Bioinseticidas: Controle Biológico de Pragas

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UNIVERSIDADE DE SOROCABA
ENGENHARIA QUÍMICA
BIOTECNOLOGIA
Profª Bertha D. A. B. de Castro
BIOINSETICIDAS
	NOME
	Bruna Antonioli Mendes
	Paula Vendramello Pontarolli
Sorocaba, 26 de maio de 2021
	2
Sumário
1.	Introdução	3
2.	O que são os bioinseticidas?	3
3.	Composição e como funcionam	4
4.	Microencapsulação	5
5.	Produção comercial	7
6.	Etapas de desenvolvimento na produção de bioinseticidas	8
7.	Vantagens e Desvantagens	9
8	Artigo	10
8.1	Introdução	10
8.2	Diversidade de toxinas produzidas por B. Thuringiensis	10
8.3	Classificação dos Genes que codificam as δ–endotoxinas	10
8.4	Estrutura das proteínas Cry de B. Thuringiensis	10
8.5	Mecanismo de ação das proteínas Cry	11
8.6	Controle Biológico utilizando B. Thuringiensis	12
9.	Referências bibliográficas	14
1. Introdução
Os insetos compõem o maior grupo do Reino Animal e são extremamente importantes para o equilíbrio ecológico da natureza, muitos são até explorados comercialmente pelos humanos devido à geração de vários produtos, como por exemplo o mel. Apesar de tal positividade, alguns insetos são considerados “vilões” por causarem danos à agricultura e por propagarem diversas doenças. Com isso é vasto o número de pesquisas a fim de produzir inseticidas bastante eficientes, menos danosos ao meio ambiente e a saúde humana, e que tenham um baixo custo de produção. A fonte que mais apresenta essas vantagens é a microbiana, na qual se destaca a bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) devido às inúmeras pesquisas e produtos já realizados com sucesso. Outro fator que atende a tais necessidades é a técnica de microencapsulação, que visa melhorar pontos como o efeito, proteção e manipulação dos inseticidas. 
2. O que são os bioinseticidas?
Devido aos problemas causados por alguns insetos como a proliferação de doenças tal como a dengue, malária, doença de Chagas e leishmaniose, e os inúmeros danos a plantações, como por exemplo a interferência no crescimento das plantas, desvalorização de frutos, morte ou até mesmo a aniquilação total de colheitas, é incessante a busca por produtos que atuem no controle ou erradicação total desses insetos. Todo composto capaz de atingir o ovo, a larva ou o inseto já adulto é denominado inseticida, esses são frequentemente utilizados por várias esferas, desde indústrias a uso doméstico. A penetração dos inseticidas no corpo do inseto consiste em como ou por onde ele atinge o inseto, assim eles podem ser classificados em: inseticidas de ingestão quando penetram no organismo alvo via oral e são absorvidos pelo intestino; inseticidas de contato são os que entram em contato com o tegumento; os inseticidas de fumigação invadem o organismo através das vias respiratórias; ao agir através da ação translaminar o modo de ação do inseticida é definido como de profundidade; há ainda aqueles que translocam pelo sistema vascular das plantas até atingirem o inseto, os inseticidas sistêmicos
Entende-se por bioinseticidas ou produtos biológicos, microrganismos que controlam os insetos-pragas de uma cultura. A ocorrência desses microrganismos pode ser aumentada artificialmente através de pulverizações no campo. Os patógenos mais utilizados como bioinseticidas na agricultura são bactérias, vírus, fungos, protozoários e nematóides. Os bioinseticidas mais usados para o controle de pragas são: Bacillus thuringiensis, que é uma bactéria usada principalmente para o controle de lepidópteros (esses insetos fazem parte da Ordem Lepidoptera, que contempla as borboletas e mariposas), dípteros (estão incluídas as moscas, mosquitos, varejeiras, pernilongos, borrachudos e mutucas) e coleópteros (besouros e joaninhas) , dependendo da subespécie usada. Os vírus do gênero Baculovirus, que inclui os Vírus da Poliedrose Nuclear (VPN) e os Vírus de Granulose (VG), são mais usados para o controle de pragas-Iepidópteros. Os fungos são difundidos em áreas mais úmidas, sendo usados Nomuraea rileyi, Metahrizium anisopliae e Beauveria bassiana. Também fazem parte dos bioinseticidas os protozoários do gênero Vairimorpha e nematóides do gênero Hexamermis. Comparado com o inseticida químico convencional, ele não apresenta perigo por ser biodegradável, enquanto os outros são tóxicos e permanecem no ambiente durante muito tempo.
Além disso, por ser produzido por bactérias encontradas no meio ambiente, o bioinseticida se caracteriza por apresentar em sua composição um material mais natural que não agride o ambiente e possui uma ação específica em relação a um determinado gênero.
3. Composição e como funcionam
Um dos principais microrganismos utilizados como agente bioinseticida é a bactéria do solo Bacillus thuringiensis (Bt). Essas bactérias são bioinseticidas seguros, biodegradáveis e de alto potencial, com elevada taxa de letalidade contra os insetos agrícolas. Seu potencial entomopatogênico se deve a capacidade de sintetizar vários cristais proteicos durante a esporulação conhecidos como delta-endotoxinas. As delta-endotoxinas de B. thuringiensis são produzidas em diversas morfologias cristalinas como bipiramidais, cuboidais, esféricos e romboidais, onde cada tipo de cristal possui atividade inseticida apenas para uma ordem de inseto, e isso faz com que bioinseticidas formulados a base de Bt sejam ecologicamente seguros por não atingirem populações de insetos benéficos, outros invertebrados e vertebrados. Após a ingestão, estas toxinas são ativadas pela ação das enzimas digestivas que atuam em pH alcalino, ligam-se a receptores específicos nas células epiteliais do intestino médio e induzem poros na membrana que conduzem, habitualmente, a septicemia e morte de insetos.
4. Microencapsulação
Entretanto, a maioria dos entomopatógenos (diversos tipos de organismos que causam doenças e morte nos insetos, como vírus, bactérias e fungos. Potencialmente, podem ser usados como agentes de controle biológico.) possuem algumas limitações quanto a sua utilização no campo, pois são suscetíveis à rápida degradação ambiental devido à radiação UV, calor, dessecação, pH do substrato e competição microbiana. Para garantir a eficácia, manipulação proveitosa, melhores condições de armazenamento, segurança e fácil aplicação os inseticidas precisam sofrer alteração de sua forma bruta para a utilizável, esse processo é denominado formulação. 
A formulação é composta pelo ingrediente ativo (substância que realmente controla a praga) e ingredientes inertes como surfactantes, um veículo e outros ingredientes como os corantes. Os ingredientes inertes são aditivos que visam a melhoria da manipulação do produto, aumenta sua toxicidade, proteção contra fatores ambientais, etc. Os tipos de formulações mais utilizadas são: pó seco, solúvel ou molhável; soluções concentradas; emulsões e concentrados emulsionável; suspensões concentradas; aerossol; gases; granulados; pasta; adesivos e microencapsulado. 
A microencapsulação é uma técnica em que micropartículas são envolvidas por uma camada a fim de protegê-las ou melhorar seu desempenho. Esse método visa proteger o material encapsulado de vários fatores como pH, temperatura e reações químicas indesejadas com outros materiais e também melhora a estabilidade e a viabilidade do produto. Micropartículas são partículas esféricas sólidas, liquidas ou gasosas que possuem de 1 a 1000µm. Em relação a sua estrutura as micropartículas podem ser classificadas em um tipo matricial em que a substância pode estar na superfície ou no interior denominado microesferas, e em microcápsulas onde a substância encontra-se no núcleo e envolvida por uma camada construída durante o processo de microencapsulação.
Os compostos utilizados no envolvimento das micropartículas são definidos agentes encapsulantes. Eles podem ser obtidos de fontes naturais, sintéticas ou semissintéticas. Cera, sacarose e gelatina são alguns dos tipos naturais. Os sintéticos envolvem polímeros e os semissintéticos acetato de celulose, nitrato de celulose e outros. O sucesso dos compostos bioativos encapsulados depende do tipo de substância que será utilizadana sua microencapsulação, o que é definido por suas características químicas e físicas, seu método de microencapsulamento e seu tipo de aplicação. 
A viscosidade, a capacidade de absorver água, capacidade de proteção, fácil manuseio durante o processo, boas condições de liberação da micropartícula e baixo custo são alguns pontos que devem ser estudados durante a escolha da substância que será utilizada na encapsulação. A maneira como ocorre a liberação do bioativo presente no núcleo da microcápsula é ponto crucial no sucesso da ação da micropartícula em seu uso final. Geralmente a escolha da técnica da encapsulação foca o controle da excreção da substância envolvida tendo a finalidade de definir o modo de como ela será liberada, os locais onde o bioativo precisa ser preservado ou liberado para começar agir, o tempo em que ele levará para começar a ser liberado e a duração da mesma. 
A eliminação do núcleo pode ocorrer de maneira mecânica quando algo entra em atrito com o microencapsulado e rompe o revestimento da partícula, por dissolução do encapsulado em solvente de interesse, dependendo da temperatura que muda o estado da matéria ou por meio de alterações químicas. O material utilizado na envoltura da micropartícula e o modo de liberação definido para tal irão definir a velocidade e a quantidade do produto liberado, o que também depende de qual será o uso da substância. As metodologias de microencapsulação irão depender das propriedades do bioativo, principalmente as química e física, devido as interações da micropartícula com o material escolhido para o envelopamento e o seu tamanho. 
O número de técnicas já reconhecidas por patente é numeroso e vem crescendo cada vez mais, todos os métodos existentes podem ser em três grandes grupos: químico, físico e físico-químico. Alguns dos métodos físicos são: a liofilização, processo onde um material líquido congelado é desidratado por sublimação; o spray chilling, método de congelamento por atomização; e o leito fluidizado, técnica na qual um sólido com menos que 100µm é transformado liquido por algum gás ou líquido quente e seco. Entre os métodos químicos podem ser encontrados a polimerização interfacial, nessa técnica se usa uma emulsão água/óleo para polimerizar os monômeros líquidos ou sólidos de 1-500µm; e a inclusão molecular em que normalmente líquidos são encapsulados por β-ciclodextrina .Entre os métodos físico-químicos mais utilizados estão: a coacervação, onde micropartículas menores que 500 µm são separadas devido a formação de três fases imisturáveis seguida da deposição e endurecimento do material encapsulante sobre a micropartícula, quando se utiliza só um polímero a coacervação é denominada simples, caso sejam utilizados mais de um passa a ser chamada de coacervação complexa e a emulsificação variando a utilização de água e óleo seguida de evaporização do solvente utilizado; além delas existem outras técnicas como a pulverização em agente formador de reticulação e envolvimento lipossômico. 
A aplicação da microencapsulação abrange diversas áreas como o ramo farmacêutico, onde o método é utilizado para melhorar o sabor, liberação, odor e redução de irritações dos medicamentos. Paracetamol, Diclofenaco e Ácido acetilsalicílico são alguns medicamentos que obtiveram sucesso ao fazer uso da microencapsulação; na área alimentícia o uso da técnica beneficia a proteção do produto a condições externas que possa diminuir suas qualidades como o gosto e aroma, como também aumenta o tempo de armazenamento. 
No ramo alimentício muito usada em óleo de peixe, corantes, acidulantes e em enzimas como as de Lactobacillus sp. Além disso, a microencapsulação é utilizada em cosméticos e produtos agrícolas. O uso da técnica de microencapsulação em pesticidas alveja alcançar a proteção do produto contra fatores ambientais externo como a chuva e o sol, influenciam a biodisponibilidade e na seletividade da espécie alvo. 
Uma das maiores vantagens da microencapsulação dos pesticidas é a segurança que repassa para quem trabalha aplicando os mesmos e ao meio ambiente devido ao fato de controlar o tempo de exposição. 
5. Produção comercial
A preocupação relacionada ao desenvolvimento comercial de substâncias para controle microbiano de insetos iniciou-se em torno de 1950, após notar a possibilidade de manipulação de microrganismos a fim de causar doenças em insetos e pragas de modo que não afetasse espécies benéficas. 
Empresas referência no ramo de bioinseticidas tem por objetivo incentivar o crescimento da utilização de bioinseticidas como alternativa para uma agricultura sustentável. Hoje os bioinseticidas são componentes efetivos e de valor nos sistemas de manejo integrado. No Brasil, a produção comercial de bioinseticidas está aumentando anualmente gerando emprego, renda e fomentando um segmento estratégico com o propósito de agregar valor aos produtos do agronegócio.
6. Etapas de desenvolvimento na produção de bioinseticidas
Inicia-se pela seleção do microrganismo: ao buscar encontrar uma linhagem que se destaque pela eficácia e/ou produtividade. Em seguida acontecem os ensaios de otimização, com o objetivo de obter um isolado microbiano com as características inseticidas almejadas por um grande número de gerações, garantindo que durante a produção comercial a linhagem não reverta a um isolado menos ativo. Depois dessa etapa são determinadas as condições ótimas de fermentação, também chamada de biossíntese, em um biorreator para assegurar que o isolado bacteriano atinja seu máximo potencial. No biorreator, ocorre o método mais utilizado no processo submerso, o processo de fermentação, onde o meio líquido é usado para propagar e suspender a biomassa.
 O equipamento utilizado necessita ser esterilizado por completo para evitar contaminação microbiana e permanecer com as condições assépticas ideais ao longo de todo o processo. Em escala de produção, o biorreator permitirá o crescimento do número de células por crescimento vegetativo do Bt. Os cristais e esporos não serão produzidos até o estágio final de fermentação, momento o qual ocorre a restrição dos recursos nutricionais e o crescimento aumenta até a fase de esporulação. 
Na fase de recuperação das toxinas do Bt, ocorre a a purificação e concentração do caldo de fermentação, onde a potência do produto pode ser reduzida devido a um processo de recuperação inadequado. Antes de tudo é necessário remover os grandes detritos, como células e meio de cultura, através da ultrafiltração, screening ou centrifugação. Em seguida, o produto é processado via centrifugação ou evaporação, de modo a aumentar a potência do caldo formado e gerar um concentrado aquoso.
 Já na fase de formulação de um produto líquido, são acrescentados estabilizantes, anti-evaporantes ou aditivos, como estimulantes de alimentação. Antes da produção comercial em larga escala, deve-se realizar testes laboratoriais para identificar uma linhagem bacteriana que esteja dentro do esperado, ou seja, estável, altamente tóxica aos insetos alvo e que não gere custos à produção por necessidades nutricionais exigentes em meio de cultivo.
Depois de finalmente selecionada, a linhagem é testada em relação à estocagem, processo fermentativo, recuperação do princípio ativo (esporos e cristais), formulação do produto e análise da qualidade através de uma pequena escala de produção, para somente depois ser produzida em grande escala. 
7. Vantagens e Desvantagens
Vantagens: uma das maiores vantagens são que os bioinseticidas oferecem alternativa aos inseticidas químicos sintéticos, uma vez que podem ser empregados com o mesmo propósito, sem que estes sejam prejudiciais ao meio ambiente, além disso, podem ser facilmente produzidos a partir de restos de colheita ou de várias espécies vegetais consideradas eficientes, por meio artesanal, semi-industrial e industrial. Os bioinseticidas também são facilmente biodegradados, devido a sua natureza orgânica, dessa forma contribuem para a diminuição da contaminação ambiental. Os bioinseticidas contribuem para a segurançaalimentar, pois melhoram a qualidade de vida de quem ingere o alimento e protege a saúde dos trabalhadores e consumidores. Devido aos compostos que constituem mais de um princípio ativo e pouca persistência, tem menos chances de promover resistência ou tolerância em pragas e patógenos. Além disso são compatíveis com o Manejo Integrado de Pragas - MIP e com o sistema de manejo orgânico, e talvez uma das qualidades mais importantes economicamente, é que os bioinseticidas são mais baratos que os agrotóxicos sintéticos.
Desvantagens: Infelizmente os inseticidas naturais, na maioria das vezes, são menos eficientes que os produtos químicos sintéticos, e além disso os resultados nem sempre são imediatos, o que pode atrapalhar a vida dos agricultores. Um dos principais problemas é que geralmente é necessário um maior número de aplicações, pois possui baixa persistência.
1. Artigo
Introdução
Diversidade de toxinas produzidas por B. thuringiensis
Classificação dos Genes que codificam as δ–endotoxinas
Em 1998, foi apresentada uma nova classificação, diferente da anterior, a qual baseava-se somente nas relações entre as sequências de aminoácidos. Nessa nova proposta, a classificação é feita através do nome da toxina (Cry ou Cyt) e em seguida do número (antes eram utilizados números romanos, mas foram trocados por número arábicos para poder comportar melhor o grande número de proteínas novas), letra maiúscula, letra minúscula e número (ex: Cry2Aa4) dependendo da sua localização na árvore filogenética. Até a data em que o artigo foi escrito (2010), foram descritos mais de 400 genes cry e agrupados em 67 grupos de proteínas Cry (Cry1 a Cry67).
Estrutura das proteínas Cry de B. Thuringiensis
Grande parte das δ–endotoxinas se apresentam como uma pró-toxina, ou seja, sua toxina é utilizada em benefício ao ser humano. Apresentam massa molecular em torno de 130–140 kDa, as quais para serem ativadas precisam ser processadas por proteases do intestino médio dos insetos, que liberam um fragmento entre 55–65 KDa). A pró–toxina é dividida em duas regiões distintas: uma porção amino–terminal, normalmente variável e que está associada à toxicidade, e uma porção carboxi–terminal, mais conservada entre as proteínas, relacionada geralmente à formação do cristal. Alguns experimentos realizados com genes truncados na região 5’ou 3’ mostraram que a região do DNA útil para a síntese da proteína tóxica se encontra a partir do códon 29 ao 607 ou 615. A proteína truncada conserva a especificidade tóxica da δ–endotoxina nativa. 
O domínio carboxi–terminal dessas proteínas é relacionado com a estrutura, formação e solubilização do cristal. Essa é uma hipótese que pode ser mantida devido à presença dos resíduos de cisteína encontrados na porção C–terminal, responsáveis pelas pontes dissulfeto que mantêm as proteínas juntas e estáveis na inclusão cristalina.
Após algumas análises, concluiu-se que algumas regiões são altamente conservadas entre as proteínas Cry e, em seguida ao alinhamento das sequências de aminoácidos, revelou-se a presença de cinco blocos conservados na região onde a toxina é codificada. Foram descritos então outros três blocos localizados na região da pró–toxina. 
Esses resultados são cruciais, pois servem para comprovar a função biológica dessas proteínas além de sugerirem que as proteínas Cry formam famílias com blocos similares e, portanto, mecanismos de ação semelhantes.
Mecanismo de ação das proteínas Cry
Essas proteínas agem através de uma sequência de etapas (solubilização e processamento da toxina, ligação ao receptor, inserção na membrana e citólise) que começa a partir do momento que o cristal e o esporo são ingeridos pela larva suscetível. A solubilização da pró–toxina acontece em pH alcalino, no intestino médio da maioria das larvas de insetos aptos (Lepidoptera, Diptera e alguns insetos Coleoptera). Ao ocorrer diferenças na solubilização há contribuição para determinar as alterações no grau de toxicidade entre as proteínas Cry. 
Após a solubilização, várias pró–toxinas são processadas via proteases que estão presentes no intestino médio do inseto, liberando assim o fragmento tóxico. A clivagem proteolítica é um fator muito importante, o qual pode contribuir para determinar a especificidade; a principal protease digestiva de Lepidoptera e Diptera é a serino–protease, enquanto para Coleoptera são principalmente a cisteíno e aspártico–proteases.
 Após a ativação, as proteínas Cry se ligam aos receptores específicos presentes nas microvilosidades das células colunares do intestino médio das larvas de insetos suscetíveis, contribuição importante para a toxicidade e especificidade das δ–endotoxinas. As caderinas e as aminopeptidase N (APN) interagem consecutivamente com diferentes partes da toxina. Primeiramente, a toxina ativa se liga à caderina iniciando a primeira modificação conformacional que deixa exposta a região da α–hélice para ser clivada pelas proteases da membrana. 
Após a clivagem, acontece a formação de um complexo pré–poro (na forma de um tetrâmero). Este polímero se liga a APN, a qual está ancorada na membrana pela sua ligação com o glicosilfosfatidilinositol (GPI), e em sequência, ocorre a inserção da toxina ativa na membrana de forma permanente, induzindo a abertura ou formação dos poros que causam uma quebra no balanço osmótico da célula, resultando na quebra celular. 
A intoxicação nos insetos da ordem Lepidoptera ocorre através de uma paralisação imediata do tubo digestivo e peças bucais dos insetos, levando à quebra celular e impedindo assim a alimentação. As células colunares e caliciformes são então destruídas e facilitam a entrada dos esporos que germinam, conduzindo à lise do intestino médio, inanição e posterior septicemia, levando o inseto à morte.
Controle Biológico utilizando B. thuringiensis
Devido a capacidade de transferência dos genes em B. thuringiensis, acaba sendo possível o uso de proteínas recombinantes com melhores características, possibilitando assim melhorar a atividade, o rendimento e a estabilidade, utilizando vários genes de toxinas dessa bactéria, gerando novos produtos ativos.
As modificações genéticas obtidas em cepas de B. thuringiensis são: cura plasmidial, conjugação, transformação, recombinação e construções de proteínas híbridas. A inserção de genes cry em plantas com interesse econômico apresenta uma ótima estratégia para o controle de insetos–praga, uma vez que as vantagens são muito maiores que as desvantagens. 
O uso de baculovírus (vírus patogênicos a insetos), como vetor, possibilita o estudo de proteínas Cry isoladamente, ou em associação com outras proteínas, contribuindo para o desenvolvimento de bioinseticidas mais potentes e com menos possibilidade de resistência nos insetos–alvo. A manipulação de genes cry apresenta uma alternativa para melhorar a sua eficácia e a persistência da proteína no meio ambiente, removendo certas características insatisfatórias dos cristais, como por exemplo rápida degradação quando expostos a radiação ultravioleta, instabilidade na água e a incapacidade no controle de insetos que se alimentam do tecido interno da planta.
9. Referências bibliográficas 
1. BOAS PRÁTICAS AGRONÔMICAS. Nematoides: conheça os prejuízos que esses vermes causam e descubra como controlá-los. Disponível em: https://boaspraticasagronomicas.com.br/artigos/nematoides/. Acesso em: 17 mai. 2021.
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3. CONHEÇA tecnologias de controle biológico de pragas apresentadas no Show Rural. [S. l.], 2 fev. 2015. Disponível em: http://www.redifertilizantes.com.br/conheca-tecnologias-de-controle-biologico-de-pragas-apresentadas-show-rural/. Acesso em: 20 maio 2021.
4. CONHECIMENTO CIENTÍFICO. Lepidópteros – O que são, características, acidentes e curiosidades. Disponível em: https://conhecimentocientifico.r7.com/lepidopteros/#:~:text=Os%20lepid%C3%B3pteros%20s%C3%A3o%20insetos%20holomet%C3%A1bolos,contempla%20as%20borboletas%20e%20mariposas..Acesso em: 17 mai. 2021.
5. DEDETIZAÇÃO. Bioinseticida. Disponível em: http://www.dedetizacao-consulte.com.br/dedetizacao-informativo.asp?cod=78#:~:text=O%20bioinseticida%20utiliza%20como%20princ%C3%ADpio,no%20ambiente%20durante%20muito%20tempo.. Acesso em: 17 mai. 2021.
6. EMBRAPA. Bioinsetigação. Disponível em: https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/474966/1/Bioinsetigacao.pdf. Acesso em: 17 mai. 2021.
7. EMBRAPA. Ordem diptera. Disponível em: https://www.embrapa.br/cerrados/colecao-entomologica/diptera. Acesso em: 17 mai. 2021.
8. FAUNA DIGITAL RIO GRANDE DO SUL. Diversidade de Coleópteros. Disponível em: https://www.ufrgs.br/faunadigitalrs/principais-familias/. Acesso em: 17 mai. 2021.
9. FÓRUM LAVOURA10. O que são entomopatógenos?. Disponível em: https://forum.aegro.com.br/question/943175654998806528/o-que-s%C3%A3o-entomopat%C3%B3genos. Acesso em: 17 mai. 2021.
10. HOEVELER, MÔNICA. PRODUÇÃO DE BIOINSETICIDA À BASE DE Bacillus thuringiensis israelensis CONTRA O Aedes aegypti. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL, [S. l.], p. 1-35, 22 dez. 2016. Disponível em: https://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/158093/001020753.pdf?sequence=1. Acesso em: 20 maio 2021.
11. INSETICIDAS naturais: quais são e como usá-los?. [S. l.], 2015. Disponível em: https://www.myfarm.com.br/inseticidas-naturais/. Acesso em: 20 maio 2021.
12. LIMA, Gláucia Manoella de Souza. PROTEÍNAS BIOINSETICIDAS PRODUZIDAS POR Bacillus thuringiensis. Anais da Academia Pernambucana de Ciência Agronômica, Recife, v. 7, p. 119-137, 2010.
13. PEREIRA, ERLON LOPES; MARTINS, BRUNA AMARAL. PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS NA PRODUÇÃO DE BIOINSETICIDAS. Revista da Universidade Vale do Rio Verde, Três Corações - MG, v. 14, n. 2, p. 714-734, 24 ago. 2016.
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