESTE DE VP(-) VM (+) 35 °C/24 h TESTE DE VP(-) VM (+) Continuação: Confirmação de E.coli 31 @tecno_alimentos Estrias de esgotamento 35 °C/24 o h Colônias Típicas Ágar Padrão para Contagem (PCA) T 35 °C/24 h Caldo Citrato de Koser ou Ágar Citrato de Simonns 35 °C/96 h Caldo VM-VP Caldo Triptona 1% Coloração de Gram Bastonetes Gram negativos PESQUISA DE SALMONELLA Domínio: Bactéria Filo: Proteobacteria Classe: Gammaproteobacteria Ordem: Enterobacterales Família: Enterobacteriaceae Gênero: Salmonella Homogeneizar 25g ou 25ml da amostra em 225ml de Água Peptonada Tamponada (BPW). Incubar a 37±1°C por 18±2 horas. Transferir 0,1ml da cultura pré-enriquecida (BPW) para 10ml de Caldo Rappaport- Vassilidis Soja (RVS) e 1ml para 10ml de Caldo Tetrationato Muller Kauffmann Novobiocina (MKTTn). Incubar o CaldoRVS a 41,5±1°C por 24±3 horas e o Caldo MKTTn a 37±1°C por 24±3 horas. 3. Plaqueamento Diferencial: Estriar uma alçada de culturas em RVS em Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e outra alçada em um segundo meio (escolha do laboratório). Incubar as placas de XLD invertidas a 37±1°C por 24±3 horas. A classificação taxonômica de Salmonella é a seguinte: Salmonella é um gênero de bactérias Gram-negativas pertencente à família Enterobacteriaceae. Essas bactérias são amplamente conhecidas por causar infecções alimentares em seres humanos e em outros animais. Elas são subdivididas em várias espécies e subespécies, com a Salmonella enterica sendo uma das mais importantes em termos de saúde pública, sendo responsável por muitas doenças transmitidas por alimentos em todo o mundo. Roteiro Simplificado para Pesquisa de Salmonella em Alimentos: 1. Pré-enriquecimento: 2. Enriquecimento Seletivo: 32 @tecno_alimentos 12 Verificar o desenvolvimento de colônias típicas de Salmonella no Ágar XLD, que são rosa escuro com centro preto e uma zona avermelhada ao redor. Marcar cinco colônias típicas ou todas, se houver menos de cinco, no fundo de cada placa. Selecionar uma colônia para confirmação; se o resultado for negativo, confirmar as outras. Estriar a cultura de cada colônia selecionada em uma placa de Ágar Nutriente (NA) para purificação. Incubar as placas de NA invertidas a 37±1°C por 24±3 horas. Tubos confirmados: Inocular cada cultura em um tubo com 5ml de Caldo Triptona 1% suplementado com 1g/l de DL-Triptofano e incubar a 37±1°C por 24±3 horas. Adicionar 1ml do Reagente de Kovacs para teste de indol para cada 5ml de cultura e observar se ocorre a formação de um anel vermelho-violeta na superfície do meio (teste positivo). Um anel amarelado (cor do reagente) indica teste negativo. Desenvolvimento de vários tons entre vermelho e rosa é indeterminado. 4. Seleção e Purificação: 5. Confirmação Bioquímica: PESQUISA DE SALMONELLA 33 Fo to : S ite L ab or cl in Fo to : i si te M ic ro bi ol og y. in fo @tecno_alimentos Teste da Urease: A urease é uma enzima produzida por algumas bactérias, incluindo Salmonella. Um teste de urease detecta a capacidade da bactéria de hidrolisar a ureia. A alcalinização do meio indica resultado positivo. Teste de Voges-Proskauer (VP): O teste VP é usado para verificar a produção de acetoina pelas bactérias. Salmonella é negativa para VP, o que significa que não produz acetoina. Teste de Citrato: O teste de citrato verifica a capacidade da bactéria de usar o citrato como única fonte de carbono. A alcalinização do meio indica teste positivo. Teste da Redução de Nitrato: Algumas cepas de Salmonella são capazes de reduzir o nitrato a nitrito. A presença de nitrito no meio após a adição de reagentes indica um teste positivo. Teste do Triple Sugar Iron (TSI): O TSI é um meio de cultura que contém três açúcares (glicose, lactose e sacarose) e sulfeto de ferro. A observação de características específicas no TSI pode ajudar a confirmar a presença de Salmonella. Teste de Produção de H2S: O teste verifica a produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) por Salmonella. A formação de um precipitado preto no meio indica um teste positivo. Caso necessário, realizar testes sorológicos para confirmar a presença de Salmonella. Além do teste de indol, existem vários outros testes bioquímicos que podem ser realizados para confirmar a presença de Salmonella. Alguns desses testes incluem: Lembrando que a seleção dos testes bioquímicos a serem realizados pode variar de acordo com o laboratório e os protocolos específicos utilizados. Certifique-se de seguir as práticas padrão de microbiologia e as diretrizes do método adotado em seu laboratório ou regulamentadas por autoridades de saúde locais. 6. Confirmação Sorológica: PESQUISA DE SALMONELLA 34 @tecno_alimentos Coloque duas gotas de solução salina em uma lâmina de vidro. Em uma das gotas, adicione o antissoro. Nas duas gotas, adicione uma parte da colônia suspeita. Realize movimentos de rotação e inclinação na lâmina. Observe se ocorre aglutinação, comparando com a gota de controle. Antígeno Poli O (O): O antígeno Poli O é um componente das bactérias Salmonella que está presente na parede celular, mais especificamente na região dos polissacarídeos O (lipopolissacarídeo). É a parte mais externa da estrutura celular da Salmonella. A variedade de antígenos O é vasta, com diferentes cepas de Salmonella apresentando diferentes tipos de antígenos O. A identificação dos antígenos O é essencial para classificar as diferentes cepas de Salmonella. Antígeno Poli H (H): O antígeno Poli H refere-se aos flagelos (filamentos móveis) das bactérias Salmonella. Esses flagelos contêm proteínas que são usadas para locomoção. Assim como os antígenos O, os antígenos H também variam entre as cepas de Salmonella, permitindo a distinção e a classificação dessas bactérias. 7. Sorologia para detecção dos antígenos somáticos (poli O e poli H): Se a aglutinação ocorrer em ambas as gotas, isso indica que a cepa é autoaglutinante e não são necessários testes sorológicos adicionais. Os termos "poli O" e "poli H" estão relacionados aos antígenos somáticos de bactérias do gênero Salmonella e são importantes para a sua identificação e classificação. Vamos entender o significado de cada um: PESQUISA DE SALMONELLA 35 @tecno_alimentos Selecionar três diluições adequadas da amostra. Inocular 0,1 ml de cada diluição na superfície de placas de Ágar Baird-Parker (BP) preparadas e secas. Distribuir o inóculo, utilizando uma alça de Drigalski, das placas de maior diluição para as placas de menor diluição, até que todo o excesso de líquido seja absorvido. Deixar as placas secarem completamente. Incubar as placas, invertidas, a 35-37°C por 45-48 horas. Selecionar para contagem as placas com 20 a 200 colônias, a menos que as colônias típicas estejam presentes em placas mais cheias. Contar somente as colônias típicas de S. aureus, que são circulares, pretas ou cinza- escuras, com 2-3 mm de diâmetro (em placas cheias são menores, cerca de 1,5 mm), lisas, convexas, com bordas perfeitas, massa de células esbranquiçada nas bordas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente se estendendo para além da zona opaca. As cepas de Staphylococcus aureus são cocós Gram-positivos que têm uma característica distintiva: dividem-se em múltiplos planos, formando aglomerados de células que se assemelham a cachos de uvas. São microrganismos anaeróbios facultativos, o que significa que podem crescer em ambientes com ou sem oxigênio, e testam positivo para a enzima catalase. A identificação específica de S. aureus é baseada em três testes: o teste de coagulase, que avalia a capacidade de coagulação do plasma sanguíneo, o teste de DNAse termoestável, que verifica a resistência ao calor de uma enzima que decompõe o DNA, e o teste de redução do telurito, que também produz um resultado positivo. Vale mencionar que algumas outras espécies de Staphylococcus podem demonstrar uma produção leve de coagulase, o que torna essencial que apenas as cepas que demonstram forte positividade nesse teste sejam classificadas como S. aureus. Roteiro para Contagem de Staphylococcus coagulase positiva 1.Inoculação: 2.Incubação e Contagem das Colônias Presuntivas STAPHYLOCOCCUS AUREUS 36 @tecno_alimentos 13 Selecionar no mínimo cinco colônias típicas para o teste de coagulase. Se houver menos do que cinco, selecionar todas. Se a placa apresentar colônias suspeitas de mais de um tipo, selecionar pelo menos duas de cada tipo. Transferir cada colônia para tubos de Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI), emulsionar bem a massa de células com o caldo e transferir uma alçada de cada tubo de BHI para tubos com Ágar Tripticase de Soja (TSA) inclinados. Incubar todos os tubos a 35-37°C por 18-24 horas. Reservar a cultura em TSA para testes adicionais, se necessários. Transferir 0,2 ml de cada cultura obtida em BHI para um tubo estéril de 10x100 mm. Adicionar 0,5 ml de Coagulase Plasma-EDTA(plasma de coelho com EDTA) aos 0,2 ml de cultura. Misturar com movimentos de rotação, sem agitar os tubos, para não interferir na coagulação. Incubar a 35-37°C e observar periodicamente, durante seis horas, se há formação de coágulo. Não agitar os tubos durante a observação. A coagulação completa de todo o conteúdo do tubo, formando um coágulo firme que não se rompe quando o tubo é virado para baixo, é considerada reação positiva de nível 4+. A coagulação da maior parte do conteúdo do tubo, formando um coágulo grande e organizado, é considerada reação positiva de nível 3+. A formação de um pequeno coágulo organizado ou de pequenos coágulos desorganizados caracteriza reações positivas de nível 2+ ou 1+. As reações de nível 3+ ou 4+ confirmam a presença de S. aureus coagulase positivo. Culturas com reações positivas de nível 1+ ou 2+ devem ser submetidas a testes adicionais (coloração de Gram, catalase, termonuclease e sensibilidade à lisostafina) para confirmação. 3.Confirmação das Colônias Típicas: 4.Teste de Coagulase: 37 @tecno_alimentos CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS Fo nt e: s ite la bo rc lin Staphylococcus aureus meio Baird Parker + suplemento de telurito gema de ovo Características: colônias pretas e brilhantes Selecionar no mínimo cinco colônias típicas para o teste de coagulase. Se houver menos do que cinco, selecionar todas. Se a placa apresentar colônias suspeitas de mais de um tipo, selecionar pelo menos duas de cada tipo. Transferir cada colônia para tubos de Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI), emulsionar bem a massa de células com o caldo e transferir uma alçada de cada tubo de BHI para tubos com Ágar Tripticase de Soja (TSA) inclinados. Incubar todos os tubos a 35-37°C por 18-24 horas. Reservar a cultura em TSA para testes adicionais, se necessários. Transferir 0,2 ml de cada cultura obtida em BHI para um tubo estéril de 10x100 mm. Adicionar 0,5 ml de Coagulase Plasma-EDTA (plasma de coelho com EDTA) aos 0,2 ml de cultura. Misturar com movimentos de rotação, sem agitar os tubos, para não interferir na coagulação. Incubar a 35-37°C e observar periodicamente, durante seis horas, se há formação de coágulo. Não agitar os tubos durante a observação. A coagulação completa de todo o conteúdo do tubo, formando um coágulo firme que não se rompe quando o tubo é virado para baixo, é considerada reação positiva de nível 4+. A coagulação da maior parte do conteúdo do tubo, formando um coágulo grande e organizado, é considerada reação positiva de nível 3+. A formação de um pequeno coágulo organizado ou de pequenos coágulos desorganizados caracteriza reações positivas de nível 2+ ou 1+. As reações de nível 3+ ou 4+ confirmam a presença de S. aureus coagulase positivo. Culturas com reações positivas de nível 1+ ou 2+ devem ser submetidas a testes adicionais (coloração de Gram, catalase, termonuclease e sensibilidade à lisostafina) para confirmação. 6.Confirmação das Colônias Típicas: 7. Teste de Coagulase: 38 @tecno_alimentos CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS Fo nt e: S ite B io m ed ic in a pa dr ão A partir dos tubos de TSA inclinados, emulsionar uma alçada da cultura em uma gota de água oxigenada (peróxido de hidrogênio) 3%, em uma lâmina de vidro. Observar se ocorre borbulhamento imediato (teste positivo) ou não (teste negativo). As cepas de S. aureus são catalase positivas. Considerar como S. aureus todas as culturas com reação 8.Teste de Catalase: 9.Interpretação e Cálculo dos Resultados: Exemplo Calcular o número de UFC/g ou ml levando em consideração o número de colônias típicas contadas, a diluição inoculada e a percentagem de colônias confirmadas. Exemplo 1: Diluição 10-2, 30 colônias típicas, cinco submetidas à confirmação, três confirmadas (60%). UFC/g ou ml = (30 colônias x 10^2 (fator de diluição) x 10 (volume da diluição inoculada) x 0,6) = 1,8 x 10^4. Exemplo 2: Diluição 10-2, 40 colônias suspeitas (30 de um tipo e 10 de outro tipo), 15 submetidas à confirmação (dez do primeiro tipo e cinco do segundo tipo), onze confirmadas (dez do primeiro tipo = 100% e uma do segundo tipo = 20%). UFC/g ou ml = [(30 colônias x 10^2 x 10 x 1) + (10 colônias x 10^2 x 10 x 0,2)] = 3,2 x 10^4. 39 @tecno_alimentos CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS 40 @tecno_alimentos FLUXOGRAMA GERAL Homogeneização 25 g amostra + 225ml de Água Peptonada 10-1 1 mL 10-2 9 mL Água Peptonada 1 mL 10-3 9 mL Água Peptonada 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL Ágar Baird-Parker (BP) (plaqueamento em superfície) 35-37 °C/45-48h Colônia típica Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI) TESTE DE COAGULASE 35-37 °C/18-24h Ágar Tripticase de Soja (TSA) 1 alçada 35-37 °C/18-24h Manutenção para testes adicionais (se requeridos) Assegure que todos os materiais, incluindo pipetas, alças de Drigalski, placas de Ágar Plate Count (APC), tubos de Caldo Plate Count (CPC), e outros equipamentos, estejam esterilizados. Prepare o meio de cultura Ágar Plate Count (APC) de acordo com as instruções específicas do fabricante. Pese uma porção 25g da amostra. Adicione a amostra pesada em um saco de homogeneização apropriado e dilua-a em 225 mL de solução peptonada 0,1% (H2Op) ou outro diluente especificado nos procedimentos do laboratório. Homogeneíze a mistura, utilizando um homogeneizador ou outra técnica adequada, para garantir uma distribuição uniforme dos microrganismos na amostra. Os microrganismos mesófilos totais são um grupo diversificado de organismos microscópicos que desempenham um papel crucial nos ecossistemas naturais, na indústria alimentar, na ciência e na pesquisa. Esta categoria de microrganismos inclui uma ampla variedade de bactérias, leveduras e bolores que prosperam em condições de temperatura moderada. O termo "mesófilos" refere-se ao seu comportamento termofílico, o que significa que eles prosperam em temperaturas que variam de aproximadamente 20°C a 45°C, uma faixa de temperatura que é ideal para muitas atividades biológicas. A contagem de microrganismos mesófilos totais é uma técnica essencial na microbiologia de alimentos e na análise ambiental. Ela permite a quantificação de microrganismos presentes em uma amostra, fornecendo informações valiosas sobre a qualidade microbiológica de alimentos, água, ar e outros substratos. Além disso, auxilia na determinação do potencial de deterioração de alimentos e na avaliação das condições de higiene e segurança em ambientes diversos. 1.Preparação de Materiais e Meios de Cultura 2. Pesagem da Amostra 3. Homogeneização da Amostra 41 @tecno_alimentos MICRORGANISMOS MESÓFILOS TOTAIS 14 Para fazer uma diluição seriada, comece retirando 1 mL da amostra e transfira-o para um tubo de ensaio que contém 9 mL de água peptonada tamponada 0,1% (diluição 10-2). A partir dessa primeira diluição, você pode realizar mais diluições, adicionando 1 mL da solução em um tubo de 9 mL de água peptonada tamponada 0,1%, repetindo o processo até atingir a diluição desejada. Em seguida, coloque cerca de 15 a 20 mL de ágar em cada placa e homogeneíze cuidadosamente o ágar com o inóculo. (Essa instrução é para plaqueamento em profundidade, porém, existem métodos que utiliza em superfície. Realize a inoculação de maneira cuidadosa e assegure-se de que o excesso de líquido seja absorvido completamente pelo meio. Deixe as placas solidificarem em uma superfície plana e, posteriormente, incubá-las invertidas a uma temperatura de 30±1°C por 72±3 horas. 4. Inoculação e Plaqueamento 5. Incubação 6. Cálculo Calcule o número de UFC (Unidades Formadoras de Colônia) por grama (UFC/g) ou por mililitro (UFC/mL) da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada. Se mais de uma placa foi usada por diluição, considere o número de colônias como a média aritmética das contagens obtidas em cada uma das placas da duplicata. O resultado deve ser expresso em UFC/g ou UFC/mL UFC/g ou mL = 𝑈𝐹𝐶/𝑔 = ∑𝑐/𝑉. 1,1. 𝑑 Onde: ∑𝑐 = soma das colônias contadas em duas placas de duas diluições consecutivas 𝑉 = volume decada diluição colocado nas placas (mL) 𝑑 = primeira diluição cuja placa foi contada 42 @tecno_alimentos CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS TOTAIS Bolores e leveduras são grupos distintos de microrganismos que desempenham um papel significativo em diversos aspectos da microbiologia e da indústria alimentar. São fungos unicelulares ou multicelulares que pertencem ao reino dos fungos, compartilhando semelhanças estruturais, mas diferindo em muitos aspectos, como morfologia e função. Enquanto bolores são conhecidos por sua aparência filamentosa e são frequentemente associados a problemas de deterioração de alimentos, leveduras são microrganismos unicelulares que têm grande importância na produção de alimentos, como pães e cerveja, bem como em pesquisas biotecnológicas. Ambos os grupos desempenham um papel fundamental na ecologia, produção industrial e pesquisa científica, sendo objeto de estudo e aplicação em diversas áreas da microbiologia. 1.Preparo e Pesagem da Amostra Pese 25 gramas (g) ou mililitros (mL) da amostra e adicione 225 mL de água peptonada 0,1%. 2. Homogeneização da Amostra Homogeneíze a mistura por aproximadamente 60 segundos utilizando um agitador, como o "Bag Mixer". 3.Diluição das Amostras Retire uma alíquota de 1 mL da amostra e transfira para um tubo de ensaio contendo 9 mL de água peptonada 0,1% (diluição 10-2). A partir deste ponto, realize diluições seriadas em tubos contendo 9 mL de água peptonada 0,1% até alcançar a diluição desejada. 4.Inoculação das Placas Inocule, com o auxílio de uma pipeta automática, 0,1 mL de cada diluição selecionada em placas de Petri contendo DG18. Espalhe o inóculo utilizando uma alça de Drigalski, movendo das placas de maior para as de menor diluição, assegurando que todo o líquido seja absorvido. 43 @tecno_alimentos BOLORES E LEVEDURAS15 V: Volume inoculado em cada placa d: Primeira diluição contada Σc: Soma das colônias nas placas contadas 5.Incubação Deixe as placas secarem e, em seguida, incubá-las a 25º C por 5 dias, sem inverter as placas e mantendo-as no escuro. É recomendável não movimentar as placas antes da contagem para evitar o crescimento secundário causado pelo deslocamento dos esporos, o que invalidaria a contagem final. 6.Leitura das Placas Realize a leitura, selecionando as placas que contenham entre 10 e 150 colônias com o auxílio de um contador de colônias. Conte separadamente as colônias com aspecto filamentoso, cotonoso ou pulverulento, indicativas de bolores, e anote os resultados. Em uma mesma placa, conte as demais colônias, considerando aquelas que sejam leveduras ou uma mistura de leveduras e bactérias. 7.Interpretação e Cálculo dos Resultados A partir dos resultados obtidos, calcule o número de micro-organismos presentes na amostra em análise usando a seguinte fórmula: UFC/g = Σc/V x 1,1 x d Onde: Este cálculo fornecerá o número de Unidades Formadoras de Colônia (UFC) por grama (g) na amostra. 44 @tecno_alimentos CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS Certifique-se de que todos os materiais, como placas de Petri, tubos de ensaio, alças de Drigalski, pipetas, entre outros, estejam devidamente esterilizados. Prepare o meio de cultura Clostrídios Sulfito Redutores de acordo com as instruções do fabricante. Pese uma porção de 25g ou 25mL da amostra em questão. Em seguida, adicione essa porção em um saco de homogeneização apropriado e dilua-a em 225mL de solução salina peptonada tamponada a 0,1% (BPW). Certifique-se de seguir as instruções do fabricante quanto ao diluente apropriado. Utilize um homogeneizador ou outra técnica adequada para homogeneizar a mistura. O objetivo é garantir uma distribuição uniforme dos microrganismos na amostra. Para realizar uma diluição seriada, comece retirando 1mL da amostra homogeneizada e transfira-o para um tubo de ensaio que contenha 9mL de solução peptonada tamponada a 0,1% (diluição 10-2). A partir desta primeira diluição, realize mais diluições, adicionando 1mL da solução em um tubo de 9mL de solução peptonada tamponada a 0,1%, repetindo esse processo até atingir a diluição desejada. Bolores e leveduras são grupos distintos de microrganismos que desempenham um papel significativo em diversos aspectos da microbiologia e da indústria alimentar. São fungos unicelulares ou multicelulares que pertencem ao reino dos fungos, compartilhando semelhanças estruturais, mas diferindo em muitos aspectos, como morfologia e função. Enquanto bolores são conhecidos por sua aparência filamentosa e são frequentemente associados a problemas de deterioração de alimentos, leveduras são microrganismos unicelulares que têm grande importância na produção de alimentos, como pães e cerveja, bem como em pesquisas biotecnológicas. Ambos os grupos desempenham um papel fundamental na ecologia, produção industrial e pesquisa científica, sendo objeto de estudo e aplicação em diversas áreas da microbiologia. 1.Preparação dos Materiais e Meios de Cultura: 2. Preparo da Amostra: 3. Homogeneização da Amostra: 4. Inoculação: 45 @tecno_alimentos CLOSTRÍDIOS SULFITO REDUTORES - CLOSTRIDIUM PERFRINGENS16 Inocule 0,1mL de cada diluição selecionada em placas de Petri contendo o meio de cultura Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC). Certifique-se de que o inóculo seja bem espalhado na superfície do meio. Para isso, você pode utilizar uma alça de Drigalski, espalhando das placas de maior para as placas de menor diluição até que todo o excesso de líquido seja absorvido. Após a completa solidificação da sobrecamada nas placas, é necessário incubar as amostras em uma atmosfera anaeróbia, o que é essencial para o crescimento de Clostridium perfringens. Para criar essa atmosfera, você pode utilizar o processo de exaustão de ar e introdução de uma mistura gasosa composta por 90% de gás nitrogênio (N2) e 10% de gás carbônico (CO2). Existem diferentes métodos para alcançar isso: a) Incubadora Anaeróbia: Coloque as placas em uma incubadora anaeróbia, onde você pode controlar a concentração de oxigênio. Introduza a mistura de gases (90% de N2 e 10% de CO2) na incubadora. b) Jarro Tipo Baird & Taitlock: Se você não possui uma incubadora anaeróbia, pode usar um jarro tipo Baird & Taitlock. Coloque as placas no jarro e siga o mesmo processo de introdução da mistura gasosa. Certifique-se de realizar a exaustão (remoção do ar) e a introdução dos gases na atmosfera do jarro ou incubadora por três ou quatro vezes para garantir a completa remoção do oxigênio. A incubação deve ser feita a uma temperatura de 35-37°C por um período de 18-24 horas, sem a necessidade de inverter as placas durante esse tempo. 5. Procedimento para contagem de C. perfringens em alimentos pelo método do plaqueamento direto 6. Incubação em Atmosfera Anaeróbia: 46 @tecno_alimentos CLOSTRÍDIOS SULFITO REDUTORES - CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Exemplo de Jarra Anaerobiose Selecionar as placas contendo entre 20 e 200 colônias e proceder à contagem das colônias típicas de C. perfringens. Essas colônias são identificadas por sua coloração preta, e no caso do meio TSC com gema de ovo, elas podem ou não apresentar um halo de precipitação devido à reação com a lecitinase presente na gema de ovo. Selecionar um total de cinco colônias típicas (em análises oficiais, selecionar 10 colônias) e transferi-las para um meio de Tioglicolato (TGM). Incubar a uma temperatura de 46°C por 4 horas (em banho) ou a 35-37°C por 18-20 horas. Inocular a cultura obtida nos meios apropriados, a fim de realizar as provas bioquímicas de confirmação. Proceder para provas bioquímicas. 8. Interpretação e Cálculo dos Resultados 9. Confirmação: Provas bioquímicas TESTE DE NITRATO(+) MOTILIDADE(-) 47 @tecno_alimentos CLOSTRÍDIOS SULFITO REDUTORES - CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Ágar Nitrato Motilidade 35-37 °C/24h Meio Lactose Gelatina TESTE DE FERM. LACTOSE(+) HIDROL. GELATINA(+) 35-37 °C/24h-44h Se necessário Meio de Fermentação para C. perfringens com rafinose Meio de Fermentação para C. perfringens com salicina35-37 °C/24h RAFINOSE Geralmente(+) 35-37 °C /24h SALICINA(-) Esquema de análise para contagem de C. perfringens em alimentos por plaqueamento direto (Labbe, 2001). Apud Silva, Neusely et al. 2017. pH (acidez ou alcalinidade): O pH do alimento pode inibir ou promover o crescimento microbiano. Alimentos ácidos, com baixo pH, como sucos cítricos, tendem a inibir o crescimento de muitos microrganismos. Por outro lado, alimentos alcalinos podem favorecer o crescimento de bactérias patogênicas. Atividade da água (Aw): A atividade da água se refere à disponibilidade de água no alimento. Microrganismos necessitam de água para crescer e se multiplicar. Alimentos com baixa atividade da água, como alimentos secos, tendem a ser menos propensos ao crescimento microbiano. Composição química: A presença de compostos antimicrobianos naturais, como alguns óleos essenciais, pode inibir o crescimento de microrganismos. Além disso, alguns alimentos contêm conservantes, como o ácido sórbico, que são adicionados para controlar o crescimento microbiano. Potencial redox (potencial de oxirredução): O potencial redox está relacionado à presença de substâncias oxidantes ou redutoras no alimento. Alguns microrganismos são sensíveis ao potencial redox do ambiente. Alimentos com alto potencial redox podem inibir o crescimento de microrganismos. Nutrientes disponíveis: A disponibilidade de nutrientes essenciais, como açúcares, proteínas e lipídios, influencia o crescimento microbiano. Alimentos com nutrientes limitados podem não sustentar um crescimento significativo de microrganismos. Textura e estrutura: A textura e a estrutura dos alimentos podem afetar a capacidade dos microrganismos de se fixar e multiplicar. Superfícies rugosas podem fornecer nichos protegidos para o crescimento bacteriano. Microbiota presente nos alimentos: A competição interna entre os microrganismos da microbiota também pode desempenhar um papel na preservação de certos alimentos, uma vez que ela inibe o crescimento de determinadas espécies ou grupos de microrganismos Os fatores intrínsecos que controlam o crescimento microbiano em alimentos são características inerentes aos próprios alimentos que afetam a capacidade dos microrganismos de se multiplicar. Esses fatores incluem: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. FATORES INTRÍNSECOS QUE CONTROLAM O CRESCIMENTO MICROBIANO EM ALIMENTOS 48 @tecno_alimentos 17 Temperatura: A temperatura é um dos fatores extrínsecos mais críticos. Ela pode acelerar ou retardar o crescimento microbiano. Temperaturas abaixo de 5°C inibem o crescimento de muitos microrganismos, enquanto temperaturas acima de 60°C podem matar a maioria deles. Umidade relativa: A umidade no ambiente de armazenamento dos alimentos pode influenciar o crescimento microbiano. Alimentos armazenados em locais com alta umidade podem ficar mais suscetíveis à proliferação de mofo e leveduras. Atmosfera: A composição do ar ao redor dos alimentos pode afetar o crescimento microbiano. Por exemplo, embalar alimentos em atmosfera modificada, com níveis controlados de oxigênio e dióxido de carbono, pode retardar o crescimento microbiano e aumentar a vida útil dos produtos. Pressão: Alimentos que são armazenados sob pressão, como conservas enlatadas, podem ter microrganismos inativados devido à pressão elevada. Luz: A exposição à luz, especialmente à luz ultravioleta (UV), pode ter propriedades bactericidas e antifúngicas. Portanto, alimentos sensíveis à luz, como laticínios, são frequentemente armazenados em embalagens opacas. Tempo de armazenamento: Quanto mais tempo os alimentos são armazenados, maiores as chances de que microrganismos possam proliferar. Alimentos perecíveis devem ser consumidos dentro de um prazo limitado. Manuseio e higiene: A contaminação cruzada e a higiene inadequada durante o manuseio dos alimentos podem introduzir microrganismos indesejados. Transporte: Condições inadequadas durante o transporte dos alimentos, como temperaturas impróprias, podem acelerar o crescimento de microrganismos indesejados. Embalagem: A qualidade da embalagem é crucial para evitar a contaminação e proteger os alimentos contra influências externas, como umidade e oxigênio. Fatores extrínsecos que afetam o crescimento microbiano em alimentos são condições ambientais que podem influenciar o desenvolvimento de microrganismos nos alimentos após a produção e durante o armazenamento. Esses fatores incluem: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. FATORES EXTRÍNSECOS QUE CONTROLAM O CRESCIMENTO MICROBIANO EM ALIMENTOS 50 @tecno_alimentos 18 Lúcia Lemos @tecno_alimentos Compreender a microbiologia alimentar é crucial para todos profissionais da área de alimentos, porque afeta a qualidade dos alimentos que produzimos. Clique aqui e assista o vídeo que preparei para você! 51 CLICA AQUI Esse material foi elaborado com base no manual de análise: Silva, Neusely et al. Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos e Água. 5 Ed. - São Paulo : Bluncher, 2017. Os métodos podem variar de acordo com o laboratório de análise. https://youtu.be/cohjk3BEdN4?si=p4cbfztb6G4ITfa6
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