Immobilization of Enzymes by Covalent Attachment

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Immobilization of Enzymes by Covalent Attachment
Scott J. Novick and J. David Rozzell
Introdução
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11/26/2019
	Enzimas estão encontrando uso crescente para a produção de agroquímicos, produtos farmacêuticos e produtos químicos finos. 
	Elas são quase sempre utilizados na forma imobilizada, a fim de simplificar a sua remoção do fluxo de produto. Além disso, a imobilização muitas vezes aumenta a estabilidade da enzima. 
	A imobilização pode ser realizada de várias maneiras. Este capítulo discute vários métodos, propriedades e usos de enzimas imobilizadas covalentemente. 	
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Introdução
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	Uma enzima imobilizada é geralmente definida como “o encarceramento de uma
enzima em uma fase distinta que permite uma troca com, mas é separada
de, a fase em massa, em que as moléculas efetoras de substrato ou inibidoras são
dispersas e monitoradas”.
	A tecnologia de enzimas imobilizadas remonta à década de 1910 à década de 1930, quando as proteínas eram fisicamente adsordas em superfícies como carvão, kaolinita, celulose e esferas de vidro.
	 O primeiro uso industrial de enzimas imobilizadas foi para a produção de aminoácidos. Chibata e colegas de trabalho em Tanabe Seiyaku (Japão) em 1969 usaram um L-aminoacylase imobilizada em um reator de leito empacotado para resolver vários dl-aminoácidos em suas formas enantiômericas puras. E desde então, as enzimas vem sido utilizadas para produção de compostos quirais importantes para as indústrias farmacêuticas e de químicos finos.
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1. Prevenção de proteólise ou agregação por fixação espacial de moléculas enzimáticas no suporte.
2. O desdobramento da enzima é reduzido devido a ligações covalentes multiponto ou adsorptivas ao suporte, e/ou crosslinking intramolecular da enzima.
3. As enzimas multiméricas teriam uma probabilidade mais baixa dissociar-se se todas as subunidades estiverem anexadas ao suporte.
4. Agentes de desnaturação (por exemplo, inativadores químicos) podem ser excluídos da enzima pelo suporte ou inativados pelo suporte antes de atingir a enzima (por exemplo,
decomposição do peróxido de hidrogênio, produzida durante a oxidação da glicose pela glicose oxidase, catalisada por carbono ativado).
5. Mudança por um suporte carregado do pH local, impedindo assim a inativação de pH da enzima.
6. Exclusão pelo suporte (por exemplo, uma membrana de encapsulamento) de proteases do ambiente da enzima.
7. Aumento da estabilidade térmica devido a ligação multiponto da enzima ao suporte.
Tabela 1 – efeitos de estabilização que a imobilização causa a enzimas 
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	A principal vantagem das enzimas imobilizadas é reter o catalisador no reator. Isso pode melhorar muito a economia de um processo. Para um processo contínuo, uma enzima solúvel seria lavada para fora do reator junto com o fluxo de produto. Um processo como este não seria economicamente viável se o biocatalisador fosse muito caro (como é frequentemente o caso) e não poderia ser reutilizado.
	Este capítulo se detém em apresentar a técnica de imobilização covalente mais a fundo, citando outros quatro métodos que são também utilizados e suas principais desvantagens nesse meio.
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	Um dos métodos de imobilização mais simples e econômicos é adsorver uma enzima em um suporte. A enzima é ligada ao suporte através de interações iônicas ou não-iônicas. Os suportes geralmente incluem resinas à base de carboidratos ou polímeros sintéticos trocadores de íons ou suportes não carregados, como polímeros, vidro e cerâmica. A principal desvantagem deste método é a lixiviação da enzima a partir do suporte.
	 Cross-linking de enzimas consigo mesmas, ou mais frequentemente com uma proteína inerte, como gelatina ou albumina de soro bovina, resultam em uma preparação insolúvel de enzimas ativas que pode ser facilmente manuseada ou manipulada em um reator contínuo. Glutaraldeído, diisocianatos são frequentemente usados nesse método. A inativação significativa da enzima pode resultar durante a etapa de cross-linking e é a principal desvantagem deste método.
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	Aprisionamento de uma enzima dentro de uma matriz polimérica é outro método usado para imobilização enzimática. Isso é muitas vezes feito misturando a enzima com um monômero e um cross-linker, e polimerizando o monômero em torno da enzima. A lixiviação da enzima fora da matriz e as limitações de transferência de massa do substrato que se difundem na matriz podem limitar o uso dessa técnica.
	Encapsular ou confinar uma enzima dentro de uma membrana é outro método para a imobilização enzimática. Membranas de ultrafiltração ou fibras ocas feitas de polietersulfano, nitrato de celulose ou acetato, ou nylon são frequentemente usadas. O tamanho dos poros deve ser devidamente escolhido para permitir que o substrato e o produto entrem e saiam da membrana enquanto ainda mantêm a enzima. Desde que a enzima exista em sua forma solúvel, a atividade é geralmente elevada. Entupimento de membrana e taxas de fluxo reduzidas são desvantagens desta técnica.
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Enzymes contain a number of functional groups capable of covalently binding to supports. Table 2 lists these groups along with their relative frequency
in a typical protein (19–21). Of the functional groups of enzymes listed, –NH2, –CO2H, and –SH are most frequently involved in covalent immobilization.
Amines and sulfhydryls are good nucleophiles, while the ability to activate carboxylates so they are reactive toward nucleophiles makes these
groups important as well.
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	Os suportes aos quais as enzimas são ligadas podem variar muito. Eles podem ser polímeros naturais, como celulose modificada, amido, dextran, polisacarídeos agal, colágeno e gelatina; ou podem ser sintéticos, como poliestireno, poliacrilamida, poliacrilatos, metacrilatos hidroxialkyl e poliamidas. Suportes inorgânicos também podem ser usados, como vidro poroso, óxidos metálicos, metais, areia, carvão e cerâmica porosa. Tal variedade pode garantir a condição de ligação ser apropriada para qualquer sistema enzimático.
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Anexo covalente à suportes polihidroxila
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	 Os suportes de polihidroxila, como vidro poroso, e especialmente polissacarídeos estão entre as matrizes mais comumente usadas para imobilização de enzimas.
	Pelos grupos de hidroxil dificilmente deixarem o substrato, estes devem primeiro ser ativados.
	Isso normalmente é feito com brometo de cianogênio. Outros agentes ativadores, como derivados de S-triazine, também foram usados. Uma vez que o suporte é ativado é capaz de parear covalentemente à uma enzima geralmente através do grupo ε-amino de lisina ou através do terminal amino.
	 O mecanismo de derivatização de suportes polihidroxilas com os dois agentes derivativos acima e a subsequente imobilização enzimática é mostrada na Fig. 1.
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Anexo covalente à suportes polihidroxila
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O mecanismo de derivatização de suportes polihidroxilas com os dois agentes derivativos acima e a subsequente imobilização enzimática é mostrada na Fig. 1.
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Anexo covalente em suportes portando ácido carboxílico
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	Suportes contendo ácido carboxílico, como copolímeros de ácidos (meta)acrílicos com ésteres (meta)acrílicos também têm sido usados como suporte de imobilização.
	Estes também devem ser ativados e isso geralmente é feito com um reagente carbodiimidio. condições ligeiramente ácidas (pH 4.75-5.0) os carbodiimidios reagem com grupos carboxilico do ácido para dar os derivados altamente reativos do O-acylisourea.
	Os suportes são então lavados para remover o excesso de reagente e a enzima é acoplada ao suporte ativado em pH neutro para dar amido, thioester, ou ligações ester estáveis, dependendo do resíduo reagindo com o suporte.
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Anexo covalente em suportes portando ácido carboxílico
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Anexo covalente em suportes portando amina
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	Os suportes com aminas estão entre os suportes mais utilizados e os mais úteis para a imobilizaçãode enzimas covalentes. Esses suportes podem ser suportes orgânicos ou inorgânicos com funcionalidade de amina. A técnica mais frequente para a introdução de grupos de amina em suportes inorgânicos é através de fixação aminosilano, existindo diversas outras técnicas hoje como por partículas cobertas de polietilenoimina, partículas minerais ou carbônicas cobertas com quitosano.
	 O acoplamento de uma enzima para suportes de amina pode ser feito de várias maneiras. A maneira mais comum é através do uso de reagentes funcionais, como ésteres diimidato, diisocianatos, glutaraldeído e dialdeídos..
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Anexo covalente em suportes portando amina
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	Os suportes com aminas estão entre os suportes mais utilizados e os mais úteis para a imobilização de enzimas covalentes. Esses suportes podem ser suportes orgânicos ou inorgânicos com funcionalidade de amina. A técnica mais frequente para a introdução de grupos de amina em suportes inorgânicos é através de fixação aminosilano, existindo diversas outras técnicas hoje como por partículas cobertas de polietilenoimina, partículas minerais ou carbônicas cobertas com quitosano.
	 O acoplamento de uma enzima para suportes de amina pode ser feito de várias maneiras. A maneira mais comum é através do uso de reagentes funcionais, como ésteres diimidato, diisocianatos, glutaraldeído e dialdeídos..
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Anexo covalente em suportes portando amina
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Ensaiando as propriedades das enzimas imobilizadas
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	Existem três propriedades importantes de enzimas imobilizadas que são frequentemente avaliadas: atividade, carregamento enzimático e estabilidade. Antes da medição dessas propriedades, os materiais enzimáticos imobilizados devem ser lavados extensivamente para remover qualquer enzima não vinculada que possa ser aprisionada nos poros das partículas ou livremente ligada através de interações não covalentes.
	
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Ensaio de atividade
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	Existem dois métodos básicos para medir a atividade em batelada e contínua. No método por lote, adiciona-se a enzima imobilizada a um frasco e adiciona-se a solução de substrato para iniciar a reação.
	 Em vários pontos de tempo, uma alíquota da mistura é removida e filtrada (o que é mais facilmente feito através de um filtro de seringa) para remover qualquer uma das partículas enzimáticas imobilizadas e para extinguir a reação.
	Esta alíquota pode então ser analisada utilizando o método analítico adequado,
tais como cromatografia líquida, cromatografia gasosa ou espectrofotometria. 
Se o produto continua a ser produzido nesta alíquota após filtração, é uma boa indicação
que pode haver lixiviação significativa da enzima solúvel fora do suporte.
	Isto pode ocorrer se o suporte não for suficientemente lavado após a imobilização ou se a ligação for instável nas condições do ensaio. Para obter medições de atividade mais precisas, os suportes devem ser relavados..
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Determinação da carga de proteínas em materiais enzimáticos covalentemente imobilizados
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	A medição pode ser feita indiretamente ou diretamente nas próprias partículas.
	No método indireto, a quantidade inicial de proteína oferecida ao suporte é determinada usando qualquer uma das variedades de ensaios de proteína disponíveis. Após a imobilização completa e a lavagem das partículas, efetua-se o mesmo ensaio de proteínas no sobrenadante e nas soluções de lavagem. A diferença na massa da enzima oferecida e na quantidade no sobrenadante de imobilização e nas soluções de lavagem dará a quantidade de enzima ligada ao suporte.
It is often useful to have information on how much enzyme is bound to the support after an immobilization was performed. 
This information is needed when optimizing the immobilization conditions or when calculating the residual enzyme activity. 
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Determinação da carga de proteínas em materiais enzimáticos covalentemente imobilizados
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	No método direto, determina-se a quantidade de enzima efetivamente ligada ao suporte. 
	Foram publicados vários métodos para determinar isso. Num método utiliza-se o doseamento da proteína do ácido bicinchonínico (BCA) . Neste ensaio, a enzima imobilizada é incubada na solução de ensaio BCA. A enzima ligada ao suporte reage com a solução BCA da mesma forma que uma enzima solúvel, reduzindo o Cu2+ para o Cu1+ na presença de ligações peptídicas, que se tornam complexas com o ácido bicinchonínico para formar uma solução aquosa de cor púrpura. A absorvância desta solução será proporcional à quantidade de enzima imobilizada. A albumina sérica bovina (BSA) é frequentemente utilizada como padrão proteico para quantificar a quantidade de enzima ligada ao suporte por absorbância.
Outros métodos: corante para proteínas que no fim é eluído e testado a absorbância por espectofotometria e comparando com a curva de BSA
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Determinação da estabilidade das enzimas covalentemente imobilizadas
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	A estabilidade das enzimas imobilizadas pode ser medida de várias maneiras. A maneira mais simples é colocar a enzima imobilizada num reactor contínuo tal como uma coluna (reator de fluxo laminar) ou um reator de mistura (reator de tanque agitado contínuo). 
	O substrato é então bombeado através do reator e o efluente é analisado para a concentração do produto e/ou substrato.
	Dependendo da estabilidade da enzima, esta é permitida durante dias ou mesmo meses e a diminuição da concentração do produto ou o aumento da concentração do substrato de saída é monitorizada para determinar o tempo de vida útil da enzima imobilizada. É importante escolher a quantidade adequada de enzima imobilizada e taxa de fluxo de tal forma que se obtenha menos de 100% de conversão, já que uma inibição significativa poderia ocorrer sem deixar vestígios. Também pode-se submeter o reator com vários cosolventes, pH, temperaturas para determinar a estabilidade da enzima nessas condições.
Pode-se também determinar isso através de bateladas.
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Utilizações industriais de enzimas covalentemente imobilizadas
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	Um grande número de enzimas são usadas na indústria para a síntese de uma ampla gama de compostos. A maior parte destas aplicações pode ser colocada quer na indústria alimentar (tanto para consumo humano como animal) quer na indústria farmacêutica/química fina.
	O maior uso de enzimas imobilizadas é para a isomerização da glicose, do milho, para a frutose que é muito mais doce. O xarope de milho com alta frutose (HFC) resultante é usado como um adoçante em uma variedade de alimentos, especialmente bebidas adoçadas e produtos cozidos.
	Outro grande uso de enzimas imobilizadas está na síntese de penicilinas semi-sintéticas. A produção mundial destes antibióticos β-lactâmicos semi-sintéticos é superior a 20 mil toneladas por ano. Utilizando a penicilina amidase de E. coli e B. megaterium, imobilizada em Eupergit C.
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Utilizações industriais de enzimas covalentemente imobilizadas
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	Os L-aminoácidos são produzidos em grandes quantidades para consumo humano sob a forma de suplementos, ingredientes em adoçantes artificiais, intermediários na síntese de produtos farmacêuticos e como aditivos na alimentação animal. Foram utilizadas enzimas covalentemente imobilizadas para produzir l-aspartase, um ingrediente principal do adoçante artificial aspartame. Este aminoácido pode ser sintetizado a partir de dois materiais de base baratos, ácido fumárico e amônia apartir da enzima L-aspartato amônia liase (fig. 6).
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Conclusão
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	 Imobilização covalente de enzimas representa um método robusto para a fixação de enzimas a Suportes insolúveis. Uma variedade de suportes estão disponíveis, incluindo polímeros orgânicos sintéticos e naturais e minerais inorgânicos, metal
óxidos e óculos. 
	A química e os grupos funcionais usados para ligar enzimas aos suportes podem variar muito e podem ser adaptados dependendo da aplicação específica. Além da facilidade de recuperação enzimática, a estabilidade desta é geralmente muito mais elevada do que aenzima solúvel e, portanto, pode ser reutilizada várias vezes. 
	Um número crescente de enzimas está se tornando comercialmente disponível na forma imobilizada, incluindo lipases, proteases, nitrilases, aminoácidos desidrogenases, oxidoredutases, e outros. 
	Aplicações de enzimas covalentemente imobilizadas foram demonstradas a partir da escala lab para a produção industrial de quantidades multitoneladas.
	Este é um campo vibrante que continua a evoluir até hoje.
Mostrar agora os materiais e métodos introduzidos no trabalho. Pag 276 do arquivo (263 livro).
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Obrigado