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DETERMINAÇÃO DE FIBRA BRUTA 
METODO GRAVIMÉTRICOO
I. INTRODUÇÃO
As fibras dos vegetais são constituidas principalmente por celulose, hemiceluloses e lignina, componentes estes encontrados em altas concentraçoes na parede celular das plantas.
Em termos analiticos, denomina-se fibra bruta, a fibra de celulose associada a porçoes variaveis dos demais componentes citados acima, não extraidos por ácidos e bases diluidos e a quente.
A celulose e o principal componente da parede celular e o composto de carbono mais abundante na natureza. É encontrada em forma mais pura nas fibras de algodao submetido a cuidadoso tratamento de purificação. O material obtido por esse processo serve como celulose-padrão e apresenta cerca de 99,8 % de pureza.
 As hemiceluloses são os principais polissacarideos não celulosicos da parede celular e diferem da celulose, em termos analiticos, principalmente por serem solúveis em soluções alcalinas diluidas e serem hidrolisadas pela ação de ácidos diluidos a quente. Esse grupo de carboidratos estruturais e tormado por xilana, xiloglicana, glicomanana, arabinoxilana e calose (Lacerda, 2002; Taiz e Zeiger, 2009) 
A lignina é um polimero de natureza fenolica, constituida por tres diferennte alcoois de fenilpropanoides: coniferil, cumaril e sinapil. Tais álcoois são biossintetizados a partir do aminoácido fenilalanina. Como um polímero, a lignina é um composto de elevado peso molecular, e é considerada como produto final do metabolismo do vegetal, pois quando processo de lignificação é completado, a celula morre, formando o tecido de resistencia. Tal composto pode ser hidrolisado pela açao dos acidos ou bases sob condiçoes apropriadas e altas temperaturas.
A determinação da fibra bruta de uma amostra vegetal é baseada na remoção (extração) dos demais constituintes da amostra, que não sejam a própria fibra bruta. Essa extraçăo é realizada atraves da hidrólise, solubilização e filtração dos compostos mais facilmente hidrolisáveis e solúveis, os quais não fazem parte do conjunto denominado de Fibra Bruta.
II. MARCHA ANALITICA
1. Transferir o residuo da determinação de óleo para um erlenmeyer de 500ml, adicionar 200mL de ácido sulfúrico a 1,25% fervente e, em seguida, colocar para aquecer em ebulição suave e sob refluxo por 30 minutos;
2. Filtrar, sob sucção (a våcuo), em funil de Büchner, usando como filtro um tecido de náilon de malha fina;
3. Lavar com o residuo acerca de 100mL de agua destilada (fervente) e, em seguida, transteriro residuo para o mesmo erlenmeyer usado anteriormente, usando 200mL de NaOH a 1,25% (fervente);
4. Colocar para aquecer em ebulição suavee sob refluxo por 30 minutos
5. Filtrar sob sucção (a våcuo), em funil de Büchner, usando um papel de hltro previamente seco e tarado conjuntamente com um pesa-filtro;
6. Proceder uma lavagem do residuo, usando água destilada quente, sob filtração a vácuo, atė neutralizar o meio (usar papel indicador);
7. Proceder mais uma lavagem Por nitraçao usando 20mL de álcool etilico, e em seguida, 20mL de éter de petróleo;
8. Transterir o papel com o residuo para um Pesa-filtro Previamente seco e tarado, e em seguida colocar em uma estuta regulada a l00ºC;
9. Após permanecer duas horas na estuta, transferir o pesa-filtro com o residuo para um dessecador e deixar por cerca de 10minutos;
10. Apos esfriar, pesar o pesa filtro contendo o residuo (fibra bruta+ cinzas)
11. Transferir o papel de filtro com o residuo para um cadinho previamente queimado e tarado, e calcinar a 575ºC (±25ºC) até obter as cinzas (cerca de 4 horas);
12. Levaro cadinho com as cinzas para um dessecador e deixar estriar por cerca de 10 a 15 minutos;
13. Pesar o cadinho contendo as cinzas e calcular a percentagem de fibra bruta na amostra.
III. BIBLIOGRAFIA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, LP Métodos de análises quimícas em plantas. Recife: Imprensa Universitäria da UFRPE, 2004. 149p.
CARVALHEIRA, JH.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, mimeografado, 1975. 130p
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos fisico-quimicos para análise de alimentos. São P'aulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.
LACERDA, C.F Fisiologia Vegetal. Fortaleza: UFC, 2002. 356 p. il. 
SILVA, DJ; QUEIROZ, AC. de. Análise de alimentos: métodos quimicos e biológicos. Vicosa: UFV. 2002. 235p
TAIZ, L.;ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 2009. 820 p. il.
Proteína
Protídios – Método de Kjeldahl clássico
Material
Balanca analitica, frascos de Kjeldahl de 500 a 800 mL, chapa eletrica ou manta aquecedora, balao de destilacao, frasco Erlenmeyer de 500 mL, bureta de 25 mL, espátula, papel de seda, dedal e pipeta graduada de 25 mL ou pipetador automatico.
Reagentes
Acido sulfurico
Acido sulfurico 0,05 M
Sulfato de cobre
Sulfato de potassio
Dioxido de titanio
Solucao fenolftaleina
Vermelho de metila a 1% m/v
Zinco em po
Hidroxido de sodio a 30% m/v
Hidroxido de sodio 0,1 M
Mistura catalitica – Dioxido de titanio anidro, sulfato de cobre anidro e sulfato de potassio
anidro, na proporcao 0,3:0,3:6.
Procedimento – Pese 1 g da amostra em papel de seda. Transfira para o balao de Kjeldahl (papel + amostra). Adicione 25 mL de acido sulfurico e cerca de 6 g da mistura catalitica. Leve ao aquecimento em chapa eletrica, na capela, ate a solucao se tornar azul-esverdeada e livre de material nao digerido (pontos pretos). Aqueca por mais uma hora. Deixe esfriar. Caso o laboratorio nao disponha de sistema automatico de destilacao, transfira quantitativamente o material do balao para o frasco de destilacao. Adicione 10 gotas do indicador fenolftaleina e 1 g de zinco em po (para ajudar a clivagem das moleculas grandes de protidios). Ligue imediatamente o balao ao conjunto de destilacao. Mergulhe a extremidade afilada do refrigerante em 25 mL de acido sulfurico 0,05 M, contido em frasco Erlenmeyer de 500 mL com 3 gotas do indicador vermelho de metila. Adicione ao frasco que contem a amostra digerida, por meio de um funil com torneira, solucao de hidroxido de sodio a 30% ate garantir um ligeiro excesso de base. Aqueca a ebulicao e destile ate obter cerca de (250-300) mL do destilado. Titule o excesso de acido sulfurico 0,05 M com solucao de hidroxido de sodio 0,1 M, usando vermelho de metila.
Cálculo
V = diferenca entre o no de mL de acido sulfurico 0,05 M e o no de mL de hidroxido de
sodio 0,1 M gastos na titulacao
P = no de g da amostra
f = fator de conversao (conforme Tabela 6)
Referências bibliográficas
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos
químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. Sao Paulo: IMESP, 1985. p. 44-45. 
FAO/WHO. FAO Nutrition Meetings Report Series, 52. Energy and protein requiriments.
Geneva, 1973. (Technical Report Series, n. 522).
SOUTHGATE, D.A.T. The relationship between food composition and available energy. Rome: Joint FAO/WHO/UNU Expert Consultation on Energy and Protein Requirements. 1981.
Humidade
Material
Estufa, balança analítica, dessecador com sílica gel, cápsula de porcelana ou de metal, pinça e espátula de metal.
Procedimento – Pese de 2 a 10 g da amostra em cápsula de porcelana ou de metal, previamente tarada. Aqueça durante 3 horas. Resfrie em dessecador ate a temperatura ambiente. Pese. Repita a operação de aquecimento e resfriamento ate peso constante.
Calculo
Onde:
N = n° de gramas de umidade (perda de massa em g)
P = n° de gramas da amostra
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. Sao Paulo: IMESP, 1985. p. 21-22.
Resíduo por incineração – Cinzas
Material
Cápsula de porcelana ou platina de 50 mL, mufla, banho-maria, dessecador com cloreto de cálcio anidro ou sílica gel, chapa eléctrica, balança analítica, espátula e pinça de metal.
Procedimento – Pese 5 a 10 g da amostra em uma cápsula, previamente aquecida em mufla a 550°C, resfriada em dessecador ate a temperatura ambiente e pesada. Caso a amostra seja líquida, evapore em banho-maria. Seque em chapa eléctrica, carbonize em temperatura baixa e incinere em muflaa 550oC, ate eliminação completa do carvão. Em caso de borbulhamento, adicione inicialmente algumas gotas de óleo vegetal para auxiliar o processo de carbonização. As cinzas devem ficar brancas ou ligeiramente acinzentadas. Em caso contrário, esfrie, adicione 0,5 mL de água, seque e incinere novamente. Resfrie em dessecador ate a temperatura ambiente e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento ate peso constante.
Cálculo
N = no de g de cinzas
P = no de g da amostra
Referências bibliográficas
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos
químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. Sao Paulo: IMESP, 1985. p. 27-28.
TÉCNICA DE QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE KJELDAHL PRINCÍPIO
O método de Kjeldahl determina a matéria nitrogenada total de uma amostra. A base do processo de Kjeldahl é o deslocamento do nitrogênio presente na amostra, transformando-se em sal amoniacal (sulfato de amônio, por meio de H2SO4). A seguir, desse sal obtido, desloca-se o amônio recebendo-se sobre a solução ácida (ácido bórico). Por titulação determina-se a quantidade de nitrogênio que lhe deu origem.
APLICAÇÃO Aplica-se a qualquer tipo de alimento.
PROCEDIMENTO
· 1. Pesar 500mg (200 a 700 mg dependendo da amostra) da amostra homogeneizada, em papel manteiga (anotar o peso).
· 2. Colocar no tubo de digestão de proteína. Pesar 2,5g de sulfato de sódio e adicionar ao tubo.
· 3. Verter 12 a 14mL de solução sulfo-cúprica.
· 4. Digestão (realizada no digestor): Ligar o equipamento de digestão de proteína, programado para temperatura de 420°C e realizar a digestão da amostra até não haver mais matéria a ser digerida, ficando a solução límpida transparente ou esverdeada (aprox 1h) Após completar o ciclo, retirar os tubos, e realizar a destilação.
· 5. Destilação (realizada no equipamento de destilação de proteína): Colocar 12mL de ácido bórico 4% em erlenmeyer de 250mL. Adicionar 40 mL de água destilada e 3 gotas de indicador Tashiro (coloração deverá ficar roxa). Colocar o erlenmeyer (contendo ácido bórico) na ponta de saída do destilador, de modo que a ponta fique submersa no líquido. Colocar o tubo com a amostra no equipamento de destilação de proteína (destilador). Através do funil introdutor do aparelho, adicione 55-60 mL da solução de NaOH a 40% Aquecer à ebulição e destilar com a ponteira mergulhada na solução indicadora até completar 125 mL recolhidos no Erlenmeyer. Após, emergir a ponteira e deixar até recolher mais 25 mL (completando 150 mL). A solução deverá ficar verde.
· 6. Titulação: Colocar ácido sulfúrico 0,1N na bureta. Titular a solução destilada até a virada da cor do destilado (de verde para roxo). Anotar o volume de ácido sulfúrico gasto na titulação.
CÁLCULOS Para cálculo, tomar como referencial básico que:
Assim a quantidade total de H2SO4 0,1N, consumidos pela destilação, multiplicados por 0,0014 nos dará a quantidade de nitrogênio presente na amostra.
Este resultado multiplicado pelo fator de conversão de cada proteína indicará a quantidade de proteína da amostra.
Relacionar o resultado obtido para 100g de produto seco, ou integral.
	Proteína (%) = 
	K x V x Fator
 P
Onde:
K = Fc x 0,0014 x 100
Fc = fator de correção da solução de ácido sulfúrico 0,1N
P = massa da amostra em gramas
V = volume da solução de ácido sulfúrico gasto na titulação
Fator = fator de conversão do nitrogênio em proteína
Fator = fator de conversão de nitrogênio para proteína (varia conforme o alimento)
Referências: CARVALHO et al.(2002); INSTITUTO ADOLFO LUTZ (2008)
Lipídios ou extrato etéreo – Extração direta em Soxhlet´
Material
Aparelho extrator de Soxhlet, bateria de aquecimento com refrigerador de bolas, balanca analitica, estufa, cartucho de Soxhlet ou papel de filtro de 12 cm de diametro, balao de fundo chato de 250 a 300 mL com boca esmerilhada, la desengordurada, algodao, espatula e dessecador com silica gel.
Reagente
Eter
Procedimento – Pese 2 a 5 g da amostra em cartucho de Soxhlet ou em papel de filtro e amarre com fio de la previamente desengordurado. No caso de amostras liquidas, pipete o volume desejado, esgote em uma porcao de algodao sobre um papel de filtro duplo e coloque para secar em uma estufa a 105°C por uma hora. Transfira o cartucho ou o papel de filtro amarrado para o aparelho extrator tipo Soxhlet. Acople o extrator ao balao de fundo chato previamente tarado a 105°C. Adicione eter em quantidade suficiente para um Soxhlet e meio. Adapte a um refrigerador de bolas. Mantenha, sob aquecimento em chapa eletrica, a extracao continua por 8 (quatro a cinco gotas por segundo) ou 16 horas (duas a tres gotas por segundo). Retire o cartucho ou o papel de filtro amarrado, destile o eter e transfira o balao com o residuo extraido para uma estufa a 105°C, mantendo por cerca de uma hora. Resfrie em dessecador ate a temperatura ambiente. Pese e repita as operacoes de aquecimento por 30 minutos na estufa e resfriamento ate peso constante (no maximo 2 h).
Cálculo
 
N = no de gramas de lipidios
P = no de gramas da amostra
Nota: no caso de produtos contendo alta proporcao de carboidratos, pese a amostra sob papel de filtro e lave com cinco porcoes de 20 mL de agua. Coloque em estufa a 105°C por uma hora para secagem e proceda a extracao conforme acima descrito.
Referências bibliográficas
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. Sao Paulo: IMESP, 1985. p. 42-43.
ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 920.39,C). Arlington: A.O.A.C., 1995, chapter 33. p. 10-12
Fibra alimentar total – Método enzimático-gravimétrico
Material
Estufa, mufla, banho-maria, banho-maria com bandeja agitadora, dessecador com silica
indicadora de umidade, cadinho de vidro com placa de vidro sinterizado (ASTM 40-60
μm), la de vidro de fibra media, bequer de 250 mL, proveta de 250 mL, kitassato de 500 ou
1000 mL, trompa d’agua e tamis de 32 mesh.
Reagentes
Extran a 2%
Acido cloridrico 0,561 M
Acido cloridrico 1 M
Hidroxido de sodio 1 M
Alcool a 95%
Alcool a 78%
Acetona
α-amilase termorresistente
Protease
Amiloglicosidase
MES – Acido 2-(N-morfolino)etanossulfonico
TRIS – Tris(hidroximetil)aminometano
Solucao-tampao MES-TRIS 0,05 M – Pese 19,52 g de MES e 12,2 g de TRIS. Dissolva em
1,7 L de agua. Ajuste o pH para 8,2, a 24°C, com NaOH 6 M e dilua para 2 L com agua.
Procedimentos
Preparacao da amostra – Dependendo das caracteristicas da amostra com relacao ao teor de
umidade, gordura e acucar, adota-se um procedimento diferente, visando facilitar a eficiencia
do tratamento enzimatico. Alimentos com alto teor de umidade devem ser inicialmente
secos em estufa a vacuo a 70°C, durante a noite, quantificando-se o teor de umidade para
efeito do calculo final da fibra alimentar. Alimentos com alto teor de acucar devem ser
tratados previamente com 100 mL de alcool a 85% por 30 min em banho-maria a 70°C
com posterior filtracao. O residuo e lavado com alcool a 70% ate atingir o volume de 500 mL.
Apos a evaporacao do solvente, o teor de acucar e quantificado conforme 038/IV e 039/IV. Alimentos com teores de lipidios acima de 5%, quando secos, devem ser desengordurados com eter, em aparelho de Soxhlet, quantificando-se o teor de gordura pelo mesmo motivo da determinação de umidade. Apos o tratamento adequado, a amostra deve se moida ou triturada e passada por tamis de 32 mesh. Conserve-a em recipiente fechado ate ser analisada. No momento da tomada da amostra para a analise da fibra, determine novamente o teor de umidade.
Preparacao dos cadinhos – Lave os cadinhos de vidro com placa de vidro sinterizado com porosidade no 2 (Pyrex no 32940, ASTM 40-60 μm) com extran a 2%, mantendo em banho por 24 horas, enxague com 6 porcoes de agua utilizando vacuo, passe mais 3 porcoes de agua no sentindo oposto ao da filtracao, com a finalidade de remover qualquer residuo retido na placa de vidro. Seque em estufaa 105°C. Transfira os cadinhos para dessecador mantendo-os a temperatura ambiente. Pese. Revista internamente os cadinhos com uma camada de cerca de 1 g de la de vidro, tendo o cuidado de distribuir uniformemente no fundo e nas paredes (forma de concha).
Lave a la com uma porcao de 50 mL de acido cloridrico 0,5 M com auxilio de vacuo, lave com agua ate a neutralizacao. Seque em estufa a 105°C. Incinere em mufla a 525°C, no minimo por cinco horas. Resfrie em dessecador e pese (P1 para a amostra e B1 para branco).
Tratamento enzimatico – Pese em bequer de 250 mL, em triplicata, cerca de 1 g da amostra tratada e que tenha passado por tamis de 32 mesh. O peso entre as triplicatas nao deve diferir de 20 mg. Adicione 40 mL de solucao-tampao MES-TRIS, pH 8,2, dispersando completamente a amostra. Adicione 50 μg de α-amilase termorresistente, agitando levemente. Tampe com papel aluminio e leve ao banho-maria a (95 - 100)°C, por 35 min com agitacao continua. Remova os bequeres do banho e resfrie ate (60 �} 1)°C. Adicione 100 μL de solucao de protease preparada no momento do uso (50 mg/mL em tampao MES-TRIS), cubra com papel aluminio e leve ao banho-maria a (60 �} 1)°C com agitacao por 30 minutos. Remova o papel aluminio dos bequeres e adicione 5 mL de acido cloridrico 0,561 M, com agitacao. Mantenha a temperatura a (60 �} 1)°C e ajuste o pH entre 4,0 - 4,7, com adicao de solucao de hidroxido de sódio 1 M e/ou acido cloridrico 1 M. Adicione 300 μL de solucao de amiloglicosidase. Cubra com papel aluminio e leve ao banho-maria a (60 �} 1)°C, por 30 minutos, com agitação continua.
Notas
Paralelo ao procedimento da amostra, processe pelo menos dois cadinhos em branco (sem
amostra). E fundamental, para fins de calculo, conhecer a massa de la de vidro utilizada no revestimento do cadinho.
O vacuo utilizado nas filtracoes deve ser moderado, sendo suficiente o produzido pela trompa
d’agua.
Utilize luvas e mascara de protecao durante a manipulacao da la de vidro.
Fibra alimentar total – Meca o volume do hidrolisado obtido no tratamento enzimatico. Adicione alcool 95% a 60°C, medido apos aquecimento, na proporcao de 4:1 do volume do hidrolisado. Cubra os bequeres com papel aluminio e deixe a mistura em repouso, a temperatura ambiente, por 1 hora, para a precipitacao da fracao fibra soluvel. Posicione o cadinho, previamente preparado e pesado, num kitassato acoplado a uma trompa de vacuo. Passe pelos cadinhos uma porcao de 15 mL de alcool a 78%, para redistribuir a la de vidro. Filtre quantitativamente a solucao alcoolica contendo o residuo da hidrolise, cuidando para que a solução nao ultrapasse o nivel da la de vidro durante a filtracao. Lave o residuo com duas porcoes de 15 mL de alcool a 95% e duas porcoes de 15 mL de acetona. Seque os cadinhos contendo o residuo em estufa a 105°C, durante uma noite. Resfrie em dessecador e pese (P2 para a amostra e B2 para o branco). Apos a pesagem, determine o teor de proteina em um dos cadinhos da amostra e em um do branco. Determine o teor de cinzas nos outros dois cadinhos da amostra e em um do branco.
Cálculo
RT = residuo total da amostra = (P2- P1)
BT = residuo total do branco = (B2- B1) - Pb- Cb
C = cinzas da amostra
m = massa da tomada da amostra
P = teor de proteína
DETERMINAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DE VITAMINA C POR REDUÇÃO DE ÍONS CÚPRICOS
Este método é aplicável para a quantificação de ácido ascórbico (vitamina C), em baixas concentrações em alimentos pigmentados, naturais e industrializados.
Material
Espectrofotômetro UV/VIS com cubetas de 1 cm de espessura, liqüidificador, agitador mecânico, balança analítica, béqueres de 50 e 100 mL, pipetas graduadas de 1, 2, 5 e 10 mL, pipetas volumétricas de 1, 2, 5 e 10 mL, provetas de 50 e 100 mL, balões volumétricos de 50 e 100 mL, funil de vidro, provetas de 25 e 50 mL com tampa, frasco Erlenmeyer de 250 mL com tampa e frasco Erlenmeyer de 25 mL.
Reagentes
Acetato de sódio
2,2’-Biquinoleína (cuproína)
Tolueno
Álcool isoamílico
Ácido sulfúrico
Ácido ascórbico padrão
Uréia
Clorofórmio
Álcool
Acetato de cobre (II) mono-hidratado
Solução de ácido metafosfórico a 5% m/v
Solução A (Branco) – Pipete 2 mL da solução de ácido metafosfórico a 5%, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água.
Solução-tampão de acetato de sódio e ácido acético 1 M, pH = 4,6 com 1,5% de uréia – Pese 13,6 g de acetato de sódio (no caso de se usar o acetato de sódio anidro, pese 8,2 g) e dissolva em 100 mL de água (solução I). Meça 6 mL de ácido acético, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água (solução II). Misture as soluções I e II, adicione 3 g de uréia e meça o pH. Solução 2,2’-biquinoleína (cuproína) a 0,4% em tolueno m/v. Solução de acetato de cobre (II) a 0,075% em álcool isoamílico m/v Reagente de complexação (Solução C) – Transfira 95 mL da solução de acetato de cobre II 0,075% em álcool isoamílico para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com 5 mL de solução de cuproína 0,4% em tolueno. Esta solução deverá ser recém-preparada. Solução de ácido sulfúrico 0,05 M. Solução-padrão I de ácido ascórbico a 1 mg/mL – Pese 0,1 g de ácido ascórbico padrão e dissolva em um balão de 100 mL com água.
Solução-padrão II a 20 μg/mL – Transfira 2 mL da solução de ácido ascórbico de concentração de 1 mg/mL (Padrão I) para um balão volumétrico de 100 mL e adicione 2 mL da solução de ácido metafosfórico a 5% e complete o volume com água.
Nota: proteja as soluções de ácido ascórbico da luz.
Procedimentos
Amostras líquidas – Pese 50 g da amostra, transfira para um liqüidificador e adicione 100 mL da solução de ácido metafosfórico a 5%. Agite, na velocidade máxima durante 1 a 3 minutos. Dependendo da concentração de vitamina C na amostra, transfira 5 a 20 g do extracto para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Agite e retire uma alíquota de 30 mL da solução e descarte. Adicione ao balão 5 mL de clorofórmio e agite durante 1 minuto. Deixe em repouso para que as camadas se separem.
Amostras sólidas – Pese de uma a quatro gramas da amostra e transfira para um frasco Erlenmeyer juntamente com 10 mL da solução de ácido metafosfórico a 5% e 10 mL de ácido sulfúrico 0,05 M. Agite, em agitador mecânico, por 30 minutos. Transfira 10 g do homogeneizado para um balão volumétrico de 50 mL e complete o volume com água. Agite e retire 10 mL da solução e descarte. Adicione 5 mL de clorofórmio ao balão e agite durante 1 minuto. Deixe em repouso para que as camadas se separem. Pipete 5 mL da camada aquosa límpida para os tubos de reação (provetas de 25 mL com tampa). Adicione 1 mL da solução-tampão e 5 mL da solução complexante. Agite fortemente durante 90 segundos e deixe as camadas se separarem. Retire 3 mL da parte superior (álcool isoamílico) e transfira para um frasco Erlenmeyer de 25 mL. Adicione 0,5 mL de álcool e agite levemente. Prepare um branco, pipetando 5 mL da solução A diretamente no tubo de reação e prossiga como o tratamento da amostra. Leia as absorbâncias das amostras a 545 nm, usando o branco como referência.
Nota: todos os solventes utilizados na preparação das soluções devem ser de alto grau de pureza, pois os contaminantes de caráter redutor interferem na reação.
Curva-padrão – Pipete, diretamente, nos tubos de reação (ou provetas de 25 mL com tampa), alíquotas de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5 mL da solução-padrão II correspondente, respectivamente, a 10, 20, 30, 40 e 50 μg de ácido ascórbico e complete até 5 mL com a solução A. Adicione 1 mL da solução-tampão e 5 mL da solução complexante. Agite fortemente durante 90 segundos. Deixe as camadas se separarem. Retire 3 mL da parte superior (álcool isoamílico) e transfira para um frasco Erlenmeyer de 25 mL. Adicione 0,5 mL de álcool. Agite suavemente. Repita o mesmo procedimento com o branco constituído de 5 mL da solução A e sem a adição dos padrões. Faça a leitura das absorbâncias a 545 nm, usando o branco como referência. Construa a curva-padrão.
Cálculo
A = μg de vitamina C determinada na curva-padrãoB = gramas de amostra contida nos 5 mL do tubo de reação
Referências bibliográficas
BADOLATO, M.I.C.B.; SABINO, M; LAMARDO, L.C.A.; ANTUNES, J.L.F. Estudo comparativo de métodos analíticos para determinação de ácido ascórbico em sucos de frutas naturais e industrializados.Ciênc.Tecnol. Aliment.,Campinas, v. 16. n. 3, p. 206-210, 1996.
CONTRERAS-GUZMÁN, E.; STRONG III,F.C.; GUERNELLI, O. Determinação de ácido ascórbico (vitamina C), por redução de ions cúpricos. Química Nova, v. 7, n. 2, p. 60-64, 1984.
Determinação de vitamina C com iodato de potássio
Este método é aplicado para a determinação de vitamina C ou ácido L-ascórbico, em alimentos in natura ou enriquecidos, quando a quantidade da referida vitamina for maior que 5 mg e baseia-se na oxidação do ácido ascórbico pelo iodato de potássio.
Tabela de Conversão
1,0 g de ácido ascórbico 1,214 g de ascorbato de sódio
1,0 g de ascorbato de sódio 0,889 g de ácido ascórbico
1,0 UI (Unidade Internacional) 0,05 mg de ácido ascórbico
Material
Papel de filtro qualitativo, dessecador, estufa, balança analítica, béqueres de 50 e 250 mL, frasco Erlenmeyer de 300 mL, pipetas graduadas de 1 e 10 mL, pipeta volumétrica de 10 mL, buretas de 10 e 25 mL, balões volumétricos de 100 e 1000 mL, funil de vidro, bastão de vidro e proveta de 50 mL.
Reagentes
Solução de ácido sulfúrico a 20% v/v
Solução de iodeto de potássio a 10%, m/v
Solução de amido a 1%, m/v
Solução de iodato de potássio 0,02 M – Seque 5 g de iodato de potássio em estufa a 110oC e esfrie. Pese 3,5668 g, transfira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete com água (1 mL iodato de potássio 0,02 M = 8,806 mg de ácido ascórbico).
Solução-padrão de iodato de potássio 0,002 M – Pipete 10 mL da solução de iodato de potássio 0,02 M e dilua até 100 mL com água em balão volumétrico (1 mL de iodato de potássio 0,002 M equivale a 0,8806 mg de ácido ascórbico).
Procedimento – Homogeneíze a amostra e pese uma quantidade que contenha ao redor de 5 mg de ácido ascórbico. Transfira para um frasco Erlenmeyer de 300 mL com auxilio de aproximadamente 50 mL de água. Adicione 10 mL de solução de ácido sulfúrico a 20%. Homogeneíze e, se necessário, filtre para outro frasco Erlenmeyer, lavando o filtro com água e logo após com 10 mL da solução de ácido sulfúrico a 20%. Adicione 1 mL da solução de iodeto de potássio a 10% e 1 mL da solução de amido a 1%. Titule com solução de iodato de potássio até coloração azul. Dependendo da quantidade de vitamina
C contida na amostra, utilize solução de iodato de potássio 0,02 M ou 0,002 M. Analise sempre a amostra em duplicata e faça uma prova em branco.
Cálculo
F = 8,806 ou 0,8806, respectivamente para KIO3 0,02 M ou 0,002 M
P = n° de g ou mL da amostra
Referências bibliográficas
FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 3. ed. São Paulo: Organização Andrei Editora S.A., 1977. p. 82-83.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz: v. 1 Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 393.V = volume de iodato gasto na titulação
DETERMINAÇÃO DE FIBRA ALIMENTAR
Para a análise de alimentos de consumo humano, o conhecimento do teor fibra alimentar é mais adequado do que o de fibra bruta. Hoje a definição mais aceita, para fins analíticos, e a de Asp que define as fibras, considerando os aspectos fisiológicos, como polissacarídeos (exceto amido) e lignina que não são digeridos pelo intestino delgado humano.
Hellenboon et al. (1975) desenvolveram o método enzimático-gravimétrico, que consiste em tratar o alimento com diversas enzimas fisiológicas, simulando as condições do intestino humano, permitindo separar e quantificar gravimetricamente o conteúdo total da fração fibra e/ou as frações solúveis e insolúveis. Este método foi posteriormente modificado por Asp et al (1983) e Prosky et al. (1984).
TÉCNICA Fibra alimentar total – Método enzimático-gravimétrico
PROCEDIMENTO
· 1- Pesar 1 de amostra seca e desengordurada (se mais de 5% de gordura) em triplicata em becker.
· 2- Adicionar 50mL de tampão fosfato e 100μL de enzima α-amilase termor-resistente.
· 3- Colocar no banho-maria com agitação a 100º C durante 30min.
· 4- Esfriar e colocar 8mL de NaOH 0,275N e acertar pH até 7,5.
· 5- Adicionar 100μL de protease (50mg de protease em 1mL de tampão fosfato).
· 6- Colocar no banho-maria com agitação a 60º C durante 30min.
· 7- Esfriar e adicionar 8 mL de ácido clorídrico 0,325N e ajustar o pH até 4,3. Adicionar 100μL de amiloglicosidase
· 8- Colocar no banho-maria com agitação a 60º C durante 30min.
· 9- Retirar do banho-maria e adicionar 280mL de etanol 95% (aproximadamente 4 vezes o volume do hidrolisado).
· 10- Deixar a mistura em repouso, à temperatura ambiente, por 1 hora, para a precipitação da fração fibra solúvel (OBS: a fibra solúvel estava no sobrenadante, a fibra insolúvel já estava precipitada).
· 11- Filtrar quantitativamente a solução alcoólica contendo o resíduo da hidrólise em cadinho especial (cadinho de vidro sinterizado contendo celite, previamente incinerado em mufla e tarado), conectando no sistema de vácuo com Kitassato.
· 12- Lavar o béquer com três porções de 20mL de álcool etílico 78% colocando todo o resíduo no cadinho (devagar).
· 13- Lavar o béquer com duas porções de 20mL de álcool etílico 95% colocando todo o resíduo no cadinho (devagar).
· 14- Lavar o béquer com duas porções de 20mL de acetona (devagar).
· 15- Colocar os cadinhos em estufa a 105°C por uma noite, colocar em dessecador 30min e pesar em balança analítica.
· 16- Determinar o teor de proteínas (P) em uma das triplicatas (utilizar método de Kjeldahl sem uso do digestor nem do destilador por causa do celite, usar método “micro-Kjeldahl”).
· 17- Incinerar os outros dois cadinhos em mufla a 525°C por 5horas para a determinação de cinzas (C).
· 18- Desligar a mufla e quando estiver a aprox 250º C retirar o cadinho, colocar no dessecador deixando esfriar até temperatura ambiente e pesar em balança analítica.
Notas Paralelo ao procedimento da amostra, processar pelo menos dois cadinhos em branco (sem amostra).
CÁLCULOS
· Fibra alimentar total (%) = (RT-P-C-BT)*100 / m
·  
· RT = resíduo total da amostra
· BT = resíduo total do branco
· C = cinzas da amostra
· m = massa da tomada da amostra
· P = teor de proteína
Referências: INSTITUTO ADOLFO LUTZ (2008), AOAC (1995)
https://lume-re-demonstracao.ufrgs.br/composicaoalimentos/fibras/determinacao_alimentar.php
DETERMINAÇÃO DE POTASSIO EM TECIDos VeGETAIS POR FOTOMETRIA DE CHAMA
LINTRODUÇÃO
O potássio é um macronutriente absorvido pelas plantas sob a torma de K+, o qual se encontra nos tecidos vegetais na concentração de 2 a 110g kg-1 da matéria seca. Embora o sódio nao seja considerado um elemento essencial para as plantas de metabolsimo fotossintetico do tipo C3, ele e elemento essencial (micronutriente) para as plantas C4 e também para as plantas CAM, tendo em vista a sua participaçao na regeneraçao de fosfoenolpiruvato. No caso das halófitas, plantas nativas de habitats salinos, esse elemento e exigido em grandes quantidades sendo, portanto um macronutriente para as mesmas (Epstein e Bloom, 2006; Larcher, 2006).
A fotometria de chama e uma tecnica espectroscopica de emissao em que a amostra em soluçao e introduzida na chama em torma de aerosol (nebulizada). A funçao da chama neste caso é excitar eletronicamente os constituintes da amostra. Os metais alcalinos e alcalinos terrosos são os elementos mais facilmente excitados à temperatura das chamas. A excitação de um atomo resulta da moditicaçao temporarna na posiçao dos eletrons. Quando um eletron absorve energia, ele salta do seu nivel para outro de maior energia (mais distante do núcleo). Ao voltar para seu estado original, quando o atomo (cation) alcança uma região menos quente na chama, ele devolve a energia absorvida em torma de ondas luminosas monocromaticas. A radiação emitida é entāo quantificada através de uma célula totoeletrica, a qual conectada a um galvanometro, provoca o desvio de um ponteiro, permitindo a avaliação daconcentração do elemento que tora excitado por comparaçao com soluçoes padrões.
Para que a radiação originária de um determinado element seja tanto quanto possivel a ünica a sensibilizar a célula fotoelétrica, ela deverá atravessar um filtro que, idealmente, absorva todas as radiacoes, com exceçao, da que interessa. Este tipo de filtro e denominado de filtro de interferëncia. Os fotömetros, no geral, são providos de um filtro para sódio, outro para potássio, outro para calcio, outro para magnésio, etc.
II. MARCHA ANALÍTICA
1. Ligar o fotometro de chama dez minutos antes de realizar as leituras;
2. Zerare ajustar o fotömetro para a faixa de leitura e em seguida proceder à leitura das soluções padrões com o aparelho ajustado para Na+ e K+. anotar o valor das leituras referents a solucoes padroes;
3. Proceder à leitura com o extrato da amostra usado para a determinaçao de fostoro, ou extrato nitro-perclorico. se necessario, isto é, se a leitura for Superior ao ponto maximo da curva padrão, proceder à diluição do extrato, tomando 2ml. do mesmo e completando o volume para 25ml. com agua deionizada;
4. Anotaro valor da leitura referente a Na+e K+ no extrato da amostra.
5. Proceder aos cálculos para encontrar a concentração de potassio e sodio na amostra preparada (pre-seca).
III. PREPARO DOS REAGENTES
Solução padrão (estoque) de sódio e potássio 1000mg.L-1
Pesar 0,1907g de cloreto de potássio e 0,2541g de cloreto de sódio (ambos P.A.), dissolver em água deionizada e completar o volume para 100mL.
Curva padrāo. Preparar uma curva padrāo de södio e potássio contendo 0, 5, 10, 15, 20 e 25mg.kg-1 de cada um destes elementos, partindo de uma soluçăo estoque de 1.000mg.L-1. Para isto, pipetar para balões volumétricos de 200mL (separadamente) as quantidades de 0, 1, 2, 3,4 e 5 mL da solução estoque e em seguida completar o volume com água deionizada.
DETERMINAÇÃO DE Ca, Fe e Mn POR ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICCA
I. INTRODUÇÃO
A determinação analitica de grande parte dos nutrients minerais essencias as plantas tais como cälcio, magnésio, cobre, ferro, manganés e zinco, é realizada através da espectrofotometria de absorção atômica. Esta técnica analitica foi desenvolvida pelo australiano Alan Walsh, em meados da década de 1950, para superar o problema de que grande quantidade dos elementos quimicos não era excitada pela temperatura das chamas (exceção feita para os metais alcalinos) e se encontravam no estado fundamentale portanto, e năo poderiam ser determinados pela técnica de espectroscopia de emissão de chama.
A espectroscopia de absorção atômica fundamenta-se na absorção de energia radiante (e consequente excitaçāo) por elementos quimicos em estado fundamental. Na absorção atômica, o elemento a determinar é levado à condição de uma dispersão atömica gasosa, através da qual se faz passar um feixe de radiacao com comprimento de onda que possa ser absorvido. 
Sabe-se que uma certa espécie atômica neutra e no estado fundamental é capaz de absorver radiações em comprimentos de onda iguais aos que ela, quando excitada, é capaz de emitir.
DESCRIÇÃO DO ESRECTROFOTÔMETRO DE ABSORÇÃO ATÔMICA
Os componentes do equipamento incluem uma fonte primária, a qual emite o espectro do elemento a determinar, um dispositivo para a vaporizaçao da amostra, um monocromador para isolar a raia analitica, um detector de radiaçăo e um sistema adequado para medir o sinal.
FONTES DE RADIAÇAO
As fontes de radiação mais empregadas são as làmpadas de vapor e as de catodo oco. As lampadas de vapor são tubos de descarga de baixa pressao, que contem vapor ao menos parcialmente composto do elemento de interesse. Por outro lado, as làmpadas de cátodo oco são tubos de descarga de neônio ou argónio a baixa pressäo, em que o vapor do elemento a exciter é produzido por volatilização catódica durante a descarga. Este tipo de dispositivo consiste em um tubo de vidro com paredes grossas, contendo o gás nobre sob pressão (1-2atm), provido de um cátodo, em uma das extremidades, confeccionado ou recoberto comoelemento de interesse, comumente sob a forma de um cilindro fechado, e um anodo na forma de um fio de tungstenio. Existem lampadas de catodo oco para um unico element, e tambem lampadas multielementos, as quais contem varios elementos em uma unica estrutura de cátodo oco (ex.: Ca e Mg; Cu e Mn, Cue Zn; e Cr, Co, Cu, Fe, Mn e Ni).
DISROSITIVO DE VAPORIZAÇÃO DA AMOSTRA
(ATOMIZADOR DE CHAMA)
Serve para dispersar a amostra em forma de particulas atömicas neutras no teixe de emissão do câtodo oco, para que isso ocorra é necessária a remoção do solvente e as moleculas convertidas em atomos simples, isto pode ser teito por uma chama, em forno de gratite (aquecimento sem chama) ou por torno de plasma.
O atomizador de chama é formado por: Nebulizador: do tipo pneumático em que o tluxo dos gases através de um oriticio cria um vácuo que arrasta a amostra atravės de um tubo capilar. A mistura ar-amostra emerge do nebulizador paraointerior de uma camara (camara de nebulização) em torma de aerossol, que se mistura com o combustivel, em geral acetileno. A mistura torna-se turbulenta devido à açåo de deflectores e finalmente, chega ao combustor. As goticulas maiores sao coletadas na camara de mistura e removidas por um dreno, e assim apenas as particulas menorese homogêneas chegam à chama em fluxo constante.
Queimador: em geral é do tipo pre-mistura, com uma camara especial onde a amostra e misturada com os gases antes da queima. Possuem fenda longa e são fabricados com titänio para conferir maior resistência às soluções ácidas, estabilidade e inércia. Os combustiveis utilizados para produzir a chama são acetileno e hidrogênio, enquanto os oxidantes são ar, oxigėnio e óxido nitroso (Quadro 39.1).
QUADRO39.1. Temperatura (oC) de combustão no queimador em função do combustivel e oxidantes empregados em espectroscopia de absorcao atomica.
	COMBUSTIVEIS
	OXIDANTES(oC)
	
	Ar
	Oxigenio
	Oxido Nitroso
	Acetileno
	2200
	3050
	2955
	Hidrogenio
	2100
	2780
	-------------
MONOCROMADOR
A função primordial do monocromador é isolar a raia analitica do elemento de interesse das raias emitidas pela lämpada de càtodo oco que năo são absorvidas (raias vizinhas), assim como a radiação de fundo da chama.
DETECTORES E INDICADORES
Em geral são empregados tubos fotomultiplicadores para detectar a energia radiante e converter em sinal elétrico, e são identicos aos utilizados em espectrototömetros UV-visivel.
TIPOSDE INSTRUMENTOS
Existem dois tipos de espectrofotometro, os de feixes siples e os de duplo feixe. No sistema de feixe simples, a modulação da fonte produz uma corrente alternada no detector. O sistema fica submetido aos efeitos da variabilidade na emissão da fonte e na sensibilidade do detector. E necessário um certo tempo de espera para a estabilidade da emissão. Por outro lado, no sistema de feixe duplo com corrente alternada, o modulador divide a luz da fonte em dois feixes, o feixe da amostra que passa através da chama e o de referència que circunda a chama, e ao final os teixes são recombinados,
Particularnmente para as análises de cálcio e magnésio há a necessidade da adição de solução de cloreto de estrõncio ou de cloreto de lantânio (que contenha de 2,0 a 5,0g de Sr ou La por litro de solução) para evitar interterëncias provocadas pe presença de fosfatos e aluminatos. Tanto o estrôncio como o lantânio têm a capacidade de impedir a formação de compostos termicamente estáveis (óxidos refratários) entre magnésio ou cálcio com fostatos e aluminatos, os quais não são decompostos pela chama ar/acetileno. Desse modo, o estróncio e o lantanio exercem o papel de agente liberador do cálcio e do magnésio, pois formam compostos quimicamente mais está-veis com Os interterentes.
II MARCHA ANALITICA
1. Conectar a lämpada de catodo oco, correspondente ao elemento a ser analisado, ao espectrofotometro de absorçao atomica (EAA). Marca CGB, modelo AA7000;
2. Ligar o EAA e deixar aquecendo por cerca de 15 minutos;
3. Ajustar o comprimento de onda (ajuste grosso) de acordocom o elemento a ser analisado. Para isto, consulte o quadro 39,2;
4. Selecionar a lâmpada a ser utilizada (bocal n°1 ou no2) e entrar com o valor da corrente em mA;
5. Ajustar o tempo de integraçao para tres segundos, e tambem a abertiura da fenda conforme o quadro 39.2;
6. Fazer os ajustes horizontal e vertical do feixe luminoso e posteriormente efetuar o ajuste fino do comprimento de onda;
7. Regular a pressão de saida do ar comprimido para 3,4 bar;
8. Ligar o sistema de exaustão dos gases e em seguida acender chama;
9. Fazer a calibração do aparelho, utilizando os padrões de trabalho relativos ao elemento em análise. Esta calibração é realizada em absorbäncia;
10. Aspirar o branco e depois zerar o aparelho;
11. Passar o EAA para o modo de concentração e proceder à leitura dos padrões de trabalho e logo em seguida a leitura das amostras;
12. Apos ler todas as amostras, apagar a chama, desigar o aparelho, fechar as saidas dos gases e desligar o Sistema de exaustao.
OBS.: A amostra para o caso de tecidos vegetais é o extrato nitro-perclórico 
Quadro 39,2 Corrente a ser empregada na lämpada, aber tura da tenda e comprimento de onda para calibraçaão do EAA correspondente a cada elemento quimico a analisar.
	Elemento Quimco
	Corrente da lambada
	Abertura da Fenda
	Comprimento de Onda
	Ca
	4,0
	0,5
	422,7
	Mg
	4,0
	0,5
	285,2
	Cu
	4,0
	0,5
	324,7
	Fe
	6,0
	0.2
	248,3
	Mn
	5,0
	0,2
	279,5
	Zn
	5,0
	0,5
	213,9
OBS: Estes valores podem ser alterados em função do modelo de aparelho e do tempo de uso (idade) da lämpada.
III. REAGENTES
a. Soluções padrões de cálcio Solução estoque 1.000 mg.l' de Ca. Pesar 2,4970g de CaCO, seco, dissolver em 25mL de ácido clorídrico (d=1,18 12N) e completar para um litro com água deionizada.
Padrões de trabalho (0; 2; 4; 6; 8 e 10mg.L-1 Ca). Transferir para balões volumétricos de 100mL alíquotas de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0mL da solução estoque (1.000mg.L-1 Ca)e completar o volume com solucao de cloreto de estroncio 1,52%. O branco (padrão zero) corresponde à solução de cloreto de estroncio 1,52%.
b. Soluções padrões de magnésio
Solução estoque 1.000 mg.L-1 de Mg. Pesar 1,0000g de magnésio metálico, dissolver em 50mL de ácido cloridrico 5N e completar para um litro com água deionizada.
Padrões de trabalho (2; 4; 6; 8 e 10 mg.L-1 Mg). Transferir para balöes volumétricos de 100mL aliquotas de 0,2;0,4; 0,6; 0,8 e 1,0mL da solução estoque (1.000 mgL-1 Mg) e completar o volume com solução de cdoreto de estrôncio 1,52%. O branco (padrao zero) correspornde a soluçao de cloreto de estroncio 1,52%.
OBS.: Recomenda-se que os extratos vegetais obtidos por digestäo nitro-perclórica sejam diluidos (0,5+10) com solução de cloreto de estrôncio 1,52%.
c. Soluções padrões de cobre 
Solução estoque 1.000 mg.L-1 de Cu. Pesar 1,0000g de cobre metálico, dissolver em 50mL de ácido nitrico 6 N e completar para um litro com agua deionizada.
Padroes de trabalho (1; 2; 3; 4 e 5mg.L-1 Cu). Transferir para baloes volumetricos de 10mL aliquotas de 0,l; 0,2; 0,3; 0,4e 0,5mL da solução estoque (1.000mg.L-1Cu) e completar ovolume com agua deionizada. O branco (Padrao zero) corresponde a agua deionizada.
d. Soluções padrões de ferro 
Solução estoque 1.000mg.L-1 de Fe. Pesar 1,0000g de ferro metálico, dissolver em 20mL de ácido clorídrico 5N e 5mLde acido nitrico 6 N, e completar para um litro com agua deionizada.
Padrões de trabalho (0; 2; 4;6; 8 e 10mg.L-1 Fe). Transferir para balöes volumétricos de 100mL aliquotas de 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0mL da solução estoque (1.000 mg.L-1 Fe) e completar volume com agua deionizada.
e. Soluções padrões de manganės
Solução estoque 1.000 mg.L-1 de Mn. Pesar 1,0000g de manganés metálico, dissolver em 50mL de ácido nitrico 6 N e completar para um litro com água deionizada.
Padröes de trabalho (0; 1;2;3; 4 e 5mg.L-1 Mn). Transferir para balões volumétricos de 100mL alíquotas de 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 e 0,5mL da solução estoque (1.000 mg.L-1 Mn) e completar o volume com àgua deionizada.
f. Soluções padrões de zinco
Solução estoque 1.000 mg.L-1 de Zn. Pesar 1,0000g de zinco metalico, dissolver em 40mL de ácido cloridrico 5 N e completar para um litro com água deionizada.
Padrões de trabalho (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0e 2,5mg.L-1 Zn).
Transferir para balöes volumétricos de 200 mL alíquotas de 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 e 0,5mL da soluçāo estoque (1.000mgL-1 Zn) e completar o volume com água deionizada. 
g. Solução de Cloreto de Estrôncio 1,52%. Pesar 15,2g de cloreto de estrôncio hexahidratado P.A. (SrCl2.6H2O) dissolver em água deionizada e completar a um litro.
DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO METODO COLORIMETRICO DO MOLIBDO-VANADATO
I. INTRODUÇÃO
O fostoro e um macronutriente vegetal cuja concentração total em tecidos vegetais pode variar de 1 a 15g kg-1 da materia Seca. Sua determinaçao pode ser feita colorimetricamente pelo método do molibdo-vanadato, o qual apresenta uma sensibilidade relativamente boa na faixa de 0,1 a 20ppm. Este método sofre interterencia do Fe2+ e Cl- quando em concentraçoes superiores a 100ppm e 75ppm respectivamente.
A colorimetria baseia-se na comparação da intensidade de cor de soluçoes de concentraçoes desconhecidas (amostras), com a intensidade de cor de soluções padrões de um dado elemento ou composto, responsável pela cor destas soluções. A intensidade de cor das soluções é medida em aparelhos denominados colorimetros, cujos resultados das leituras (absorbancia) sao correlacionados com as concentraçoes do elemento ou composto em estudo, possibilitando o calculo de sua concentração nas soluções problemas.
A primeira etapa da análise do fosforo em tecido vegetal é a digestao da amostra, a qual pode ser feita por via humida ou por via seca. Por via úmida, usa-se uma mistura de ácido nitrico com ácido perclórico e põe-se a amostra para aquecer por quatro horas. Por via seca, procede-se a calcinaçao da amostra, conforme descrito na determinação de cinzas (R.M).
extrato Vegetal evidamente preparado apresenta-se como uma solução incolor. P'ara a sua analise por um metodo colorimetrico, faz-se necessario adicionar um reagente especifico (molibdato de amônio mais vanadato de amônio), o qual reage como fosforo formando um complexo de cor amarelada. A intensidade de cor formada é proporcional à concentração de fostoro e pode ser medida em um colorimetro e em seguida correlacionada com soluções padrões de fóstoro
II. MARCHA ANALÍTICA
1. Pipetar para tubos de ensaio, separadamente, mL dos padrões de fósforo (0; 25; 50; 75; 100 e 200mg.L-1) ou do extrato vegetal (nitro-perclórico ou das cinzas);
2. Acrescentar a cada tubo de ensaio, 5mL de agua deionizada e lmL do reagente especifico, formado pela mistura de volmes iguais de molibdato de amónio a 5% e vanadato de amõnio a 0,25%;
3. Deixar em repouso por 5 minutos, fazer a leitura em colorimetro com filtro azul ou em espetrofotometro a 470nm;
4. Elaborar um gráfico, colocando no eixo x os valores dos padroes de fostoro e no eixo y as leturas obtidas com os mesmos, e em seguida calcular a equação de regressão linear;
5. Calcular a concentração de fóstoro na amostra vegetale expressar os resultados em g kg-1
Observaçăo: O colorimetro tipo Klett-Summerson fornece as leituras em unidades Kletts (u.k.), as quais equivalem a absorbancia multiplicada pelo fator 500.
III. REAGENTES
Molibdato de amônio ((NH4)6Mo7O24). Solução aquosa a 5%. Pesar 26,55g do sal tetra hidratado, dissolver em ågua destilada e completar o volume para 500mL.
Vanadato de amónio (NH4VO3). Solução a 0,25%. Pesar 1,25g do sal e dissolver em cerca de 250ml. de agua destilada quente. Deixar esfriar e em seguida adicionar 175mL. de ácido nitrico concentrado. Completar o volume para 500mL e guardar em frasco escuro.
Solução padrão de fóstoro. Preparar uma solução estoque contendo 1.000mg.L-1 de fósforo. Pesar 2,195g de fosfato monobásico de potässio (KH2PO4) seco em estufa, dissolver em 150mL de água destilada e em seguida adicionar 5mL de ácido sulfuric 10 N. Completar o volume para 500mL com agua destilada e guardar em trasco escuro.
Padrões de trabalho(curva padrão). Pipetar para balões volumétricos, de 100mL, separadamente, 2,5;5,0; 7,5; 10,0 e 20,0ml da solução estoque de fósforo (1.000mg.L-1). Adicionar cerca de 50mL. de água destilada e em seguida 4,0ml. de ácido sulfúrico 10 N. Completar o volume e transferir para frascos apropriados. As soluções preparadas conforme descritas acima contëm respectivamente 25, 50, 75, 100 e 200mgL-1 de fósforo. O padräo zero é preparado de forma semelhante aos demais, porém sem a adição da solução estoque de fósforo.
Microbiologia
CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS (37º C) E COLIFORMES FECAIS (45º C ou termotolerante)
A contagem de coliformes) é baseada nas características do grupo: bastonete Gramnegativo,
que produzem ácido e gás a partir de lactose.
Coliformes Totais: Habitat intestinal e ambiental: Escherichia coli, Enterobacter, Citrobacter,
Klebsiella
Coliformes Fecais: Habitat excluisivamente intestinal: Escherichia coli
Procedimento:
Método: tubos múltiplos (Número mais provável – NMP)
1. Teste presuntivo
Presume-se que os microrganismos que crescem e produzem gás a partir da lactose sejam coliformes
Meio de enriquecimento: caldo lauryl sulfato triptose
· Inocular três tubos (tubos de Durham invertido no seu interior) contendo 10 mL de caldo lauryl sulfato triptose (dupla concentração) com 10 mL da amostra.
· Inocular três tubos (tubos de Durham invertido no seu interior) contendo 10 mL de caldo lauryl sulfato tripose (concentração normal) com 1m L da amostra.
· Inocular três tubos (tubos de Durham invertido no seu interior) contendo 10mL de caldo lauryl sulfato triptose (concentração normal) com 0,1 mL da amostra
· Incubar a bateria com as séries te tubos a 37º C/48h
· Fazer a leitura, considerando positivos os tubos com presença de gás no interior dos tubos de Durham
2- Teste confirmativo
Coliformes Totais
Meio seletivo caldo lactosado – bile verde brilhante. Neste meio, os sais de bile têm a função de inibir o crescimento de bactérias não entéricas e o verde brilhante de inibir as bactérias Gram-positivas,selecionando desta forma os coliformes.
· Imediatamente após a leitura do teste presuntivo,transferir com uma alça de platina uma alíquota de cada tubo positivo para tubos ( tubos de Durham invertidos no seu interior) contendo caldo lactosado bile verde brilhante.
· Incubar a 35º C por 48h
· Fazer a leitura identificando como positivos os tubos com gás.
· Usar a tabela de NMP para verificar qual o número mais provável de coliformes totais por grama ou mL.
Coliformes Fecais
Os coliformes fecais têm em seu ambiente natural (trato intestinal) temperaturas mais elevadas. Eles são capazes de crescer a 44,5º C, possibilitando, assim,de uma forma prática, serem avaliados separadamente.
· Imediatamente após a leitura do teste presuntivo, transferir com a alça de platina uma porção de cada tubo positivo para tubos contendo caldo EC (Escherichia coli) (tubos de Durham invertido no seu interior).
· Incubar a 44,5 (pescado) ou 45º C por 24h. Utilizar o banho-maria
Fazer leitura identificando como positivo os tubos com gás
Usar a tabela de NMP para verificar qual o número mais provável de coliformes fecais/g ou mL
PESQUISA de Salmonella sp
Todas as salmonelas são consideradas potencialmente patogênicas para o homem. A única via
de entrada destes microrganismos no corpo humano é a oral, por isso é de suma importância a
análise dos alimentos para detectar sua presença.
A metodologia recomendada segue 4 etapas que podem ser aplicadas a qualquer tipo de alimentos
Pré- enriquecimento em caldo não seletivo; objetiva a recuperação de células injuriadas
· Adicionar 25g ou mL da amostra em 225 mL do caldo de pré- enriquecimento (diluição 10-1).
Homogeneizar no liquidificador por 60 seg. Verter todo material em erlenmyer estéril e incubar a 35º C/ 24h. Para uso geral recomenda-se o caldo lactosado ou a água peptonada 0,1% tamponada e para produtos lácteos água destilada verde brilhante.
Enriquecimento Seletivo: estimula a multiplicação de salmonelas e reduz ou inibe o crescimento dos organismos competitivos, tais como coliformes, Proteus e Pseudomonas
· Transferir 1,0 mL para 10mL de caldo Tetrationato (TT) .Incubar a 35º C/24h.
Plaqueamento seletivo diferencial: Objetiva promover o desenvolvimento preferencial de colônias de Salmonella, com características típicas que as distingam dos competidores, para posterior confirmação sorológica e bioquímica.
· Agitar o tubo de enriquecimento seletivo e estriar uma alçada do caldo tetrationato em placas de Agar entérico de Hectoen (HE) e Ágar xilose lisina descarboxilado (XLD). Incubar as placas invertidas a 35º C/24h. Verificar se há desenvolvimento de colônias típicas de Salmonella:
Agar HE: colônias transparentes, verde-azuladas, com ou sem centro preto.
Agar XLD: colônias transparentes, cor de rosa escuro,com ou sem centro preto.
Confirmação Preliminar das colônias típicas de Salmonella
Com o auxílio de uma agulha de inoculação, remover uma porção da massa de células, do
centro da colônia típica (no mínimo 2 colônia) e semear em tubos inclinados de Agar Lisina
Ferro (LIA) e Ágar Tríplice Açúcar.. A semeadura deve ser feita por picada e estrias na rampa.
Incubar os tubos a 35º C/24h. Observar reação típica:
TSI- rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo),com ou sem produção de H2S (escurecimento do agar). Reação atípica que não deve ser descartada se as demais reaçãoes em LIA se apresentarem típicas: rampa e fundo ácidos (amarelos), com ou sem produção de H2S.
LIA – fundo e rampa alcalinos (púrpura, sem alteração da cor do meio), com ou sem produção de H2S. Reação atípica, que não devem ser descartada se as demais reaçãoes em TSI se
apresentarem típicas: fundo amarelado com rampa alcalina, com ou sem produção de H2S.
Teste bioquímico
· Meio SIM – Transferir com uma agulha através de picada a cultura de colôcia típicado TSI para o meio. Incubar 35º C/24h.
· Produção de H2S: escurecimento do agar. Salmonela pode produzir ou não H2S
· Motilidade : crescimento na região da picada – imóvel
crescimento em todo agar ou ao redor da região da picada: móvel. Salmonela é móvel
Após a leitura do H2S e da motilidade, adicionar 5 gotas de reativo de Erlich ou Kovacs no tubo.
Aparecimento de cor rósea: indol positivo.
Aparecimento de cor amarelado: indol negativo. Salmonela é indol negativo
Teste do vermelho de metila (VM) 3 Voges-Proskauer (VP): Transferir uma alçada com inoculo da cultura em TSI, para dois tubo com caldo 3mL VM-VP e incubar a 35º C/48h para VP e 96h VM. Após o período de incubação , no tubo VP adicionar 1,8 mL de solução de alfa naftol 5% e agitar. Adicionar em seguida 0,6 mL de solução KOH 40%, agitar. Observar até 1 hora.
Desenvolvimento de cor vermelha ou rosea – teste positivo
Permanência do meio na cor do reagente (amarelado ou ligeiramente esverdeado) – teste negativo. A maioria das Salmonelas são VP negativas
No tubo VM – adicionar 5 gotas de solução vermelho metila e observar imediatamente se o meio adquire uma coloração vermelha – teste positivo ou amarela _ teste negativo. A maioria das cepas de Salmonela são VM positivas.
Teste do citrato:
Com uma agulha de inoculação, transferir um inoculo da cultura para um tubo de agar citrato de Simmons inclinado, estriando a rampa e picando o fundo. Incubar a 35º C/ 96h. Observar o
crescimento:
Cor azul: citrato positivo: a maioria das cepas de Salmonelas são citrato positivo
Cor do meio inalterado: citrato negativo
Teste de urease:
transferir uma alçada da cultura crescida no TSI para um tubo com caldo uréia de Chistensen.
Incubar 35º C/24h. Observar crescimento
Cor do meio original (pêssego): teste negativo. A maioria das cepas de Salmonelas são ureases negativa
Cor do meio rosa escuro: teste positivo
Teste da descarboxilação da lisina em caldo
Transferir uma alçada da cultura em TSI para um tubo com caldo lisina (previamente desaerado). Cobrir a superfície do caldo com 2 q 3 ml de parafina ou óleo mineral estéril. Incubar a 35º C /48h h. Observar:
Alteração do meio de esverdeado para púrpura azulado : testepositivo- As cepas de Salmonelas são lisinas positivas
alteração do meio par cor amarela (ácida): tesete negativo.
Reação sorológica frente ao anti-soro polivalente “O”
Ressuspender o cultivo obtido em ágar estoque inclinado (de 18 a 24 horas) em aproximadamente 2 mL de solução salina 0,85%.
Em lâmina de vidro, placa de Petri ou placa de Huddleson, depositar separadamente uma gota
de solução salina 2% e uma gota do soro anti-Salmonella polivalente "O", diretamente do frasco. Em seguida, acrescentar a cada uma delas uma gota da suspensão em teste. Com movimentos circulares, realizar a leitura com iluminação sobre fundo escuro em 1 a 2
minutos. Classificar a reação do seguinte modo:
Positiva: presença de aglutinação somente na mistura cultivo + anti-soro;
Negativa: ausência de aglutinação em ambas as misturas;
Não específica: presença de aglutinação em ambas as misturas (formas rugosas).