01 Aula 1 - Estrutura dos ácidos nucleicos

Prévia do material em texto

01 Aula 1 - Estrutura dos ácidos nucleico
s 1 e 2
Referência:  
Zaha,Arnaldo;Ferreira,HenriqueBunselmeyer;Passaglia,LucianeMariaPereira.BiologiaMolecularBásica.Porto
Alegre:Artmed, 2014.ISBN9788582710579.
Histórico
Conceitos básicos:
DNA - ácido desoxirribonucleico 
Descoberta do DNA: 1869 por Friedrich Miescher
DNA como molécula responsável por conter e transmitir a informação 
genética (Avery, Macleod e McCarty, 1944)
1950, Erwin Chargaff, ao analisar o DNA de diferentes organismos, mostrou 
que a proporção das bases pirimidinas e purinas era de 1:1 e que a 
quantidade de guanina era igual a de citosina e que a de adenina era igual a 
de timina 
Comprovação de que o DNA era o material genético - 1952, Hershey e Chase
Proposta da estrutura de hélice dupla do DNA - 1953 Watson e Crick. Com 
importante participação de Rosalind Franklin e Maurice Wilkins.
a estrutura dos ácidos nucleicos está relacionada à sua função;
polímeros de nucleotídeos, cuja função determina suas características 
químicas;
Composição química:
polímero composto por unidades de desoxirribonucleotídeos;
é uma molécula muito longa - um único cromossomo humano é em torno 
de 280 vezes mais longo que uma célula;
são compostos por: uma base nitrogenada e um grupamento fosfato 
(PO4-) -> o açúcar é a pentose desoxirribose (2'-desoxi-D-ribose), que 
está ligada pelo carbono 1' a uma base nitrogenada heterocíclica e pelo 
carbono 5' a grupamentos fosfato;
as bases nitrogenadas podem ser de dois tipos: 
púricas - derivadas das purinas, que são Adenina e Guanina ou
pirimídicas - derivadas das pirimidinas, que são a Citosina e a Timina;
a ligação entre a base nitrogenada e a pentose é a LIGAÇÃO 
GLICOSÍDICA;
Nucleosídeo - molécula gerada da ligação entre base nitrogenada e o 
açúcar;
Nucleotídeo - quando um grupamento fosfato está ligado ao carbono 5' 
da pentose;
O nucleotídeo pode ser mono, di ou tri-fosfatado - o primeiro fosfato 
ligado a ele é o alfa, o segundo é o beta e o terceiro, gama. 
O DNA sempre vai ter nucleotídeos mono e os precursores para a 
síntese sempre são tri;
Os desoxirribonucleotídeos formam cadeias - ligações covalentes, 
formando pontes fosfodiéster -> isso confere às cadeias 
polinucleotídicas a direcionalidade;
O primeiro nucleotídeo da cadeia terá uma extremidade 5' com um 
grupamento fosfato e o último nucleotídeo na extremidade 3' terá 
um grupamento hidroxílico;
cadeias polinucleotídicas tem orientação 5'->3';
Hélice dupla 
Estrutura:
Capacidade de autorreplicação;
Hélice dupla, suas duas fitas se enrolam em torno do eixo da hélice;
as desoxirriboses ficam externas em relação às bases nitrogenadas, 
como se fossem um corrimão de uma escada circular, expostos ao 
meio aquoso;
as ligações fosfodiéster nas duas fitas estão em direções opostas, 
uma fica 5'->3' e a outra 3'->5' -> antiparalelas;
o pareamento das bases é fundamental para a manutenção da hélice 
dupla;
Cada base nitrogenada de uma das cadeias está pareada (pontes de 
H) com a base complementas na outra cadeia de DNA;
T ou U pareiam com A, por ponte de H; 2 pontes;
C e G podem formar 3 pontes;
complementaridade -> sempre que existir um A em uma fita, vai 
ter um T pareado...
Pirimídicas são menores do que as púricas;
relação molar A/T e C/G sempre é igual a 1, embora a concentração 
molar varie;
as pontes de H de CG são mais fortes e precisam de mais energia 
para serem rompidas;
existem raros eventos onde outros pareamentos podem ocorrer, 
como o Hoogsteen, que ocorre em fitas triplas (GA, CA e TG);
Cavidade maior e menor: as ligações glicosídicas entre as 
desoxirriboses e as bases, não são diretamente opostas na hélice 
dupla, gerando duas cavidades desiguais em seu contorno (fig 2.4) 
nessas cavidades, principlamente na maior, as bases estão 
expostas ao meio solvente e são quimicamente distinguíveis; 
Além das lig covalentes, outras forças mais fracas atual, 
estabilizando a dupla hélice:
Efeitos hidrofóbicos: estabilizam o pareamento entre as bases. 
Os anéis das purinas e das pirimidinas que estão voltados para o 
interior da hélice, são mantidos por coesão interna de H2O, e os 
sítios hidrofílicos das bases ficam expostos ao solvente nas 
cavidades.
Empilhamento das bases no interior da hélce permite o 
estabelecimento de forças de Van der Walls entre os anéis 
aromáticos de bases adjacentes. São fracas, mas ajudam na 
manutenção da estrutura final.
Cadeias de açúcar-fosfato interagem com cátions em solução, 
neutralizando a repulsão entre as duas cadeias e estabilizando a 
hélice.
Implicações da estrutura do DNA nas funções biológicas:
Replicação, transcrição e tradução: o DNA serve de molde para a sua 
duplicação, para síntese dos RNAs e os mRNAs servem de molde para a 
síntese de proteínas
Propriedades químicas:
Mais importantes são: complementaridade entre as bases nitrogenadas 
das duas cadeias, o antiparalelismo, que confere direcionalidade às 
cadeias e a capacidade de desnaturação e renaturação da hélice 
dupla. 
a DESNATURAÇÃO (ou fusão) ocorre quando as pontes de H entre as 
cadeias complementares do DNA são rompidas e as fitas se separam. O 
processo inverso (restabelecimento das pontes de H entre as bases 
complementares) é a RENATURAÇÃO.
Sempre que o DNA é replicado, transcrito ou realiza recombinação, as 
cadeias são desnaturadas e renaturadas. -> Após a renaturação, todas 
as propriedades originais da hélice são restabelecidas.
é possível desnaturar DNA in vitro;
A desnaturação/renaturação do DNA pode ser acompanhada pelo 
espectofotômetro (ABS): 
Quando as fitas estão separadas, a absorção de luz é maior do que 
quando estão juntas. 
Quando elas se separam completamente, após aumento de temperatura, 
há o efeito hipercrômico (atinge o valor máximo de abs);
A temperatura em que 50% do DNA tá desnaturado é a temperatura 
média de fusão (Tm);
a renaturação pode ser acompanhada assim tbm, se resfriar o meio, a 
abs diminuiu, pois as hélices estão se juntando;
Mesmo que estejam 100% separadas, as cadeias podem se reunir -> 
anelamento ou hibridização -> 25 graus C abaixo da Tm.
A Tm de um DNA depende da quantidade de AT ou CG, uma vez que a 
quantidade de pontes de H é diferente; - quanto mais CG, maior o Tm;
Tem como calcular o valor de AT ou CG pelo Tm: Tm (ºC) = 69,3 + 0,41 
(GC%) e AT% = 1 - (GC%)
Tem como calcular o tamanho de um genoma utilizando medidas da 
renaturação do DNA. A velocidade de renaturação do genoma depende 
do seu tamanho: 
C = concentração de sita simples em um tempo t; C0 = concentração de 
fita simples em um tempo zero; K2 é uma constante; t é tempo.
O tamanho de um determinado genoma pode ser definindo comparando 
o seu C0.t1/2 com o de um DNA padrão com tamanho conhecido, como 
o cromossomo da bactéria E. coli (4,2x10^6pb)
O reanelamento (renaturação) do DNA tbm pode ser empregado na 
identificação de sequências de interesse.
Topoisomerases 
são enzimas que catalisam a interconversão de topoisômeros de DNA -> 
permitem alterações no grau de superenrolamento;
promovem quebra transitória de ligações fosfodiéster da fita de DNA -> 
introduzem ou removem superenrolamentos no DNA e resolvem 
estruturas, como os nós e os concatâmeros, geradas nos processos 
celulares;
essenciais para os processos de replicação do DNA, transição e 
recombinação e no remodelamento da cromatina.
Como atuam na replicação e transcrição? removem supertorções 
positivas que normalmente se formam na frente da forquilha de 
replicação;
Estratégias ferais para a alteração da topologia do DNA pelas 
topoisomerases: 
Mecanismo de rotação: a topoisomerase cliva a ligação 
fosfodiéster de uma das cadeias do DNA e permite que uma das 
extremidades da cadeia aberta gire em torno da hélice -> a cadeia 
clivada é religada e a molécula de DNA resultante fica com 
superenrolamento diferente do inicial (topoisomerases da familia 
tipo I);
Clivagem de uma ou das duascadeias de DNA da hélice dupla, 
causando o rompimento de algumas pontes de H entre as bases 
adjacentes, sguida da passagem de uma segunda hélice dupla pela 
região clivada (familia tipo II);
existem muitas subfamílias de cada uma das duas famílias de 
topoisomerases; 
Subfamílias da tipo I -> IA, IB, IC 
Tipo II -> IIA  IIB; 
Tipos de DNA
existem, em condições fisiológicas, o DNA tipo B, A e Z;
o que diferencia eles é a espessura, número de pares de base por volta 
da hélice e a exposição das bases nitrogenadas ao meio externo;
tipo B é o fisiológico e mais encontrado nas células;
tipo A ocorre em condições de umidade muito baixa e quando fitas 
mistas de DNA-RNA e fitas duplas de RNA são formadas;
tipo Z ocorre em regiões curtas do DNA, onde existem sequências de 
citosinas e guaninas seguidas.
tipo B
apresenta forma de hélice dupla - ocorre com umidade relativa 
elevada (92%) e em soluções de baixa força iônica;
hélice dupla gira para a direita e a rotação entre os dois pares de 
bases adjacentes é de 34,6 graus - uma volta completa se da a cada 
10,4pb;
uma volta da hélice percorre uma distância de 3,40 nm, que é o 
passo da hélice - cada par de bases adiciona à hélice uma distância 
de 0,33 nm;
o diâmetro da hélice dupla é de 2,37nm.
tanto no B como no A, a desoxirribose e a base nitrogenada estão em 
lados opostos da ligação glicosídica - conformação anti
DNA Z - na presença de altas concentrações de cátions, alguns 
nucleotídeos assumem a conformação syn, ficando açúcar e a base do 
mesmo lado da ligação glicosídica;
a hélice dupla é enrolada à esquerda e alterna as conformações syn 
e anti, sendo comum em sequências onde G e C se alternam;
pirimidinas conservam a conformação padrão anti, e as purinas 
estão em syn;
é mais longo e fino que o B;
uma volta completa se da a cada 12pb, o passo da hélice aumenta 
para 4,56nm, com 1,84nm de diametro;
a cavidade maior desaparece e a menor se torna muito profunda, 
formando uma espiram em torno da estrutura; 
fatores que determinam a possibilidade de ocorrer regiões de DNA 
tipo Z: sequência de nucleotídeos e estrutura global da hélicedupla - 
parece ocorrer em regiões do genoma que estão sendo ativamente 
transcritas;
pode ter importância na regulação da expressão gênica e estar 
envolvido em eventos de processamento de DNA e em instabilidade 
genética 
Outras estruturas do DNA
CURVATURA
sequências menores de 100pb são relativamente rígidas para serem 
curvadas;
algumas proteínas tornam regiões do DNA mais sucetíveis à 
curvatura e essas regiões são importantes em sequências 
envolvidas com o controle de processos como a replicação, 
transcrição e recombinação;
sequencias de DNA com regiões de adenina têm curvatura facilitada;
RNA - ácido ribonucléico
proteínas que promovem curvatura do DNA: histonas, fatores de 
transcrição, enzimas de recombinação, enzimas que modificam o 
DNA, entre outras; 
FUNÇÕES DA CURVATURA:
condensar e empacotar o DNA (como nos nucleossomos);
expor a sequência de bases internalizada na hélice dupla;
aproximar sítios de ligação distantes no DNA linear;
formar estruturas especiais proteína-DNA para alinhar 
determinados sítios, como no caso de recombinação sítio-
específica;
forçar a molécula de DNA para estimular a clivagem ou a 
desnaturação.
ESTRUTURAS CRUCIFORMES:
existem seq de DNA que possuem simetria, com regiões repetidas e 
invertidas, ex 
ATTCGCGTAGTAGACATAGCTGACATAGTCAGCTATGTCTGCTC
essas seq podem formar estruturas onde o pareamento entre as 
duas fitas é substituído pelo pareamento entre as bases 
complementares na mesma fita
isso reduz o número de voltas da hélice dupla na região, removendo 
o grau de superenrolamento negativo, em uma unidade para cada 10 
bases de pareamento;
ocorre in vivo e são fundamentais para alguns processos;
JUNÇÕES DE HOLLIDAY
estruturas formadas por 4 fitas de DNA - importantes intermediárias 
na recombinação genética;
proteínas e enzimas específicas reconhecem essas estruturas e 
determinam como serão clivadas;
uma molécula linear de RNA pode, em sua seq de bases, armazenar info 
genética; realizar pareamento interno, formando uma estrutura secundária, 
expondo ou escondendo algumas estruturas para interagir com outras 
moléculas; pode assumir uma conformação espacial, estrutura terciária, 
contendo superfícies que podem interagir com outras moléculas ou regiões 
internas que possam criar sítios de ligação com metais; promover catálise;
Composição química:
polímero linear de subunidades de nucleotídeos ligadas entre si por 
ligações fosfodiéster 5'->3';
açúcar - ribose;
timina é substituída pela uracila - composto então por A,C,G,U;
é predominantemente de cadeia simples, mas forma regiões de cadeia 
dupla por pareamentos internos;
mais reativo que o DNA - o DNA é estável na presença de álcali, pois 
apesar das fitas serem desnaturadas com o rompimento das pontes de 
H, as lig fosfodiéster nas cadeias permanecem inalteradas, já o RNA é 
hidrolisado na presença de álcali, originando uma mistura de 
nucleosídeos monofosfatados 2' e 3'.
Estrutura secundária:
pareamentos CG e AU ocorrem entre regiões complementares da 
mesma molécula de RNA ou, menos frequente, entre moléculas distintas;
quando ocorre paremento entre duas sequêncisa, sua conformação fica 
parecida com o DNA tipo A;
Classes de RNA
existem várias na célula com funções específicas;
principais tipos na célula e envolvidos diretamente na síntese de 
proteínas (RNAs de manutenção do metabolismo celular básico 
housekeeping):
mRNA - RNA mensageiro - transfere a info genética do DNA aos 
ribossomos (onde ocorre a síntese proteica). 1 a 5% do RNA total da 
célula;
rRNA - RNA ribossômico - forma fitas duplas por pareamentos 
internos. 75%
tRNA - RNA transportador - transporta os resíduos de aminoácidos 
até os ribossomos para síntese de proteínas. 10 a 15%
RNAS CODIFICADORES - aqueles q têm info genética para a síntese de 
proteínas (mRNA) o resto é denominado NAO CODIFICADOR;
em procariotos, foram descritas mais duas classes de não codificadores: 
sRNAs (small) e os CRISP RNAs (de clustered regulatory interspaced 
shor palindromic repeats); 
os sRNAs são pequenos (entre 100 e 200 nt) e podem parear com 
mRNAs específicos, podem se ligar com proteínas e regular a 
expressão de alguns genes por alteração da estabilidade do mRNA 
ou por modulação da tradução;
os CRISO RNAs têm sequências homólogas com genomas de 
bacteriófagos e plasmídeos e interferem com a infecção por 
bacteriófagos e com a conjugação de plasmídeos;
nos eucariotos, ainda são encontrados entre os não codificadores: 
snRNAS (small nuclear/nucleares pequenos), scRNAS (small 
sytoplasmic/citoplasmáticos pequenos) e snoRNAs (small nucleolar/ 
nucleolares pequenos);
as demais classes de RNA nos eucariotos estão envolvidas com 
expressão de genes, são ncRNA (non-coding, não codificadores), que 
podem ser curtos ou longos:
CURTOS: miRNAs (micro); siRNA ou iRNA (small interfering /de 
interferência pequenos); e piRNAs; -> eles se ligam a duas classes 
de proteínas: Argonautas (mi e siRNA) e proteínas PIWI (piRNA);
os miRNAs e os siRNAS estão em todas as células eucarióticas e 
os piRNAs apenas em células germinativas de animais;
LONGOS: lncRNA (long non-coding) são enconrados no núcleo e 
citoplasma, em geral, transcritos e tendo funções regulatórias ainda 
não totalmente elucidadas.