Métodos de Estudo em Cito- Histo

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MÉTODOS DE ESTUDO EM CITO-HISTOLOGIA THAINARA BEATRIZ 
 
Métodos de Estudo em Cito-histologia
Citologia: Investigação de como as células se 
constituem, se organizam, funcionam, como se 
comunicam e controlam suas atividades. 
 
Histologia: estudo (com auxílio de microscópios) 
das células e dos tecidos do corpo e de como 
essas estruturas se organizam para constituir os 
órgãos. 
MICROSCÓPIO DE LUZ 
 
Ocular Objetiva Aumento 
10x 4x 40x 
10x 10x 100x 
10x 40x 400x 
10x 100x 1.000x 
Ampliação total: Objetiva x ocular. 
→ Resolução: menor distância entre duas 
partículas ou entre duas linhas, distância 
essa que possibilita que elas sejam vistas 
como dois objetos separados. É dado pela 
lente objetiva. 
→ No microscópio de luz é possível observar 
células vivas ou material fixado e corado. 
→ Objetos menores que 0,2 μm (como a 
membrana da célula ou um filamento de 
actina) não podem ser distinguidos com o 
microscópio de luz. 
→ O que determina a riqueza de detalhes da 
imagem é o limite de resolução de um 
sistema óptico, e não seu poder de 
aumento. O aumento só tem valor prático 
se for acompanhado de resolução. A 
resolução depende essencialmente da 
objetiva, pois a lente ocular apenas 
aumenta a imagem nela projetada pela 
objetiva. 
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO 
→ Possibilita altíssima resolução (0,3 nm). 
Essa resolução que torna possível que 
espécimes ampliados até cerca de 400 mil 
vezes sejam vistos com detalhes. 
→ É formada uma Imagem bidimensional por 
meio de feixe de elétrons que captados 
por um detector, como um negativo 
fotográfico, para se observar uma 
imagem. 
→ A imagem resultante é sempre em preto e 
branco. As áreas escuras de uma 
micrografia eletrônica costumam ser 
denominadas de elétron-densas, 
enquanto as áreas claras são chamadas 
de elétron-lucentes ou elétron-
transparentes. 
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA 
→ A microscopia eletrônica de varredura 
fornece imagens pseudotridimensionais 
(dão uma ideia de três dimensões) das 
superfícies de células, tecidos e órgãos. 
→ Nesse microscópio, um feixe de elétrons 
de diâmetro muito pequeno é focalizado 
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sobre o espécime, percorrendo 
sequencialmente, “varrendo” sua 
superfície. 
→ Os elétrons varrem uma delgada camada 
de metal previamente aplicada ao 
espécime e são refletidos pelos átomos 
do metal. Esses elétrons são capturados 
por um detector e transmitidos a 
amplificadores e outros componentes 
eletrônicos que geram um sinal, o qual 
resulta em uma imagem em preto e 
branco que pode ser observada em um 
monitor, gravada ou fotografada. 
MICRSCOPIA DE LUZ X ELETRÔNICA 
 
MÉTODOS DE ESTUDO EM HISTOLOGIA 
Técnicas histológicas: conjunto de operações 
que tem a finalidade de transformar células e 
tecidos em preparações destinadas ao exame 
microscópico 
Etapas: 
1. Colheita do tecido. 
2. Fixação: Os tecidos são imersos em 
fixadores, ou seja, soluções de agentes 
desnaturantes ou de agentes que 
estabilizem as moléculas ao formar 
pontes com moléculas adjacentes. 
Finalidade: evitar a digestão dos tecidos por 
enzimas existentes nas próprias células (autólise) 
ou em bactérias; endurecer os fragmentos; 
preservar em grande parte a estrutura e a 
composição molecular dos tecidos. 
Fixador mais usado : solução de formaldeído 
a 4% ou glutaraldeído. 
3. Desidratação: A água contida nos tecidos 
é inicialmente extraída pela passagem dos 
fragmentos por diversos banhos de 
soluções de concentrações crescentes de 
etanol (normalmente desde etanol 70% em 
água até etanol 100%). 
4. Clarificação: etanol dos fragmentos é 
substituído por uma substância 
intermediária (xilol e o toluol), que deve ser 
miscível tanto em etanol como no meio que 
foi escolhido para inclusão. Depois de 
embebidos no solvente orgânico, eles 
ficam transparentes ou translúcidos. 
5. Impregnação: os fragmentos de tecidos 
são colocados em parafina derretida (56 a 
60°C). O calor causa a evaporação do 
solvente orgânico, e os espaços existentes 
dentro dos tecidos tornam-se preenchidos 
com parafina. 
6. Inclusão: meio apropriado para cortes 
finos (parafina, resina plástica). O meio 
penetra nos tecidos, dando-lhes, depois de 
solidificado, certa dureza. 
7. Microtomia: Os blocos de parafina que 
contêm os tecidos são então levados a um 
micrótomo, onde são seccionados por uma 
lâmina de aço ou de vidro, de modo a 
fornecer cortes de 1 a 10 micrômetros de 
espessura. 
8. Coloração: A maioria dos tecidos 
extraídos para serem utilizados em cortes 
histológicos são incolores, portanto, para 
melhor visualização utilizam-se corantes. 
a. Desparafinar: colocar as lâminas 
em estufa e xilol 
b. Hidratar: 
c. Corar: Os componentes dos 
tecidos que se coram bem com 
corantes ácidos são denominados 
acidófilos. E os que se coram bem 
com corantes básicos, basófilos. 
 
Ex de corantes básicos: azul de toluidina, azul de 
metileno. Hematoxilina também se comporta como 
corante básico, ou seja, possui afinidade por 
estruturas que contém ácidos em sua composição 
(ácidos nucleicos, glicosaminoglicanos, 
glicoproteínas ácidas). 
Ex de corantes ácidos: Orange G, eosina, 
fucsina ácida. Possuem afinidade por estruturas 
predominantemente básicas: mitocôndrias, 
grânulos de secreção, proteínas citoplasmáticas e 
colágeno. 
 
Os mais comuns são hematoxilina (básico, cora 
em azul ou violeta o núcleo das células) e eosina 
(ácido, cora o citoplasma em cor de rosa). 
 
d. Desidratar: preparação para 
penetração do xilol 
e. Diafanizar: dar transparência 
(clarificar) 
9. Montar: proteção 
10. Analisar 
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PLANOS DE CORTE EM MICROTOMIA 
Quando um corte é observado ao microscópio, 
observador sempre deve imaginar que algo pode 
estar faltando à frente ou atrás daquele corte, uma 
vez que muitas estruturas são mais espessas que 
o corte. Além disso, deve lembrar-se também de 
que os componentes de um tecido ou órgão são 
geralmente seccionados ao acaso. 
Para entender a arquitetura de um órgão, é 
necessário estudar secções feitas em planos 
diferentes. Às vezes, somente a análise de 
secções consecutivas e a sua reconstrução em 
um volume tridimensional tornam possível 
compreender a organização de um órgão 
complexo. 
INTESTINO EM DIFERENTES TIPOS DE CORTES: 
ARTEFATOS DE TÉCNICA 
1. Dentes na navalha (que cortou o bloco de 
parafina no momento de fazer a lâmina) 
2. Dobras e pregas 
3. Bolhas 
4. Retração 
5. Precipitados (manchas que não deviriam 
estar ali) 
METODOS HISTOQUÍMICOS DE COLORAÇÃO 
TÉCNICA PAS (PERIODIC ACID SCHIFF):PARA 
POLISSACARÍDEOS 
 Técnica específica para detectar radicais 
vic-glicois presentes em moléculas de glicogênio, 
em glicoproteínas neutras e em glicoproteínas 
ácidas. 
 Reações PAS-positiva: cor bonina ou rosa 
choque 
Etapas do método: 
- Oxidação dos radicais glicóis com ácido 
periódico liberando aldeídos. 
- Tratamento dos aldeídos com reativo de 
Schiff. 
 
Radical glicol (presente nos açúcares) + 
ácido periódico = aldeído + reagente de Schiff = 
coloração dos polissacarídeos 
PAS +: 
→ Glicogênio (fígado, músculo) 
→ Glicoproteínas neutras (produto de 
secreção de células caliciformes) 
TÉCNICA FEULGEN: 
Espeficidade: DNA 
Reações de feulgen-positiva: cor bonina 
ou rosa choque 
Etapas do método: 
- Hidrólise do DNA com ácido clorídrico a 
60°C para liberação de aldeídos. 
- Tratamento dos aldeídos com reativo de 
Schiff. 
 
1° DNA + HCL quente → aldeído 
2° Aldeído + reativo de Schiff (incolor) → DNA 
(bonina) 
IMUNOHISTOQUÍMICA 
 
É a metodologia que possibilita identificar, por 
meio de anticorpos, moléculas em cortes ou em 
células cultivadas. Já que há um tipo de interação 
altamente específica entre uma molécula e um 
anticorpo que a reconhece. Por essa razão, 
métodos que usam anticorpos são de grande 
utilidade para identificar e localizarproteínas e 
glicoproteínas. 
MÉTODOS DE ESTUDO EM CITO-HISTOLOGIA THAINARA BEATRIZ 
 
Em uma reação imunocitoquímica, células em 
cultura ou um corte de tecido que supostamente 
contenham uma determinada proteína são 
incubados em uma solução que contém um 
anticorpo que reconhece essa proteína. Como o 
anticorpo não é visível por microscopia, suas 
moléculas devem ser inicialmente acopladas a um 
marcador. O anticorpo se liga especificamente à 
proteína e sua localização pode então ser 
evidenciada por microscopia de luz ou eletrônica, 
dependendo do marcador que foi acoplado ao 
anticorpo.