Relatório - DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CUMARINA NO EXTRATO LÍQUIDO DAS CASCAS DO CAULE DO CUMARU E DO TEOR DE ANETOL NO ÓLEO ESSENCIAL DO FRUTO FUNCHO

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM - FFOE
FARMACOGNOSIA I
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CUMARINA NO EXTRATO LÍQUIDO DAS
CASCAS DO CAULE DO CUMARU (Amburana cearensis A. C. Smith)
E DO TEOR DE ANETOL NO ÓLEO ESSENCIAL DO FRUTO FUNCHO
(Foeniculum vulgare Miller.)
FORTALEZA
2017
SUMÁRIO
1. Introdução…………………………………………………...………...02
2. Objetivos……………………………………………………………….05
2.1. Objetivo Geral…………………………………………………..05
2.2. Objetivos Específicos………………………………………….05
3. Materiais e Métodos………………………………………………….06
3.1. Teste de autenticidade………………………………………..06
3.2. Análise de Pureza..…………………………………………….07
3.3. Granulometria…..……………………………………………...10
3.4. Métodos extrativos…………………………………………….10
3.5. Cromatografia em Camada Delgada………………………....12
3.6. Espectrofotometria…………………………………………....14
3.7. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).................15
4. Resultados e discussões……………………………………………..17
4.1. Teste de autenticidade………………………………………..17
4.2. Granulometria………………………………………………….17
4.3. Análise de Pureza……………………………………………...19
4.4. Métodos extrativos…………………………………………….20
4.5. Cromatografia em Camada Delgada………………………....20
4.6. Espectrofotometria…………………………………………....22
4.7. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)..................23
5. Conclusão……………………………………………………………....27
6. Referência……………………………………………………………...28
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Amburana cearensis A. C. Smith
A Amburana cearensis é uma planta arbórea silvestre da
família Fabaceae típica da região nordestina, tem porte regular,
podendo atingir até 10 metros de altura na caatinga nordestina e
até 20 metros na zona da mata (J. R .G. S. Almeida et al. 2010). É
popularmente conhecida como “umburana-de-cheiro”, “cumaru” ou
“cumaru-do-Ceará” apresenta um aroma forte e agradável em
todas as partes da planta e possui um caule revestido por uma
casca castanha que se descasca em finas camadas formando
grandes manchas vermelhas (figura 1).
Figura 1 - Caule de Amburana
cearensis.
A madeira desta árvore é amplamente utilizada na medicina popular para o
tratamento de doenças respiratórias como asma e bronquite, além disso, estudos
farmacológicos já caracterizaram diversos princípios ativos das cascas de seu caule,
entre eles a 1,2-benzopirona, cumarina, (figura 2) apresenta potencial antioxidante,
anti-inflamatório e relaxante do músculo liso da traqueia de roedores (ARARUNA, S.
M. 2013)
Figura 2 - 1,2-benzopirona princípio ativo extraído da casca do caule do cumaru.
1.2 Foeniculum vulgare Miller.
O Foeniculum vulgare é uma erva aromática da família Apiaceae nativa na
Europa mediterrânea, norte da África e Ásia ocidental (ARAUJO, R. O .et al. 2013) e
popularmente conhecida como “funcho” ou “falsa erva doce” devido a constante
confusão botânica causada pela semelhança de seu fruto com o fruto da espécie
Pimpinella anisum L.
O funcho é tradicionalmente utilizado como condimento para aromatização de
alimentos, seu cheiro forte e aromático é devido ao seu óleo essencial anetol -
trans-1-metoxi-4-(prop-1-enil)benzeno- (figura 3) que também é utilizado na
produção de cosméticos. (CARVALHO et al., 2011). Além disso, a medicina popular
o utiliza para tratamento de doenças digestivas, problemas menstruais e também
como antiinflamatório e analgésico.
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Figura 3 - Anetol ou trans-1-metoxi-4-(prop-1-enil)benzeno, óleo essencial do fruto F. vulgare, este
está representado ao lado.
. Comprovadamente o anetol apresenta atividade antimicrobiana frente a
bactérias Gram-positivas (ARAÚJO, R. O .et al. 2013) combate às cólicas
abdominais e à formação de gases intestinais, atua também como expectorante,
antiespasmódico, antiinflamatório e diurético.(TINOCO; MARTINS; CRUZ-MORAIS,
2007).
1.3 Determinação do teor de cumarina da A. cearensis e do anetol do F.vulgare
De posse do conhecimento da relevância desses metabólitos para a saúde
humana, é necessário que essas drogas vegetais sejam submetidas a um controle
de qualidade, por esta razão o nosso trabalho envolveu testes de autenticidade,
pureza e integridade segundo as metodologias para análise de drogas vegetais que
constam na farmacopéia brasileira volume 1 da 5ª edição.
Para que esses princípios ativos sejam utilizados em sínteses químicas ou
como produto derivado para uso científico ou comercial é necessário que sejam
extraídos em quantidade suficiente, no entanto, a quantidade de princípio extraído
dependerá do método de extração.
Os métodos extrativos utilizados neste trabalho foram a infusão para a
cumarina e a coobação para o anetol. A infusão consiste em derramar água fervente
sobre a parte de planta de onde será extraído o princípio ativo e deixar em repouso
até obter uma solução. A coobação pode ser definida como uma destilação repetida,
a fim de se obter uma maior concentração de uma dada substância ativa através da
ebulição da suspensão aquosa do material vegetal, em um aparelho de Clevenger,
que condensa os vapores, recolhe a solução condensada e separa o óleo imiscível
da água.
A presença desses metabólitos nos extratos obtidos foi medida através dos
método qualitativo da Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e do método
quantitativo da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou HPLC). Para a
determinação do teor de cumarina também foi utilizado o método quantitativo de
espectrofotometria.
3
A CCD consiste na separação dos componentes de uma mistura sólido líquido onde
a fase móvel (líquida) migra sobre uma camada delgada de adsorvente retido em
uma superfície plana (fase estacionária – sólida). É um método de cromatografia
plana, onde a mistura é separada pela eluição diferencial sobre uma superfície com
uma camada fina de adsorvente. É caracterizada por ser rápida e de baixo custo,
muito útil em análise de substâncias orgânicas e organometálicas. Os adsorventes
mais utilizados para essa técnica são a sílica (SiO2), a alumina (Al2O3), a celulose,
entre outros.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou HPLC) é um tipo de
cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais
especialmente preparados e uma fase móvel que é eluída sob altas pressões. Ela
tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande
quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de
tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade (COLLINS,
1988).
Justificativa: Diante o exposto é importante a escolha de um método correto para
a produção de um produto derivado, esse produto requer uma caracterização para
estabelecer parâmetros para o controle e qualidade deste produto.
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2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver e caracterizar um extrato das cascas da Amburana cearensis A.
C. Smith e o óleo essencial dos frutos do Funcho (Foeniculum vulgare Mill.)
preparado pelo método extrativo de Coobação, utilizando o aparelho Clevenger.
2.2 Objetivos específicos
2.2.1 Avaliar a autenticidade da amostra comercial do fruto de funcho - Foeniculum
vulgare.
2.2.2 Avaliar a pureza de plantas medicinais de Programas Públicos de Fitoterapia
ou presentes no Mercado Alimentício ou Farmacêutico com auxílio de métodos
farmacopéicos.
2.2.3 Estimar as porcentagens correspondentes a cada fração granulométrica,
assim como classificar a amostra.
2.2.4 Produzir o extrato da casca do caule do cumaru (Amburana cearensis),
empregando o método de extração por infusão e extrato dos frutos do funcho
(Foeniculum vulgare) pelo método de coobação, para realizar pesquisas acerca do
princípio ativo pesquisado e fazer o uso deste nas demais práticas.
2.2.5 Pesquisar a presença de cumarina ou anetol em produtos derivados obtidos a
partir de plantas cumarínicas e fruto do funcho (Foeniculum vulgare),
respectivamente por Cromatografia em Camada Delgada (CCD).
2.2.6 Determinar a concentração de fenóis totais no extrato de cumaru, Amburana
cearensis, por espectrofotometria.
2.2.7 Realizar a dosagem de cumarina no extrato de cumaru e anetol no extrato eFuncho, em diferentes concentrações, através da técnica de Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência (CLAE ou HPLC).
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3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Produção do produto derivado
Para a produção do extrato líquido das cascas do caule do cumaru
(Amburana cearensis) e do óleo essencial do fruto funcho (Foeniculum vulgare.) e
também para a posterior quantificação de seus princípios ativos (cumarina e anetol,
respectivamente) foram seguidos os seguintes passos:
3.1.1 Teste de autenticidade
● Amostra: Fruto de funcho - Foeniculum vulgare.
● Materiais:
○ Monografia do fruto presente no livro de farmacognosia de Fernando
de Oliveira, Gokithi Akisue e Maria Kubota Akisue;
○ Amostra certificada do fruto com o número de exsicata 14756;
○ Lupa;
○ Lâmina de barbear para o corte da amostra;
○ Lâmina e Lamínula para o uso em microscópico;
○ Microscópico.
● Metodologia:
O teste de autenticidade do Foeniculum vulgare foi feito comparando a
amostra coletada à monografia do fruto presente no livro de farmacognosia de
Fernando de Oliveira, Gokithi Akisue e Maria Kubota Akisue e também em
comparação à uma amostra certificada com o número de exsicata 14756.
Em relação às características organolépticas a droga vegetal apresentou
coloração verde-acinzentada, odor aromático característico agradável e sabor
adocicado.
Quanto às características macroscópicas os frutos apresentaram superfície
gabla e tinham formato oblongo e quase cilíndricos, alguns estavam ovóides, tinham
estilópio bifurcado e arestas e valéculas paralelas ao seu comprimento. Apresentou
pouca resistência ao se dividir, sendo possível observar microscopicamente a união
dos dois metacarpos em corte transversal.
Cada mericarpo possuía 5 ângulos levementes côncavos indicando as
arestas, além disso, o epicarpo se mostrou gablo com células poligonais e estômato.
Existiam canais secretores no mesocarpo bem abaixo das valéculas, o endocarpo
era formado por células alongadas regulares e o endosperma continha células
poligonais com gotículas de óleo.
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Figura 4 - Funcho em corte transversal: 1. Feixe vascular, 2. Canal secretor, 3. aresta, 4. valécula, 5.
pericarpo, 6.semente, 7. feixe vascular do carpóforo. 8. face comissural. 9. mericarpo. Fonte: livro de
farmacognosia de Fernando de Oliveira, Gokithi Akisue e Maria Kubota Akisue.
3.2 Pureza
Os ensaios de pureza são responsáveis por fixar os limites das quantidades
aceitáveis de impurezas presentes no material a ser avaliado. Para testarmos o
nível de pureza das nossas drogas vegetais (Fruto de funho - Foeniculum vulgare e
pó da casca do caule seco de Cumaru - Amburana cearensis) foram utilizados 3
ensaios: 1.Determinação de material estranho para o funcho. 2. Determinação do
teor de umidade e 3. Determinação do teor de cinzas totais para o pó do caule seco
de cumaru.
3.2.1.Determinação de material estranho:
● Amostra: Fruto de funho - Foeniculum vulgare (embalagem comercial).
● Materiais:
○ Área quadrada com quatro partes iguais;
○ Lupa;
○ Pinça;
○ Béquer;
○ Balança.
● Metodologia:
A droga vegetal foi despejada sobre uma área quadriculada plana com quatro
partes iguais e foi distribuída de forma homogênea em todos os quadrados, em
seguida, as quantidades da amostra presentes em dois quadrados opostos de uma
diagonal dessa área quadriculada foram excluídas, e dessa forma, o método de
quarteamento prosseguiu até a obtenção de 5 gramas de amostra.
A procura por materiais estranhos foi feita primeiramente a olho nu e
posteriormente com o auxílio de uma lupa visando retirar com a pinça: 1. Partes da
planta não utilizadas como por exemplo folhas, flores e raízes.2. Outras plantas ou
partes delas, assim como qualquer outro produto ou organismo como insetos ou
partes destes. 3. Impurezas de natureza mineral ou orgânica não inerentes à droga
vegetal.
7
Todo o material estranho encontrado foi colocado em um béquer e pesado.
3.2.2. Determinação do Teor de umidade
A determinação do teor de umidade neste trabalho foi feita por
gravimetria, porém foi seguido duas metodologias diferentes: perda por dessecação
usando a estufa e usando também a balança de infravermelho.
3.2.2.1 Perda por dessecação
● Amostra: Pó da casca do caule seco de Cumaru - Amburana cearensis
● Materiais:
○ Béquer de vidro;
○ Estufa;
○ Balança.
● Metodologia:
2,002 gramas do pó da casca do caule seco de cumaru foram transferidos
para um béquer de vidro de 101,4176 gramas, totalizando 103,4196 gramas de
material que foi levado para dessecação na estufa por 5 horas a 105ºC, até que o
peso do material (béquer de vidro + amostra) ficasse constante.
Figura 5 - Exemplo de estufa, aparelho usada para determinação do teor de umidade pelo
método de perda por dessecação.
3.2.2.2 Perda de umidade em balança de infravermelho
● Amostra: Pó da casca do caule seco de Cumaru - Amburana cearensis
● Materiais:
○ Balança de infravermelho.
● Metodologia:
Foram transferidos e distribuídos uniformemente 2 gramas do pó da casca do
caule seco de cumaru para o coletor de alumínio da balança de infravermelho, o
equipamento foi ligado 30 minutos antes de fazer a análise e posteriormente
programado para aquecer a amostra durante 10 minutos a 105ºC.
Ao final da análise o valor da umidade, o valor da umidade em percentual
apareceu no visor do aparelho.
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Figura 6 - Exemplo de balança de infravermelho, aparelho utilizado para a determinação do teor de
umidade.
3.2.3. Determinação de cinzas totais
● Amostra: Pó da casca do caule seco de Cumaru - Amburana cearensis
● Materiais:
○ Cadinho;
○ Bico de busen;
○ Forno;
○ Balança.
● Metodologia:
Foi pesado 2,081 gramas de pó da casca do caule seco de cumaru em um
cadinho de 22,3211 gramas, totalizando 24,4021 gramas totais de material (cadinho
+ amostra) e este foi levado ao bico de busen a uma temperatura de
aproximadamente 200ºC até que a droga vegetal ficasse totalmente carbonizada,
em seguida, o cadinho foi levado ao forno mufla a 550ºC até que todo o carvão fosse
eliminado.
Após isso, o cadinho contendo o material incinerado foi para um dessecador e
após o seu resfriamento o material foi pesado.
Figura 7 - Exemplo de forno mufla, aparelho usado na determinação de cinzas totais. 3.4 Métodos
extrativos
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3.3 Preparação do extrato
3.3.1 Tamisação
● Amostra: casca do caule do Cumaru (Amburanas cearensis).
● Materiais:
○ Tamisador eletromagnético
○ 7 tamises com aberturas nominais diferentes
○ Balança analítica
○ Pincel
● Metodologia:
● Montou-se o conjunto com os sete tamises sobre o receptor, em ordem
decrescente de tamanho de abertura das malhas;
● Pesou -se aproximadamente 25g da amostra e colocou-se no tamis superior,
de forma que ficasse distribuída de maneira uniforme;
● Ligou-se a máquina e deixou-se funcionando por 15 minutos;
● Removeu-se a amostra retida em cada malha e no receptor com um pincel
adequado e pesou-se;
● Calculou-se o percentual retido em cada tamis, utilizando o seguinte cálculo:
% 𝑟𝑒𝑡𝑖𝑑𝑜 𝑝𝑒𝑙𝑜 𝑡𝑎𝑚𝑖𝑠 = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑟𝑒𝑡𝑖𝑑𝑜 𝑒𝑚 𝑐𝑎𝑑𝑎 𝑡𝑎𝑚𝑖𝑠𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑟𝑒𝑡𝑖𝑑𝑜 𝑛𝑜𝑠 𝑡𝑎𝑚𝑖𝑠 𝑒 𝑟𝑒𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟 𝑥 100
Figura 8 - Tamisador eletromagnético.
3.4 Métodos Extrativos
3.4.1 Extração por Infusão
● Amostra: Casca do caule do cumaru
● Materiais:
○ Panela
○ Água destilada
○ Fogão
○ 2 Béqueres
○ Placa de Petri
○ Peneira
○ Balão volumétrico
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● Metodologia:
Colocou-se a amostra de 10g em um béquer e posteriormente foi adicionado
um pouco mais de 50ml água fervente e o béquer foi tampado com uma placa de
Petri. Deixamos a infusão acontecer por 10 minutos e então, com auxílio de uma
peneira e um funil, transferimos o extrato para um balão volumétrico de 50ml.
Figura 9 - Obtenção do extrato por infusão.
3.4.2 Extração por coobação
● Amostra: Fruto de funcho - Foeniculum vulgare
● Materiais:
○ Aparelho de Clevenger
○ Manta aquecedora
○ Balão de fundo redondo
● Metodologia:
Uma amostra de 100g foi colocada em um balão de fundo redondo com 1L de
água destilada e este foi colocado em uma manta para aquecer. No aparelho de
Clevenger,a amostra está imersa na água e o vapor d’água arrasta o óleo passando
por um condensador. Observa-se a ebulição da água por cerca de 50 minutos.
Como o óleo é menos denso que a água,estes se separam em uma escala
volumétrica existente no aparelho.
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Figura 10: Exemplificação do aparelho de Clevenger.
3.5. Cromatografia em Camada Delgada
● Amostra: Extrato de cumaru e Extrato do óleo essencial do funcho
● Materiais:
○ Hexano (65:35)
○ Acetato de Etila (50:50)
○ KOH 5%
○ EtOH
○ Luz UV
○ Iodo
○ Sílica
3.5.1 Pesquisa Cumarina:
Pesquisou-se a presença de cumarina em extrato de cumaru (Amburana
cearensis A. C. Smith; parte usada: casca do caule) obtido através da infusão. Para
tanto, o extrato foi analisado por Cromatografia em Camada Delgada (CCD). A CCD
foi realizada da seguinte forma :
Na placa de sílica foram colocados a 1 cm da extremidade com um capilar, quatro
spots do extrato de cumaru e ao lado dois do padrão de trabalho de Cumarina.
Deixou-se o solvente evaporar e em seguida colocou-se a placa em uma cuba
cromatográfica, que possuía a fase móvel (hexano: acetato de etila), evitou-se que
o ponto de aplicação da amostra mergulhasse no solvente. A placa foi deixada na
cuba para que ocorresse a eluição. Quando o solvente atingiu a outra marca de 1,0
cm no topo da placa, esta foi removida da cuba e colocada na estufa para secar por
aproximadamente 3 minutos.
Em seguida, aplicou-se o revelador KOH EtOh e colocou em uma luz UV, assim,
pode-se observar a eluição e o fator de retenção (Rf) foi calculado.
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3.5.2 Pesquisa de anetol:
Pesquisou-se a presença de anetol no óleo essencial de Foeniculum
vulgare (OEFV) (funcho, parte usada: fruto) obtido por hidrodestilação. Para
tanto, o extrato foi analisado por CCD. A CCD foi realizada da seguinte forma :
Na placa de sílica foram colocados a 1 cm da extremidade com um capilar, cinco
spots do extrato de funcho e ao lado três do padrão de trabalho de Anetol.
Deixou-se o solvente evaporar e em seguida colocou-se a placa em uma cuba
cromatográfica, que possuía a fase móvel (Acetona: acetato de etila), evitou-se que
o ponto de aplicação da amostra mergulhasse no solvente. A placa foi deixada na
cuba para que ocorresse a eluição.
Figura 11 - Eluição no interior da Cuba cromatográfica
Quando o solvente atingiu a outra marca de 1,0 cm no topo da placa, esta foi
removida da cuba e colocada na estufa para secar por aproximadamente 3
minutos.
Em seguida, utilizou-se como revelador o Iodo , assim, pode-se observar a
eluição e o fator de retenção (Rf) foi calculado.
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Figura 12 - Revelação da placa cromatográfica.
3.6 Espectrofotometria
● Amostra: Extrato do cumaru obtido por infusão
● Materiais:
○ Espectrofotômetro
○ Cubetas
○ Balão Volumétrico
○ Reagentes: água, reagente de Folin Cioauteau e carbonato de cálcio
Primeiro preparou-se a solução padrão de ácido gálico com concentração de
aproximadamente 0,400 mg/mL, utilizando os materiais necessários. Para a
preparação do padrão usou-se 25, 50, 100, 150 e 200 µl de solução estoque de
ácido gálico para BV 10 mL .
Após isso preparou-se a solução com o extratos do cumaru, adicionou-se 50µl
do extrato com 4 ml de água, 250 µl do reagente de Folin Ciocalteau, 3 mL de
carbonato de cálcio 10% e colocou-se em um balão volumétrico de 10 mL e
completou-se o restante do volume com água. Após 20 min, mediu-se as
absorbâncias em 785 nm empregando o Branco(solução contendo os reagentes
sem amostras ( padrão ou extrato de cumaru)) para "zerar" o espectrofotômetro.
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Figura 13 - Soluções contendo o padrão de ácido gálico em várias concentrações e o teste em
branco.
3.7 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Para a preparação da solução padrão:
● Preparou-se uma solução-mãe de cumarina com concentração aproximada
de 1,0 mg/mL;
● A partir da solução-mãe, foram produzidas 5 soluções-padrão: 0,005; 0,02;
0,05; 0,1; 0,15 mg/mL;
● As soluções foram diluídas com Etanol 20% e filtradas;
● Depois foram colocadas no vial e identificadas para prosseguir a análise.
● O mesmo procedimento foi realizado para obtenção das soluções padrão de
anetol, porém o diluente utilizado foi metanol.
Para a preparação da amostra o extrato:
● Transferiu-se 1 mL de extrato do caule do Cumaru obtido por infusão para o
balão volumétrico de 10 ml e completou-se o volume do mesmo com o
diluente apropriado, Etanol 20%.
● O mesmo procedimento foi realizado para o óleo essencial dos frutos do
funcho obtido por Coobação, porém foi utilizado apenas 0,4 mL de óleo
essencial e o diluente utilizado foi metanol .
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As análises cromatográficas foram realizadas sob algumas condições específicas
que podem ser observadas na tabela abaixo:
AMOSTRA CUMARINA ANETOL
FASE MÓVEL 35% de acetonitrila 65% de
água
85% metanol 15%
água
DILUENTE Etanol 20% Metanol
FLUXO 0,85 mL/min 1 mL/min
VOLUME DE
INJEÇÃO
20µL 20 µL
COLUNA C18 C18
TEMPERATURA 37ºC 37 ºC
DETECTOR 277nm 259nm
TEMPO DE
CORRIDA
10 min 7 min
ELUIÇÃO Isocrático Isocrático
Tabela 1: Condições Cromatográficas
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4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Autenticidade
A amostra do fruto Foeniculum vulgare correspondeu em todas as suas
características (organolépticas, macroscópicas e microscópicas) à monografia oficial
e à amostra certificada utilizada para a comparação.
4.2 Pureza
4.2.1 Determinação de materiais estranhos.
Segunda a farmacopeia brasileira 1º volume 5ª edição, a porcentagem de
elementos estranhos não deve ser superior a 2% m/m. Foram encontradas, porém,
1,010 gramas de materiais estranhos em 5 gramas de amostra, correspondendo a
20,2% m/m de impureza, valor muito acima do estipulado.
Figura 14 - cálculo para determinar a porcentagem de material estranho na amostra
Conclui-se então que a amostra do fruto Foeniculum vulgare utilizada não é
pura em relação a presença de materiais estranhos.
4.2.2. Determinação do teor de umidade
Os resultados das duas metodologias deram valores distintos, demonstrando
que não foram precisos. É muito importante que a amostra se apresente em níveis
adequados de umidade pois níveis elevados podem contribuir para desenvolvimento
de microorganismos, insetos no geral e também podem deteriorar constituintes
químicos da droga vegetal como, por exemplo, pelo processo da hidrólise.
4.2.2.1 Perda por dessecação
Ao final de 5 horas o peso constante final do material (béquer de vidro +
amostra) foi de 103,3145 gramas, logo subtraindo o peso inicial do material
(103,4196 g) do peso final temos: 0,1051 g de amostra após a dessecação.
Logo, 0,1051 gramas de amostra após a dessecação dividido pelo valor inicial
da amostra (2,002 g) gera um valor de 5,2%, representando a porcentagem final de
água em relação à droga seca. Os valores de referência na farmacopéia brasileira
são de 8 a 14%, logo o percentual de umidade na amostra de pó da casca do caule
seco de cumaru não está dentro dos padrões.
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Figura 15 - Cálculo para determinar a porcentagem final de água em relação à droga seca, onde
Pi = peso inicial do material(béquer de vidro + amostra) e Pf= peso final do material(béquer de vidro +
amostra).
4.2.2.2.Perda de umidade em balança de infravermelho
No visor da balança de infravermelho apareceu o valor 9,79%, representando
a porcentagem final de água em relação à droga seca. Os valores de referência na
farmacopéia brasileira são de 8 a 14%, logo o percentual de umidade na amostra de
pó da casca do caule seco de cumaru está dentro dos padrões.
4.2.3. Determinação de cinzas totais
A pesagem final do material (cadinho + cinzas) foi de 22,4053 gramas, ao
subtrair a pesagem do material inicial (cadinho + amostra = 24,4021 gramas) pela
pesagem do material final temos 1,9968 gramas de cinzas.
Quando 1,9968 gramas de cinzas são subtraídas da pesagem da amostra
inicial de 2,081 gramas temos o valor de 0,0842 gramas. Este valor quando dividido
pelo valor da amostra inicial gera 4,046g %, indicando a porcentagem de cinzas não
fisiológicas em relação à droga vegetal.
Logo podemos concluir que 4,046% é a quantidadede substância residual
não volátil no processo de incineração.
Figura 16 - Cálculo para determinar a porcentagem de cinzas totais em relação à droga
vegetal.
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4.3 Tamisação
Peso da amostra: 23,624 g
Abertura do Tamis (mm) Peso da amostra (g) Percentual (%)
2 0,128 0,54
0,710 8,030 34,0
0,355 10,624 44,97
0,250 2,331 9,86
0,180 0,617 2,61
0,125 0,577 2,44
(receptor) < 0,125 1,317 5,58
Tabela 2. Peso e porcentagem da amostra retida nos respectivos tamises.
A partir dos valores obtidos, traçou-se a curva de distribuição granulométrica,
marcando-se no eixo das abcissas,os diâmetros da abertura de cada malha e no
eixo das ordenadas, o peso da amostra retida em cada tamis.
A partir desses valores, temos que a casca do caule do cumaru, segundo o
método da Farmacopéia, é um pó moderadamente grosso, uma vez que mais 40%
da amostra ficou retida no tamis com abertura nominal de malha de 0,355mm.
A espessura irá influenciar diretamente no processo de extração, uma vez
que se o pó for muito grosso poderá dificultar o contato entre o solvente e a amostra,
por causa da superfície de contato e em um pó muito fino pode ocorrer
compactação, o que também dificulta esse contato, bem como pode não se ter uma
amostra tão límpida pela presença de partículas.
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4.4 Métodos extrativos
O método extrativo influencia diretamente nos rendimentos dos extratos e,
além do método utilizado, o solvente também influencia no conteúdo final da
extração. O método da infusão não foi muito eficiente para a extração da cumarina,
visto que ele é mais utilizado para extração com folhas. No entanto é um método
relativamente simples, rápido e barato. Já a coobação foi um método mais eficaz,
visto que permite o esgotamento da droga vegetal, pois esta é submetida a vários
eventos de hidrodestilação, além de funcionar em um circuito fechado. Como
resultado, obtivemos um extrato de 50ml de cumarina por infusão e 50ml de anetol
pelo método de coobação.
4.5 Cromatografia em Camada Delgada
Na placa de 10cm de comprimento, a infusão eluiu 4,8 cm e o padrão de
trabalho de cumarina eluiu 5,2 cm.
Para calcular o fator de retenção (Rf) que é um parâmetro físico da substância e
pode ser utilizado para sua identificação caso se mantenham constantes algumas
condições, mede-se a distância de uma linha à outra para encontrar o valor da
distância percorrida pelo eluente, em seguida, marca-se a distância de cada
mancha colorida até a linha inicial e divide-se pelo valor da distância percorrida
pelo eluente.
Rf = DAmostra
DEluente
Rf padrão = 5,2 = 0,65
8
Rf amostra = 4,8 = 0,6
8
Tendo, o Rf do padrão e da amostra bem próximos, 0,65 e 0,6 , comprova-se a
existência de cumarina 1,2-benzopirona no extrato de cascas se cumaru obtido
através da extração por infusão.
Na placa de 10cm de comprimento, a hidrodestilação eluiu 3,3 cm e o padrão
de trabalho do anetol eluiu cm.
Para calcular o fator de retenção (Rf) que é um parâmetro físico da substância e
pode ser utilizado para sua identificação caso se mantenham constantes algumas
condições, mede-se a distância de uma linha à outra para encontrar o valor da
distância percorrida pelo eluente, em seguida, marca-se a distância de cada
mancha colorida até a linha inicial e divide-se pelo valor da distância percorrida
pelo eluente.
Rf = DAmostra
DEluente
Rf padrão = 3,5= 0,43
8
Rf amostra = 3,3 = 0,41
8
20
Tendo, o Rf do padrão e da amostra bem próximos, 0,43 e 0,41, comprova-se a
existência de anetol no extrato do óleo essencial do funcho obtido através da
extração por hidrodestilação.
Figura 17 : CCD do extrato de cumaru obtido por infusão. O padrão de trabalho encontra-se à
esquerda da imagem, enquanto que o extrato em análise está à direita.
Figura 18: CCD do óleo essencial obtido por coobação. O padrão de trabalho encontra-se à esquerda
da imagem, enquanto que o extrato em análise está à direita.
21
4.6 Espectrofotometria
Determinação espectrofotométrica de compostos fenólicos com reagente
Folin- Ciocalteu:
Primeiramente calculou-se a concentração da solução padrão do ácido gálico e em
seguida a concentração da solução amostra contendo o extrato de cumaru.
Cálculo das concentrações:
1) Concentrações da solução padrão:
C1V1=C2V2
0,4 mg/ml x 0,025 = C2 x 10 ml
C2= 0,001 mg/ml
0,4 mg/ml x 0,05 = C2 x 10 ml
C2 = 0,002 mg/ml
0,4 mg/ml x 0,1 = C2 x 10 ml
C2 = 0,004 mg/ml
0,4 mg/ml x 0,15 = C2 x 10 ml
C2 = 0,006 mg/ml
0,4 mg/ml x 0,2 = C2 x 10 ml
C2 = 0,008 mg/ml
0,4 mg/ml x 0,1 ml = C2 x 10 ml
C2 = 0,004 mg/mL
2) Concentração da solução amostra:
C1V1=C2V2
0,4 mg/ml x 0,05 mL = C2 x 10 ml
C2= 0,002 mg/mL
A concentração de fenóis totais foi determinada pelo método colorimétrico
Reação de Folin- Ciocalteu, no qual foi analisado no espectrofotômetro em um
comprimento de onda de 785nm e foi obtido o valor de 0,307 de absorbância. Para
quantificação foi empregada uma curva padrão das concentrações de ácido gálico
nas seguintes concentrações:1,2,4,6,8 µg/ml.
22
A equação da reta obtida foi de: y=102,23x + 0,0016.
Obtido esses dados calculou-se a concentração de fenóis totais com a
seguinte equação:
0,307= 102,23x + 0,0016
X= 0,0029
Como o fator de diluição foi de 200ml, então multiplicou-se o valor de x e
obteve-se x=0,58. Portanto, a concentração de fenóis totais equivalentes a ácido
gálico foi de 0,58 mg/mL no extrato de cumaru obtido por meio do método extrativo
de infusão.
4.7Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
4.7.1 Extrato líquido das cascas do caule do Cumaru
Como forma de comprovar a linearidade do método adotado, foi construída
uma curva de calibração, que foi utilizada para determinar a concentração de
cumarina no extrato:
A curva de calibração apresentou coeficiente de determinação (R) igual a
0,9977, o que garante que o método de identificação adotado fornecerá valores de
concentração bem próximos aos reais. Como a área do pico corresponde à
absorbância e esta é diretamente proporcional à concentração de cumarina pela
Lei de Beer, é possível estabelecer a relação demonstrada no gráfico acima.
Para o extrato líquido produzido por infusão, foi observado o seguinte gráfico:
23
Figura 19: Cromatograma da amostra de cumarina.
Comparando o gráfico padrão e o da infusão, percebe-se que de fato há cumarina
no extrato preparado por infusão, visto que ambos apresentaram mesmo tempo
de retenção. A área do pico foi de 716949.
Foi realizado o seguinte cálculo:
Área do pico = 2 x 108 x concentração - 298144
716949 = 2 x 108 x concentração - 298144
Concentração = 0,002094025 mg/ml
No entanto foi realizada uma diluição na preparação da CLAE já comentada no
procedimento experimental. A real concentração pode ser calculada
conhecendo o fator de diluição, que no caso foi 10:
Concentração real = 0,002094025 x 10 =0,02094025 mg/mL
24
4.7.2 Oléo Essencial dos frutos o Funcho
Como forma de comprovar a linearidade do método adotado, foi construída
uma curva de calibração, que foi utilizada para determinar a concentração de
anetol no óleo essencial:
A curva de calibração apresentou coeficiente de determinação (R) igual a
0,9972, o que garante que o método de identificação adotado fornecerá valores de
concentração bem próximos aos reais. Como a área do pico corresponde à
absorbância e esta é diretamente proporcional à concentração de anetol pela Lei
de Beer, é possível estabelecer a relação demonstrada no gráfico acima.
Para o óleo essencial obtido por coobação, foi observado o seguinte gráfico:
Figura 20: Cromatograma da amostra e anetol.
25
Comparando o gráfico padrão e o da coobação, percebe-se que de fato há anetol
no extrato preparado por coobação, visto que ambos apresentaram mesmo tempo de
retenção. A área do pico foi de 26657169.
Foi realizado o seguinte cálculo:
Área do pico = 108 x concentração - 619827
26657169 = 108 x concentração - 619827
Concentração = 0, 26037342 mg/mL
No entanto foi realizada uma diluição na preparação da CLAE já comentada no
procedimento experimental. A real concentração pode ser calculada conhecendo o fator
de diluição,que no caso foi 25, pois tinhamos 0,4 mL de amostra:
Concentração real = 0, 26037342 x 25 = 6,5093355 mg/mL
26
5. CONCLUSÕES
5.1 Conclusão geral:
Foi possível desenvolver e caracterizar um extrato das cascas da Amburana
cearensis A. C. Smith e o óleo essencial dos frutos do Funcho (Foeniculum vulgare
Mill.) preparado pelo método extrativo de Coobação, utilizando o aparelho
Clevenger. Observando-se para isso a autenticidade e a pureza da matéria - prima,
bem como a integridade do extrato do cumaru e do óleo essencial o funcho.
5.2 Conclusões específicas:
5.2.1 A amostra comercial do fruto de funcho - Foeniculum vulgare se mostrou
autêntica.
5.2.2 O resultado obtidos no ensaio de pureza de determinação de material estranho
para amostra do fruto do funcho(Foeniculum vulgare) não se mostrou satisfatório
pois obtivemos valores acima dos limites estabelecidos pelos métodos
farmacopéicos. Na determinação de teor de umidade do cumaru por dessecação o
valor obtido foi abaixo do limite especificado pela farmacopéia, porém na
metodologia da balança de infravermelho o resultado foi aceitável. Na determinação
do teor de cinzas totais para a amostra do pó da casca do caule seco de Cumaru
(Amburana cearensis) os valores estiveram dentro do limite de aprovação.
5.2.3 Estimaram-se as porcentagens correspondentes a cada fração granulométrica,
e classificou-se a amostra como um pó moderadamente grosso,que é o ideal para
uma melhor extração .
5.2.4 Pesquisou-se a presença de cumarina ou anetol em produtos derivados
obtidos a partir de plantas cumarínicas e fruto do funcho (Foeniculum vulgare),
respectivamente por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e foi confirmada a
presença destes nas amostras.
5.2.5 Determinou-se a concentração de fenóis totais no extrato de cumaru,
Amburana cearensis, por espectrofotometria, e foi obtido o valor de 0,58mg/mL de
concentração que é um valor pequeno, confirmando o que observamos na
preparação do extrato que o método não esgota a droga vegetal.
5.2.6 Realizada a dosagem de cumarina no extrato de cumaru e anetol no extrato e
Funcho, através da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou
HPLC). Pode -se observar que houve pouca concentração de cumarina na amostra
por infusão já que esse método extrativo não leva ao esgotamento da droga vegetal
o contrário podemos observar no óleo essencial dos frutos do funcho, que foi obtido
através da coobação um método que levou a um maior esgotamento a droga.
27
6. REFERÊNCIAS
ANVISA, . Farmacopeia brasileira. 5 ed. Brasília: Fiocruz, 2010.
FARMACOTÉCNICO. A importância da granulometria. Disponível em:
<http://farmacotecnico.blogspot.com.br/2009/04/granulometria.html>. Acesso em: 27
jun. 2017.
CADERNO DE FARMÁCIA. Prática de análise granulométrica. Disponível em:
<http://cadernodefarmacia.blogspot.com.br/2013/04/pratica-de-analise-granulometric
a.html>. Acesso em: 27 jun. 2017.
COLLINS, C. H. & GUIMARÃES, L. F. L., Cromatografia líquida de alta eficiência.
In: Collins, C. H. & Braga, G. L.; Introdução a Métodos Cromatográficos, 3. ed., Ed.
UNICAMP, São Paulo, 1988, p 179 - 243.
CADERNO DE FARMÁCIA. Métodos extrativos para essências. Disponível em:
<http://cadernodefarmacia.blogspot.com.br/search?q=m%c3%a9todos+de+extra%c3
%a7%c3%a3o>. Acesso em: 06 jul. 2017.
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OTIMIZAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA.
Universidade Federal do Ceará. Disponível em:
http://www.repositorio.ufc.br/bitstream/riufc/13720/1/2013_tese_smararuna.pdf .
Acesso em: 07 jul. 2017.
J. R .G. S. Almeida et al.; Scientia Plena vol 6, 114601(2010), Amburana cearensis
– uma revisão química e farmacológica. Disponível em:
https://www.scientiaplena.org.br/sp/article/view/106. Acesso em: 07 jul. 2017.
ARAUJO, R. O., Investigação da atividade biológica de Foeniculum vulgare Mill
(Umbelliferae/Apiaceae) como alternativa terapêutica. Universidade Federal de
Pernambuco. Disponível em: http://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/3085.
Acesso em: 07 jul. 2017.
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FUNCHO (Foeniculum vulgare Mill.) UTILIZADOS NO PREPARO DE CHÁS.
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http://revista.univap.br/index.php/revistaunivap/article/viewFile/112/143. Acesso em:
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ARAUJO R,O.; SOUZA I.A.; SENA K.X.F.R; BRONDANI, D.J.; SOLIDÔNIO, E.G.
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29