Princípios de Microscopia e Aplicações

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Princípios de Microscopia e Aplicações 
 A verdadeira complexidade do ambiente que nos circunda não foi 
estimada até a observação dos primeiros microrganismos através das 
lentes de um microscópio. Sem dúvida, o uso da microscopia ajudou a 
definir as relações entre uma diversidade de organismos, variando 
desde os menores vírus constituídos de algumas poucas proteínas e 
informação genética mínima até parasitas de quase 10 metros de 
comprimento. 
 Em geral, a microscopia é utilizada na microbiologia com dois 
propósitos básicos: a detecção inicial de micróbios e sua identificação 
preliminar ou definitiva. O exame microscópico das amostras clínicas é 
utilizado para detectar células bacterianas, fungos, parasitas (ovos, 
larvas ou formas adultas) e corpúsculos de inclusões virais presentes 
nas células infectadas. 
 Propriedades morfológicas características podem ser utilizadas na 
identificação preliminar da maioria das bactérias sendo utilizadas para 
a identificação definitiva de muitos fungos e parasitas. 
 A detecção microscópica de organismos corados com anticorpos 
marcados com corantes fluorescentes ou outros marcadores provou ser 
muito útil para a identificação específica de muitos organismos. Em 
geral cinco métodos microscópicos são utilizados: 
 Microscopia de campo-claro (luz) 
 Microscopia de campo escuro 
 Microscopia de contraste de fase 
 Microscopia fluorescente 
 Microscopia eletrônica 
 Microscopia de Campo Claro (Luz) 
Os componentes básicos dos microscópios ópticos consistem de uma 
fonte de luz utilizada para iluminar a amostra colocada em uma base, 
um condensador utilizado para focalizar a luz na amostra e dois 
sistemas de lentes (lentes objetivas e lentes oculares) utilizadas para 
aumentar a imagem da amostra. A imagem é ampliada primeiro pelas 
lentes objetivas, e então pelas lentes oculares. O aumento total da 
imagem é o produto do aumento da lente objetiva pelo aumento da 
lente ocular. 
 Três lentes objetivas diferentes são utilizadas comumente: de 
baixo aumento (10 ×), que pode ser utilizada para escanear uma 
amostra; de grande aumento (40 ×), que é usada para examinar 
micróbios maiores como parasitas e fungos filamentosos; e a de imersão 
em óleo (100 ×), utilizada para observar bactérias, leveduras (estágio 
unicelular dos fungos), e detalhes morfológicos de organismos maiores e 
células. As lentes oculares podem aumentar ainda mais a imagem 
(geralmente 10 a 15×). 
 A limitação do microscópio de campo claro é a resolução da 
imagem (isto é, a habilidade de distinguir dois objetos individualizados). 
O poder de resolução de um microscópio é determinado pelo 
comprimento da onda de luz utilizada para iluminar a amostra e o 
ângulo de penetração desta luz nas lentes objetivas (conhecido como 
abertura numérica). 
 O poder de resolução aumenta quando se coloca óleo entre a 
lente objetiva (tipicamente a lente de 100 vezes) e a amostra, devido à 
redução da dispersão da luz pelo óleo. Os melhores microscópios de 
campo claro têm poder de resolução de aproximadamente 0,2μm, 
permitindo a visualização da maioria das bactérias, mas não dos vírus. 
 Embora a maioria dos organismos maiores e das bactérias possa 
ser vista com microscopia de campo claro, os índices de refração dos 
organismos e do fundo são similares. Dessa forma, organismos devem ser 
corados com um corante para que possam ser observados ou deve-se 
utilizar um método microscópico alternativo. 
 Microscopia de Campo Escuro 
 As mesmas lentes objetiva e ocular utilizadas nos microscópios de 
campo claro são utilizadas no microscópio de campo escuro; entretanto, 
um condensador especial é utilizado para impedir que a luz transmitida 
ilumine diretamente a amostra. Somente a luz oblíqua e dispersa atinge 
a amostra passando pelo sistema de lentes fazendo com que a amostra 
se torne iluminada brilhantemente contra um fundo escuro. 
 A vantagem desse método é que o poder de resolução da 
microscopia de campo escuro é significativamente superior quando 
comparada com a microscopia de campo claro (i.e., 0,02μm versus 
0,2μm), tornando possível a detecção de bactérias extremamente finas, 
como o Treponema pallidum (agente etiológico da sífilis) e a Leptospira 
spp. (leptospirose). 
 A desvantagem desse método é que a luz passa ao redor, e não 
através do organismo, e sua estrutura interna não pode ser estudada. 
Microscopia de Contraste de Fase 
 A microscopia de contraste de fase permite o exame dos detalhes 
internos dos micróbios. Nesta forma de microscopia, quando feixes de 
luz passam através de objetos de diferentes densidades, o comprimento 
de onda de um feixe se move fora de “fase” em relação ao outro feixe 
de luz (i.e., o feixe que passa através do material mais denso é mais 
atrasado que o outro feixe). 
 Através do uso de anéis anulares no condensador e na lente 
objetiva, as diferenças na fase são ampliadas, de modo que a luz em 
fase aparece mais brilhante que a luz fora de fase. Isto cria uma 
imagem tridimensional do organismo ou amostra, permitindo uma 
análise mais detalhada das estruturas internas. 
Microscopia de Fluorescência 
 Alguns compostos denominados fluorocromos podem absorver 
comprimentos de onda curtos da luz ultravioleta ou ultra-azul e emitir 
energia no comprimento de onda maior visível. 
 Embora alguns microrganismos apresentem fluorescência natural 
(autofluorescência) a microscopia de fluorescência envolve tipicamente 
a coloração de organismos com corantes fluorescentes e exames com 
um microscópio fluorescente especialmente projetado. 
 O microscópio utiliza uma lâmpada de mercúrio, de halogênio ou 
de vapor de xenônio de alta pressão que emite um comprimento de 
onda mais curto daquele emitido pelo microscópio de campo claro 
tradicional. 
 Vários filtros são utilizados para bloquear o calor gerado pelas 
lâmpadas, eliminar a luz infravermelha, e selecionar o comprimento de 
onda apropriado para excitar o fluorocromo. A luz emitida a partir do 
fluorocromo é amplificada através das lentes objetiva e ocular 
tradicionais. Amostras e organismos corados com os fluorocromos 
aparecem iluminados brilhantemente contra um fundo escuro, embora 
as cores variem dependendo do fluorocromo utilizado. 
 O contraste entre o organismo e o fundo é grande o bastante 
para que a amostra possa ser rapidamente visualizada em baixo 
aumento, e o material possa ser examinado em grande aumento uma 
vez que a fluorescência foi detectada. 
Microscopia Eletrônica 
 Diferentemente de outras formas de microscopia, nos microscópios 
eletrônicos são utilizados espirais magnéticas (no lugar das lentes) para 
direcionar um feixe de elétrons de um filamento de tungstênio através 
da amostra em direção à tela. Como um comprimento de luz muito mais 
curto é utilizado, o aumento e a resolução são notavelmente 
aumentados. 
 Partículas virais individuais (contrastando com os corpúsculos de 
inclusão virais) só podem ser observadas com a microscopia eletrônica. 
Normalmente, as amostras são coradas e cobertas com íons metálicos 
para criar o contraste. 
 Existem dois tipos de microscopia eletrônica: o microscópio 
eletrônico de transmissão, em que os elétrons semelhantes à luz passam 
diretamente através da amostra, e o microscópio eletrônico de 
varredura, que os elétrons encobrem a superfície da amostra em ângulo 
e uma imagem tridimensional é produzida.