Bactéria Ácido Lático como Controle Biológico de Staphylococcus aureus em Queijo de Cabra de Coalho

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12/01/2021 Bactéria Ácido Lático como Controle Biológico de Staphylococcus aureus em Queijo de Cabra de Coalho
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Food Technology and Biotechnology, Vol. 56 No. 3, 2018.
Izvorni znanstveni članak 
https://doi.org/10.17113/ftb.56.03.18.5736
Bactéria Ácido Lático como Controle Biológico de Staphylococcus aureus em Queijo de Cabra de
Coalho
Rânmilla Cristhina Santos Castro ; Universidade Federal do Vale de São Francisco, Rod. BR 407, Km
12, Lote 543, Projeto de Irrigação Senador Nilo Coelho, s / nº, C1, BR-56.300-990 Petrolina, Pernambuco,
Brasil 
Anay Priscilla David de Oliveira ; Universidade Federal do Vale de São Francisco, Rod. BR 407, Km 12,
Lote 543, Projeto de Irrigação Senador Nilo Coelho, s / nº, C1, BR-56.300-990 Petrolina, Pernambuco,
Brasil 
Eline Almeida Rodrigues de Souza ; Universidade Federal do Vale de São Francisco, Rod. BR 407, Km
12, Lote 543, Projeto de Irrigação Senador Nilo Coelho, s / nº, C1, BR-56.300-990 Petrolina, Pernambuco,
Brasil 
Tayla Marielle Antunes Correia ; Universidade Federal do Vale de São Francisco, Rod. BR 407, Km 12,
Lote 543, Projeto de Irrigação Senador Nilo Coelho, s / nº, C1, BR-56.300-990 Petrolina, Pernambuco,
Brasil Jane Viana de Souza orcid.org/0000-0001-6918-5179 ; Universidade Federal do Vale de São
Francisco, Rod. BR 407, Km 12, Lote 543, Projeto de Irrigação Senador Nilo Coelho, s / nº, C1, BR-
56.300-990 Petrolina, Pernambuco, Brasil Francesca Silva Dias orcid.org/0000-0003-0174-4397 ;
Universidade Federal do Vale de São Francisco, Rod. BR 407, Km 12, Lote 543, Projeto de Irrigação
Senador Nilo Coelho, s / nº, C1, BR-56.300-990 Petrolina, Pernambuco, Brasil 
 
 
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 O objetivo deste estudo é investigar a população bacteriana em queijo de cabra de coalho produzido na
região semi-árida do nordeste do Brasil, analisar os perfis de resistência a antibióticos das bactérias
patogênicas identificadas, detectar os genes da enterotoxina estafilocócica e avaliar a adição de bactéria
autóctone do ácido lático (BAL) com propriedades tecnofuncionais para o controle do crescimento de
Staphylococcus aureus. Nas amostras analisadas, as cepas de Escherichia coli (N = 11), Salmonella spp.
(N = 18), Listeria spp. (N = 6) e S. aureus (N = 9) foram classificados como multirresistentes (MDR). O
patógeno mais comumente isolado do queijo de cabra de coalho estudado foi S. aureus. Seus isolados
foram positivos para os genes que codificam as enterotoxinas A (mar), B (seb), C (sec) e D (sed). O LAB
autóctone com potencial para inibir S. aureus foram identificados como Enterococcus faecium. Essas
cepas foram selecionadas para testes in vitro de proteção, segurança, propriedades tecnológicas e
funcionais. Na matriz alimentar do queijo de cabra de coalho, esses LAB autóctones selecionados foram
capazes de reduzir a carga de S. aureus MDR enterotoxigênica em aprox. 3 unidades de log.
Queijo de 
cabra de coalho Ključne riječi ; patógenos ; resistência a múltiplas drogas ; enterotoxinas estafilocócicas ;
segurança microbiológica ; propriedades tecnofuncionais de Enterococcus faecium
ID de Hrčak : 207647
URI 
https://hrcak.srce.hr/207647
▼ Artigo Informação
INTRODUÇÃO
O Brasil é o maior produtor de leite de cabra da América do Sul, e 93% da população caprina concentra-se
na região Nordeste. A caprinocultura é uma atividade promissora devido às mudanças na cadeia de
abastecimento alimentar e à diversificação do mercado. Dentre os produtos de destaque do leite de cabra,
o queijo de coalho é um produto tradicional do Nordeste do Brasil, geralmente produzido a partir de leite
cru e muito valorizado pelos consumidores ( 1 , 2 ). O queijo artesanal é considerado parte do contexto
cultural e da identidade de uma região ( 3 ).
Embora o queijo de cabra artesanal seja um dos principais produtos usados para gerar renda para os
pequenos proprietários, ainda é principalmente feito à mão, muitas vezes sem instalações adequadas.
Assim, não há padronização do processo, sendo comum o uso de leite cru, colocando em risco a saúde
do consumidor ( 2 ). A ausência de padrões de controle de qualidade para o leite e derivados de cabra no
Brasil é um grande entrave ao agronegócio especializado em leite de cabra. O acesso ao mercado para
esses produtos depende fortemente da aplicação de tecnologia adequada para obtenção dos padrões de
qualidade exigidos pela legislação ( 4 ).
Em relação aos riscos microbiológicos do queijo de cabra, em geral, o queijo artesanal produzido a partir
do leite de cabra apresenta baixa qualidade microbiana ( 5 ). O Staphylococcus aureus é um dos mais
importantes patógenos de origem alimentar em queijos, devido ao contato manual dos manipuladores
durante a fabricação do produto ( 6 , 7 ). Ferramentas para aumentar a segurança microbiológica do
queijo de cabra artesanal incluiriam a adição de culturas iniciadoras antibacterianas específicas, como
bactérias lácticas selecionadas (BAL) com anti- estafilococosatividade. A incorporação dessas culturas
nos procedimentos tecnológicos de preparo do produto é fundamental, não só para aumentar a segurança
 
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http://orcid.org/0000-0003-0174-4397
mailto:francesca.nobre@univasf.edu.br
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microbiológica pela inibição de patógenos, mas também para melhorar as propriedades tecnológicas,
funcionais e valorização do sabor do queijo, atributos importantes para derivados lácteos de origem
caprina ( 8 )
Para o semi-árido nordestino do Brasil, é fundamental caracterizar a microbiologia do queijo de cabra
artesanal para aumentar a qualidade microbiológica e tecnológica do produto. Isso se deve à possibilidade
de exigência do registro da indicação geográfica (IG) pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA, Brasil), que é regulamentada pela Instrução Normativa (IN) nº. 30 de 7 de agosto
de 2013 ( 9) Esta IN permite que o queijo artesanal tradicionalmente produzido com leite cru possa ser
maturado por menos de sessenta dias quando estudos técnico-científicos comprovarem que a redução do
período de maturação não afeta a segurança do produto. Além disso, os pequenos produtores poderão
atender ao programa de aquisição de alimentos (Programa de Aquisição de Alimentos, PAA, Brasil),
programa em que o governo brasileiro adquire produtos alimentícios da caprinocultura para abastecer
creches, hospitais e outras instituições com ajuda do governo. Assim, o presente estudo tem como
objetivo investigar microrganismos bacterianos em queijo de cabra de coalho produzido no semi-árido
nordestino brasileiro por meio da análise do perfil de resistência dos patógenos, por meio da detecção de
genes de enterotoxinas em S. aureus multirresistente (MDR) .isolados e avaliando a adição de LAB
autóctone no controle do isolado de S. aureus de queijo de cabra.
MATERIAIS E MÉTODOS
Coleta de amostra
Um total de 40 amostras de queijo de cabra de coalho produzidos comercialmente em pequena escala
foram adquiridas de associações de produtores de caprinos em oito municípios da região semi-árida do
nordeste brasileiro no estado de Pernambuco e Bahia, incluindo: Petrolina, Santa Maria da Boa Vista,
Lagoa Grande, Cabrobó, Dormentes, Afrânio, Casa Nova e Sento Sé ( Fig. 1 ). Foram analisadas cinco
amostras de cada cidade, sendo as amostras transportadas para o laboratório em caixas isotérmicas
refrigeradas e analisadas imediatamente.
Fig. 1 Mapa dos municípios da Bahia e Pernambuco (região Nordeste, Brasil) onde foram coletadas as
amostras de queijo de cabra de coalho
Análise microbiológica e determinação de pH
Um total de 25 g de cada amostra de queijo de cabra foi retirado por meio de cortes radiais e colocado em
sacos plásticos estéreis contendo 225 mL de solução estéril de citrato de sódio 2% ( m / V ) (Synth,
Diadema, Brasil) e homogeneizado por 2 min em um Stomacher® (Mayo Homogenius HG 400; São Paulo,
Brasil). Diluições de dez vezes (10 
-1
 a 10 
-10
 ) de queijo homogeneizado foram preparadas em 0,1% de
água de peptona estéril (HiMedia, Bombaim, índia) e plaqueadas em meio específico de detecção de
bactérias aeróbias mesofilicas (MAB), bactérias de ácido láctico (LAB), coliformes termotolerantes e
Escherichia coli, Staphylococcus aureus , Salmonella spp. e Listeria monocytogenes .
O MAB e o LAB foram enumerados em ágar de contagem em placa (PCA, HiMedia) e ágar de Man,
Rogosa e Sharpe (MRS, HiMedia), respectivamente. As placas foram incubadas a 37 ° C por 48 h para
MAB e 72-96 h para LAB. A caracterização dos isolados de LAB incluiu coloração de Gram (Gram Staining
Kit, Laborclín, São Paulo, Brasil), morfologia, catalase (Anidrol, Diadema, Brasil), motilidade (HiMedia) e
atividades da citocromo oxidase (Probac, São Paulo, Brasil ) Um isolado foi armazenado de cada amostra
de queijo de cabra.
Para a enumeração dos coliformes termotolerantes e detecção de E. coli, foi utilizado o caldo Fluorocult®
(Merck, Darmstadt, Alemanha) ( 10 ). Os tubos foram incubados a 37 ° C por 24 h. Tubos positivos, após a
adição do reagente de Kovac (Probac), serviram para cálculo do número mais provável (NMP). Para
confirmação de E. coli , colônias Gram-negativas (Gram Staining Kit, Laborclin), oxidase-negativas
(Probac) e catalase-positivas (Anidrol) foram semeadas em PCA e incubadas a 37 ° C por 24 h para
realizar o indol ( caldo triptona, HiMedia), vermelho de metila e Voges-Proskauer (meio MR-VP, HiMedia) e
citrato (ágar citrato Simmons, HiMedia) (IMViC) testes bioquímicos.
As colônias de S. aureus foram isoladas, identificadas e confirmadas bioquimicamente de acordo com a
Instrução Normativa no. 62 ( 11 ). Alíquotas de 0,1 mL de cada amostra de queijo foram semeadas na
superfície do ágar Baird-Parker (HiMedia) em duplicata e incubadas a 37 ° C por 24–48 h. Para a
identificação, foram realizados os seguintes testes para colônias típicas selecionadas do meio: coloração
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de Gram, catalase, coagulase (Laborclin), oxidação e fermentação de glicose e manitol (Synth), bem como
detecção de DNAse e termonuclease (teste de DNase ágar com azul de toluidina, HiMedia).
Salmonella spp. foram detectados de acordo com o método de Pignato et al . ( 12 ). Caldo tetrationato
(HiMedia) suplementado com soluções de iodo e verde brilhante e ágar Rambach (Merck) foi usado para
enriquecimento seletivo (18 h a 37 ° C) e isolamento (24 h a 37 ° C), respectivamente. Para identificação
bioquímica ( 11 ), colônias típicas foram adicionadas em tubos contendo ágar triplo açúcar ferro (TSI)
(HiMedia) ou ágar ferro lisina (LIA; HiMedia) e incubadas a 37 ° C por 24 h. Salmonela presuntivaas cepas
foram verificadas quanto à coloração de Gram diferencial, atividade da catalase e oxidase, motilidade e
produção de sulfeto e indol (HiMedia). Além disso, foram realizados testes sorológicos com anti-soro
polivalente somático e flagelar (Probac) de acordo com as instruções do fabricante.
A detecção de L. monocytogenes foi detectada conforme descrito por Capita et al . ( 13 ). Caldo Fraser
(HiMedia) e ágar Palcam (HiMedia) foram usados para enriquecimento seletivo (24–48 h a 35 ° C) e
isolamento (24–48 h a 35 ° C), respectivamente. Suspeita de Listeria spp. as colônias foram semeadas em
placas de ágar triptona de soja (TSA) suplementado com 0,6% de extrato de levedura (TSA-YE; HiMedia)
e incubadas a 37 ° C por 24-48 h. Em seguida, testes bioquímicos apropriados foram conduzidos em
isolados Gram-positivos para verificar a produção de catalase, fermentação de carboidratos, hemólise em
ágar sangue de ovelha (HiMedia) e motilidade a 25 ° C.
Para análises quantitativas, placas com 30–300 colônias foram contadas. As contagens microbiológicas
foram expressas em logaritmos do número de unidades formadoras de colônias por grama (UFC / g). Em
análises qualitativas (detecção de Salmonella spp. E L. monocytogenes), os microrganismos foram
detectados como presentes ou ausentes.
Para a determinação do pH, o queijo (10 g) foi homogeneizado em 10 mL de água destilada segundo de
Almeida Júnior et al . ( 14 ). As análises foram realizadas em triplicata com pHmetro (PHS-3E-BI; Ion,
Araucária, Brasil).
Resistência antimicrobiana de patógenos
A resistência aos antibióticos dos patógenos isolados foi determinada pelo método de difusão em disco
em ágar Mueller-Hinton com Multidiscos Gram Negativo 12® e Multidiscos Gram Positivo 12® (Laborclin) (
Tabela 1 ). Após incubação a 37 ° C por 24 h, os diâmetros da zona de inibição foram medidos seguindo
as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute ( 15 ). Os perfis de multirresistência
foram calculados pelo índice de resistência múltipla a antibióticos (MAR). As cepas com índice igual ou
superior a 0,5 e resistentes a três ou mais antimicrobianos testados foram classificadas como tendo alto
índice MAR ( 16 ).
Tabela 1 Discos de agente antimicrobiano * usados para avaliar a resistência de patógenos e bactérias
ácido-láticas isoladas de queijo de cabra de coalho
Microrganismo Classe antimicrobiana Agente antimicrobiano
( m (agente
antimicrobiano) / µg) /
disco
Gram-negativo penicilinas ampicilina 10
fluoroquinolonas ciprofloxacino 5
inibidores da via do folato sulfazotrim 25
aminoglicosídeos gentamicina 10
amicacina 20
cefem cefalotina 30
ceftazidima 30
cefepime 30
cefoxitina 30
cefuroxima 30
associações de inibidores
de β-lactamase
amoxicilina + clavulanato 30
carbapenêmicos meropenem 10
Gram-positivo penicilinas penicilina 10
oxacilina 1
fluoroquinolonas ciprofloxacino 5
inibidores da via do folato sulfazotrim 25
aminoglicosídeos gentamicina 10
cefem cefepime 30
tetraciclinas tetraciclina 30
glicopeptídeos vancomicina 30
fenicóis cloranfenicol 30
lincosamidas clindamicina 2
macrolídeos eritromicina 15
ansamicinas rifampicina 5
* Multidiscos Gram Negativo 12® e Multidiscos Gram Positivo 12® (Laborclin)
Identificação molecular de patógenos e detecção de genes para enterotoxinas
estafilocócicas
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O DNA dos patógenos (dois de cada gênero) com maior índice MAR e daqueles resistentes a três ou mais
antimicrobianos testados foi extraído com o Mini Kit PureLink Genomic DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA,
EUA) seguindo as instruções do fabricante. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada de
acordo com o protocolo proposto por de Ávila et al . ( 17 ).
Para as cepas de S. aureus com o índice MAR mais alto, os genes que codificam para as enterotoxinas
estafilocócicas clássicas (SEs: sea, seb, sec, sed e see ) foram detectados conforme descrito por Schneid
Kroning et al . ( 18 ). Os controles positivos usados nas reações para os genes clássicos de enterotoxinas
foram doações da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil), cepas do Instituto Nacional
de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS, Rio de Janeiro, Brasil): S . aureus INCQS 00285 ( mar e sed
), S. aureus INCQS 00005 ( seb ), S. aureus INCQS 00080 (sec ) e S. aureus INCQS 00093 ( ver ).
Atividade antimicrobiana de LAB autóctone contra cepa de S. aureus de queijo de
cabra de coalho
O efeito inibitório de LAB autóctone contra S. aureus cepa QCSA24 (isolado enterotoxigênico e MDR com
maior índice MAR) de queijo de cabra de coalho foi testado pelo método de difusão em disco de ágar
segundo Ferrari et al . ( 19 ) com modificações. A suspensão da cepa de S. aureus contendo 10 
8
 UFC /
mL foi uniformemente espalhada com swab estéril sobre a placa com ágar Brain Heart Infusion (BHI;
HiMedia). Whatman não. 1 disco de papel de filtro (Sigma-Adrich, Merck, St. Louis, MO, EUA) de 6 mm
impregnado com 20 μL de sobrenadante livre de células obtido por centrifugação (centrífuga K14-1215;
Kasvi, São José dos Pinhais, Brasil) a 2500 × gpor 10 min de cada isolado de LAB autóctone foram
colocados na superfície do ágar. O pH do sobrenadante livre de células foi ajustado para 6,5 (1 mmol / L
NaOH). Após incubação a 37 ° C por 24 h, o raio (mm) das zonas de inibição ao redor dos discos foi
medido. Zonas de inibição menores que 1 mm de raio foram consideradas negativas. A experiência foi
realizada em triplicado. Seis LAB autóctones com a maior atividade antimicrobiana contra a cepa de S.
aureus foram selecionados para testes adicionais descritos abaixo.
Atividade antimicrobiana entre e identificação molecular de LAB autóctone
Um teste foi realizado para observar a atividade antimicrobiana entre BAL autóctones ( 20 ). Neste ensaio,
as cepas LAB foram cultivadas em caldo MRS a 37 ° C por 24 h. Uma alíquota de 1 mL do isolado LAB
(aprox. 10 
6
 UFC / mL, concentração final) e 15 mL de caldo MRS (HiMedia) foram inoculados na placa
usando o método de placa pour. Uma alíquota de 10 µL de outro isolado LAB foi aplicada em ágar MRS e
incubada por 24 h a 37 ° C. A detecção de uma zona de inibição no gramado indicou que houve ação
antagônica entre os isolados de LAB. A experiência foi realizada em triplicado.
A identificação molecular das seis cepas LAB foi feita da mesma forma que para os patógenos.
Propriedades de segurança, tecnológicas e funcionais do LAB autóctone
Foram realizados testes fenotípicos para identificar a atividade de virulência de LAB autóctone, incluindo
atividade hemolítica ( 14 ), produção de DNase e capacidade de coagular plasma de coelho ( 19 ). A
resistência das cepas de LAB aos antimicrobianos ( Tabela 1 ) foi testada pelo teste de difusão em disco
de ágar, utilizando Multidiscos Gram Positivo 12® (Laborclin) ( 15 ).
Como candidatos probióticos, as seis cepas autóctones de LAB foram testadas em soluções que simulam
quimicamente condições fisiológicas. A taxa de sobrevivência de LAB em pH = 2 e em condições de sal
biliar (2%) foi calculada pela determinação das contagens viáveis totais nos tempos 0 e 3 h em ágar MRS
de acordo com de Almeida Júnior et al . ( 14 ). Além disso, o proteolítico ( 14 ) e β-galactosidase ( 19)
atividades de LAB autóctones foram verificadas. Para verificar a atividade proteolítica, as cepas foram
semeadas em ágar leite desnatado (HiMedia) e incubadas a 7 ° C por 10 dias e 37 ° C por 48 h. Um halo
claro ao redor das colônias indicou um resultado positivo. Para a atividade da enzima β-galactosidase,
uma colônia de cada isolado foi emulsionada no tubo contendo um disco ONPG ( o- nitrofenil- -β- �-
galactopiranose) (Fluka, Buchs, Suíça) e 1 mL de solução salina estéril. Os tubos foram incubados a 37 °
C, e a coloração amarela (reação positiva) foi observada em 6 h. Todos os testes foram realizados em
triplicata.
Controle da cepa de S. aureus por LAB autóctone em queijo de cabra de coalho
O queijo de cabra artesanal (queijo de coalho) foi produzido para avaliar a atividade antibacteriana do LAB
contra S. aureus. Os LAB foram inoculados usando uma mistura das seis cepas LAB autóctones isoladas
de queijo de cabra (UNIVASF CAP QC1, QC4, QC13, QC14, QC18 e QC19) com maior atividade
antimicrobiana contra a cepa de S. aureus . O experimento foi conduzido conforme proposto por Ferrari et
al . ( 19 ) com modificações no uso do patógeno e na concentração do inóculo. Este estudo utilizou um
patógeno S. aureus isolado de queijo de cabra (QCSA24, um isolado MDR de S. aureus enterotoxigênico
). A primeira amostra de queijo (SA, controle positivo) foi inoculada com S. aureus, suspenso em 1% de
leite na concentração de 10 
8
 UFC / mL. A segunda amostra de queijo (SA + LAB) foi inoculada com a
mesma concentração de 10 
8
 UFC / mL de S. aureus e a mistura de seis cepas selecionadas de E.
faecium . A terceira amostra de queijo (NC) serviu como controle negativo, sem adição de
microrganismos. O queijo de cabra artesanal foi escorrido e colocado em formas perfuradas (250 g).
Foram realizadas três determinações repetidas para cada queijo. As amostras de queijoforam
acondicionadas em sacos plásticos estéreis e armazenadas a 10 ° C por 20 dias. As análises
bacteriológicas ( S. aureus e LAB) e medidas de pH foram realizadas em cinco intervalos de cinco dias
(dias 0, 5, 10, 15 e 20) em triplicata.
Análise estatística
O software SISVAR® v. 5.6 ( 21 ) ajudou a analisar estatisticamente as atividades antimicrobianas de LAB
autóctone contra S. aureus isolado em queijo de cabra. Os resultados foram avaliados por ANOVA e os
valores médios comparados pelo teste de Scott-Knott ( 22 ). Os dados quantitativos foram analisados por
regressão. Um valor de probabilidade em p <0,05 foi estatisticamente significativo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Qualidade microbiológica e valor de pH do queijo de cabra de coalho
De acordo com o Regulamento Técnico Brasileiro de Identidade e Qualidade, o queijo de coalho é obtido
pela coagulação do leite pelo coalho, complementado ou não pela ação do LAB selecionado, armazenado
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a uma temperatura média de 10–12 ° C e normalmente comercializado até dez dias após a fabricação ( 23
). Além disso, de acordo com a legislação brasileira, é um produto de média a alta umidade, da coalhada
semicozida ou cozida ou de outra forma preparada a partir da coalhada crua (sem aquecimento) ( 23 ). As
amostras de queijo de cabra coletadas neste estudo foram preparadas a partir de coalhada crua (não
aquecida) e apresentavam alta umidade.
As contagens totais de MAB e LAB no queijo permaneceram em 6,7 e 6,6 log UFC / g, respectivamente (
Tabela 2 ). Em geral, nossos resultados mostraram uma contagem alta do número de células em
comparação com as encontradas em outras variedades de queijo de cabra que foram observadas
anteriormente em Marrocos, Espanha e Grécia ( 24 , 25 ). Os lactobacilos mesófilos são os componentes
mais importantes da microbiota LAB não inicial (NSLAB) do queijo. Esses microrganismos podem
contribuir para as características sensoriais e a inibição de patógenos potenciais no produto ( 25 , 26 ).
Tabela 2 Log da enumeração dos grupos microbianos e determinação do pH (valor médio ± desvio
padrão) do queijo de cabra de coalho comercializado em municípios do semi-árido nordeste do Brasil
Município N (microrganismo) / (log CFU / g)
N (TC) / (log
MPN / g) pH
MAB LAB Staphylococcusaureus
Petrolina 6,7 ± 1,2 6,5 ± 1,3 6,9 ± 0,3 6,7 ± 1,0 5,4 ± 0,1
Santa Maria da
Boa Vista 7,6 ± 0,1 7,0 ± 0,5 6,7 ± 0,7 5,7 ± 3,7 5,7 ± 0,2
Lagoa Grande 6,9 ± 0,7 6,0 ± 0,6 5,9 ± 0,6 3,2 ± 2,5 5,7 ± 0,3
Cabrobó 6,0 ± 0,6 6,6 ± 0,6 6,3 ± 0,7 1,17 ± 0,02 5,4 ± 0,1
Casa nova 7,0 ± 0,7 7,0 ± 0,5 5,82 ± 0,09 1,17 ± 0,02 5,2 ± 0,2
Sento Sé 6,6 ± 0,5 7,0 ± 0,4 5,6 ± 0,3 1,17 ± 0,02 5,24 ± 0,09
Dormentes 6,1 ± 0,7 6,2 ± 0,4 5,7 ± 0,2 1,17 ± 0,02 5,19 ± 0,06
Afrânio 7,1 ± 0,8 6,8 ± 1,0 6,8 ± 0,8 1,17 ± 0,02 5,3 ± 0,2
Média 6,7 6,6 6,2 2,7 5,4
MAB = bactéria aeróbia mesofílica, LAB = bactéria láctica, TC = coliformes termotolerantes, CFU =
unidade formadora de colônia, MPN = número mais provável
Quanto à legislação vigente no Brasil para critérios microbiológicos de queijos com alto teor de umidade,
tanto o Ministério da Saúde quanto o Ministério da Agricultura, por meio da lei RDC 12 ( 27 ) e da Portaria
146 ( 28 ), respectivamente, concordam que 2 das 5 amostras podem conter entre 3 e 3,7 log CFU / g de
coliformes termotolerantes, 2 de 5 amostras podem conter entre 2 e 3 log CFU / g de estafilococos
coagulase-positivos, enquanto Salmonella spp. e L. monocytogenes devem estar ausentes do produto.
Neste estudo, cinco, três e duas amostras dos municípios de Petrolina, Santa Maria da Boa Vista e Lagoa
Grande (PE), respectivamente, não estavam em conformidade com a legislação para coliformes
termotolerantes. Em média, a população de coliformes termotolerantes foi de 2,7 log UFC / g ( Tabela 2 ).
A presença de coliformes parece ser comum em queijos de leite de cabra cru, conforme relatado
anteriormente ( 24 ). Dentre as 40 amostras positivas para coliformes termotolerantes, em 11 amostras
houve confirmação fenotípica de E. coli ( Tabela 3 ).
Tabela 3 Confirmação bioquímica e índice de resistência múltipla a antibióticos (MAR) (≥0,5) de patógenos
isolados de queijo de cabra de coalho comercializado em municípios do semi-árido nordestino
Município Número de isolados
Escherichia coli CNS CPS Staphylococcusaureus
Salmonella
spp.
Listeria
spp.
Petrolina 1 5 nd nd 5 1
Santa Maria da Boa
Vista nd 2 1 2 5 nd
Lagoa Grande 3 2 2 1 2 2
Cabrobó 3 nd 3 2 2 1
Casa nova 4 nd 4 1 nd 1
Sento Sé nd nd 4 1 nd 1
Dormentes nd 1 2 2 1 nd
Afrânio nd 3 2 nd 3 nd
Número total de
isolados 11 13 18 9 18 6
Número de isolados
com índice MAR ≥
0,5
8 nd nd 9 12 6
CNS = Staphylococcus coagulase-negativo , CPS = Staphylococcus coagulase-positivo , nd = não
detectado
Em relação à enumeração presuntiva de S. aureus , a média geral dos municípios foi de 6,2 log UFC / g (
Tabela 2 ). Foi perceptível que a população de LAB e Staphylococcus foi semelhante nas amostras de
queijo de cabra, ambos na faixa de 6 log UFC / g. As contagens de Staphylococcus foram superiores ao
recomendado pela legislação ( Tabela 2 ) em todas as amostras. Na identificação bioquímica ( Tabela 3 ),
13 isolados foram confirmados como Staphylococcus coagulase-negativos , 18 como Staphylococcus
coagulase-positivos e 9 como S. aureus .
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S. aureus é um dos patógenos mais comuns associados ao queijo de leite cru. Apresenta uma
preocupação de segurança microbiológica apenas quando está presente em um nível superior a 4 log
UFC / ge quando as cepas podem produzir enterotoxinas. Geralmente, a quantidade de enterotoxinas
estafilocócicas para o estabelecimento dos sintomas típicos de intoxicação alimentar varia de 20 ng a 1 μg
( 29 ).
Salmonella spp. foram detectados em 18 amostras de queijo de cabra (45%; Tabela 3 ). A Salmonella
pode ser originada do leite de cabra, utensílios e equipamentos, e manuseio inadequado durante a
produção de queijo. Salmonella spp. sobrevivem por longos períodos em queijo de cabra e representam
um perigo potencial para a saúde. Surtos de infecções por Salmonella spp. têm sido associados ao
consumo de queijo ( 30 ). No Brasil, existem poucas informações sobre a prevalência de Salmonella spp.
no leite de cabra e seus derivados. Oliveira et al . ( 4 ) relatou a presença de S. entérica em amostras de
leite em fazendas de cabras leiteiras da região do Cariri, estado da Paraíba, Brasil.
L. monocytogenes foi detectada em seis amostras de queijo de cabra (15%; Tabela 3 ), o que é uma
grande preocupação para os consumidores desse produto na região. A legislação brasileira não tolera a
presença de L. monocytogenes em produtos alimentícios. El Galiou et al. ( 24 ) relataram a presença
desse patógeno em amostras de queijo de cabra. De acordo com Melo et al . ( 31 ), L. monocytogenes é
um desafio para a indústria de laticínios. O queijo oferece um ambiente adequado para esse patógeno,
que também é persistente em fábricas de processamento de laticínios.
O valor médio do pH do queijo coletado em diferentes municípios neste estudo variou de 5,2 a 5,7, e a
média geral foi de 5,4 ( Tabela 2 ). Na legislação brasileira, o pH do leite de cabra é ligeiramente menos
ácido que o do leite de vaca ( 32 ). No entanto, diversos fatores, como microbiota autóctone, composição
química, parâmetros de coagulação, tempo de maturação e tecnologia tradicional, podem afetar o pH do
queijo.
Teste de resistência antimicrobiana e índice MAR
O perfil de resistência antimicrobiana chama a atenção para o alto índice MAR de patógenos. Em nosso
estudo, havia patógenos com índices MAR superiores a 0,5 e resistentes a três ou mais antimicrobianos.
Entre os 11 isoladosde E. coli , oito apresentaram índices MAR superiores a 0,5 ( Tabela 3 ). Doze
Salmonella spp. os isolados apresentaram índices MAR maiores ou iguais a 0,50 ( Tabela 3 ), enquanto
seis isolados de Listeria spp. foram classificados como MDR ( Tabela 3 ). Um isolado de S. aureus do
município de Casa Nova (QCSA24) apresentou o maior índice MAR 0,91, seguido pelo isolado do
município de Dormentes (QCSA34), com índice MAR 0,83 (dados não mostrados).
Todos os isolados de S. aureus mostraram-se resistentes a três ou mais classes de antimicrobianos e
apresentaram índice MAR maior ou igual a 0,50 ( Tabela 3 ). As cepas de Staphylococcus coagulase-
negativa e Staphylococcus coagulase-positiva apresentaram índices MAR menores que 0,5 ( Tabela 3 ).
Esses resultados mostraram que o queijo de leite cru pode atuar como veículo para a transmissão de
cepas MDR de patógenos, constituindo assim um potencial risco para a saúde pública. Os consumidores
devem evitar o consumo de queijo de leite cru de má qualidade microbiológica.
Identificação de patógenos e presença de genes de enterotoxinas de S. aureus
Dois isolados de cada gênero com o índice MAR mais alto que eram resistentes a três ou mais
antimicrobianos testados foram bioquimicamente identificados como E. coli (QCE15 e QCE18). Salmonella
spp. (QCS5 e QCS7), Listeria spp. (QCL5 e QCL19) e S. aureus (QCSA24 e QCSA34) também foram
identificados molecularmente. A identificação por sequenciamento do gene 16S rRNA apresentou 99% de
similaridade com E. coli (GU594316.1 / GU811877.1), Salmonella Typhi (DQ480723.1), S. aureus
(NR_037007.1 / NR_113956.1) e L. monocytogenes ( NR_044823.1). Esses patógenos foram relatados
em queijo de cabra ( 24 , 33 ).
Os genes da enterotoxina A ( sea ), B ( seb ), C ( sec ) e D ( sed ) foram detectados nos dois isolados de
S. aureus (QCSA24 e QCSA34). Yoon et al . ( 29 ) relataram que algumas cepas de S. aureus isoladas de
queijo são capazes de formar quatro sorotipos diferentes de enterotoxinas estafilocócicas (SEs), sea, seb,
sec e sed . O queijo de cabra de coalho produzido na região semi-árida do nordeste do Brasil é um
potencial carreador do S. aureus enterotoxigênico .
Atividade protetora e identificação de LAB autóctone
Houve diferenças observáveis na atividade inibitória do LAB autóctone (p <0,05) contra o isolado de S.
aureus MDR enterotoxigênico (QCSA24, índice MAR 0,91). Vinte e dois isolados de LAB mostraram uma
capacidade de inibir S. aureus ( Fig. 2 ). Seis isolados de LAB dos municípios de Petrolina (QC1 e QC4),
Lagoa Grande (QC13 e QC14) e Cabrobó (QC18 e QC19) apresentaram atividade inibitória pronunciada.
Esses isolados foram selecionados para testes subsequentes da capacidade de conferir essa atividade
inibitória ao queijo artesanal. De acordo com Yoon et al . ( 29 ), LAB demonstrou inibir o crescimento de S.
aureus em queijo pela produção de diacetil, ácidos orgânicos e bacteriocinas.
Fig. 2 Atividade antimicrobiana de isolados autóctones de bactérias lácticas (LAB) (UNIVASF CAP) contra
o isolado de Staphylococcus aureus multirresistente enterotoxigênico (QCSA24) de queijo de cabra de
coalho. Os valores designados por letras diferentes são significativamente diferentes (p <0,05). Erro
padrão = 0,122
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Cada isolado LAB autóctone foi testado contra outro isolado LAB para testar a atividade antimicrobiana
entre eles. Nenhum dos seis isolados de LAB selecionados exibiu a capacidade de inibir outro isolado.
Esse achado é interessante pelo uso dessas culturas em conjunto como inibidores contra S. aureus .
After the selection of autochthonous LAB with antibacterial activity against S. aureus and the observation of
non-antagonism among them, they were subjected to molecular identification. These LAB isolates were
identified based on 16S rRNA gene sequence analysis with 99% similarity as Enterococcus faecium
(NR_114742.1), which has been found in Brazilian artisanal cheese products (34).
Virulence factors and technofunctional properties of autochthonous E. faecium
For the characterization of virulence factors, the six tested E. faecium isolates were negative for haemolytic
activity, production of DNase and ability to coagulate rabbit plasma (Table 4).
Table 4 Safety, technological and functional properties of selected autochthonous Enterococcus faecium
from coalho goat cheese
Property Enterococcus faecium (UNIVASF CAP)
QC1 QC4 QC13 QC14 QC18 QC19
Haemolytic activity – – – – – –
Production of DNase – – – – – –
Coagulase activity – – – – – –
Inhibition between LAB – – – – – –
Susceptibility rate/%* 91.66 100 100 100 100 91.66
Resistance to antimicrobial
agent* oxacilin – – – – oxacilin
Survival rate to pH=2/% 98.3 95.8 99.1 96.8 95.6 97.1
Survival rate to 2% bile
salts/% 98.5 99 99.2 99 98.9 98.7
β-Galactosidase activity + + + + + +
Proteolytic activity + + + + + +
*12 tested antimicrobials, –=negative, +=positive, LAB=lactic acid bacteria
Another important criterion to be investigated is the antibiotic resistance of these strains. Antibiotic-
sensitive LAB have no contribution to horizontal transfer of antibiotic resistance genes to pathogenic
bacteria. In this study, the strains showed high rates of susceptibility to antimicrobial agents (Table 4). Four
enterococcal strains showed sensitivity to all investigated antibiotics. The strains E. faecium QC1 and
QC19 were only resistant to oxacillin. Resistance to this antibiotic in E. faecium isolated from cheese was
also verified by Amaral et al. (35). These authors reported that the resistance to oxacillin is an intrinsic
feature of E. faecium, chromosomally encoded.
These four isolates also demonstrated high tolerance to low pH and bile salts. The survival rates under
these conditions ranged from 95.6 to 99.1% and from 98.5 to 99.2%, respectively (Table 4). The gastric
emptying half time and the small bowel transit time in healthy women and men, in general, are estimated to
be approx. 3 h (36). These criteria are important, since probiotic strains must be able to withstand pH
variations and bile in the gastrointestinal tract. In addition, tolerance to low pH is also fundamental for the
technological use of these cultures in cheese. Our results corroborate those of İspirli et al. (37); E. faecium
isolated from cheese showed the ability to inhibit S. aureus and had technofunctional properties for use in
cheese production.
The six isolates of E. faecium were positive for β-galactosidase and proteolytic activity (Table 4). Dos
Santos et al. (34) also reported the isolation of E. faecium from Brazilian cheese with β-galactosidase and
proteolytic activity. Cultures that have the ability to ferment lactose are very important for the dairy industry.
Functionally, the hydrolysis of lactose allows cheese consumption by people intolerant to lactose.
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Inhibition of S. aureus growth by E. faecium in coalho goat cheese
The milk used to produce the cheese was in accordance with the standard of identity and quality of product
(32). After the thermal processing of milk, in the negative control cheese there was no detection of
microorganisms. In the positive control cheese (SA), LAB were also not detected. Thus, only our selected
Enterococcus inoculum was evaluated for the control of pathogenic S. aureus in coalho goat cheese.
There was correlation (p<0.05) between the storage period and the count of S. aureus in all cheese
samples (Table 5). A lower population of pathogens was present in the cheese inoculated with the mix of E.
faecium (SA+LAB). Populations of S. aureus differed among cheese samples from the 5th day of storage
(p<0.05).
Table 5 The viable count (log CFU/g) of Staphylococcus aureusin the cheese samples (SA and SA+LAB)
and of Enterococcus faecium in cheese sample SA+LAB (with a mix of E. faecium UNIVASF CAP) during
storage for up to 20 days at 10 ºC
Cheese
sample t(storage)/day
Log fold decrease
day 0–20 Equation
0 5 10 15 20
N(S. aureus)/(log CFU/g)1
SA 8.37a 7.91a 7.94a 7.94a 7.93a 0.44 y=0.002x
2–0.07x+8.31
R2=0.80
SA+LAB* 8.39a 6.48b 6.48b 5.68b 5.57b 2.82
y=–0.14 x+7.81
R2=0.80
N(E. faecium)/(log CFU/g)2 Log fold increaseday 0–20
SA+LAB* 8.50 9.43 9.76 9.93 9.91 1.41 y=0.07x+8.846
R2=0.77
For each column, mean values with different letters are significant (p<0.05) according to the Scott–Knott
test, standard error=10.0384 and 20.0245
*Cheese with the inclusion of E. faecium mix, SA=S. aureus, LAB=lactic acid bacteria
In the positive control (SA), the regression equation showed that there was a decrease in the S. aureus
population as a function of the storage period (Table 5). According to the regression equation, the lowest
count was on day 16, where the pathogen population measured 7.76 log CFU/g. In general, there was a
difference of 0.44 log units in the initial and final population of S. aureus in the positive control (SA). This
small decrease might have been influenced by the storage temperature, in accordance with Jakobsen et al.
(38).
There was a difference of 2.82 log units in the initial and final population of S. aureus in the cheese sample
SA+LAB (Table 5). In this cheese, the population of S. aureus decreased 0.13 log units per day according
to the first degree equation. During the assessment period, there was a reduction of approx. 3 log units of
the S. aureus population. Sahraoui et al. (5) also reported an antagonistic effect of autochthonous
Lactococcus strain from Algerian raw goat’s milk against S. aureus. Inhibition of S. aureus by LAB can be
associated with acidification, bacteriocin and H2O2 production. Delpech et al. (39) confirmed that the
growth of the foodborne pathogen S. aureus can be inhibited in milk and cheese by hydrogen peroxide-
producing bacteria.
In relation to the population of selected Enterococcus from goat cheese, the inoculum increased linearly
over time (0.07 log unit per day), as can be explained by the first degree equation (Table 5). The LAB
population increased 1.41 log units at the end of storage period (day 0 to day 20). The selected inoculum
of E. faecium (UNIVASF CAP) and S. aureus originated from goat cheese. Our UNIVASF CAP isolates
exhibited inhibition of S. aureus (isolate with highest MAR index) both in vitro and in the goat cheese
product. Sahraoui et al. (5) confirmed that autochthonous LAB, in addition to their bioprotective effect,
contribute to the terroir of the product and sustain the Protected Appellations of Origin of the cheese.
It is noteworthy that Enterococcus contributes to the development of the flavour of cheese (26, 37),
improving the sensory acceptance of the goat product. In this study we reported an average of 6.2 log
CFU/g of S. aureus in coalho goat cheese commercialized in the semi-arid region. Thus, the addition of
inoculum containing enterococci could be an option so that the product caters to Brazilian legislation by not
containing enough pathogen population to produce enterotoxin. As previously discussed, a pathogen
population greater than 4 log CFU/g in milk and milk products is necessary for the production of
enterotoxin. Thus, the inoculum constitutes an additional hurdle for the pathogen population in the product.
Furthermore, the success for the prevention of S. aureus growth in cheese requires hygiene measures
implemented along the entire production chain.
The pH in positive control (SA) changed following a quadratic equation (Fig. 3), with a higher value on the
12th day (6.77), and a minimum reduction at the end of storage. In cheese sample SA+LAB, the pH value
decreased linearly over time by 0.05 units per day. Although S. aureus have bacterial proteases that induce
proteolytic degradation, generating alkaline radicals, the pH decline can be explained by the production of
organic acid by the UNIVASF CAP isolates.
Fig. 3 pH values in cheese samples without (SA) and with (SA+LAB) a mix of Enterococcus faecium during
storage for up to 20 days at
10 °C. Standard error=0.031, SA=Staphylococcus aureus, LAB=lactic acid
bacteria
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CONCLUSIONS
The cheese commercialized in the semi-arid northeastern region of Brazil is a pathogen vehicle. Multidrug
resistant (MDR) strains of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria and Salmonella are circulating
in the product. The pathogen most commonly present in coalho goat cheese was Staphylococcus.
However, this study demonstrated that selected autochthonous lactic acid bacteria (LAB) from goat cheese
(UNIVASF CAP), identified as Enterococcus faecium, were able to reduce approx. 3 log units of the
enterotoxigenic MDR S. aureus isolated from coalho goat cheese. These autochthonous LAB cultures,
which are particular biotype of a geographical area, ensure a differentiated coalho goat cheese, exclusive
to the region of origin. In addition, these cultures can contribute to increasing the sensory and functional
properties of the artisanal goat cheese. Thus, the selected LAB inoculum could be an option for
smallholders to produce cheese with a higher microbiological quality by applying good farming and
processing practices, such as using milk of good quality and following proper hygiene procedures during
cheese-making.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors wish to acknowledge the FACEPE (Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado
de Pernambuco) for financial support and scholarship, and the FIOCRUZ (Fundação Oswaldo Cruz) for the
donation of S. aureus strains (INCQS 00285, INCQS 00005, INCQS 00080 and INCQS 00093).
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