Sequenciamento do DNA

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Sequenciamento do DNA 
Introdução 
• Trata-se da identificação da ordem exata 
dos pares de bases (A, T C e G), em um 
segmento de DNA; 
• É um processo de imensa importância ao 
permitir o conhecimento da sequência de 
bases de um gene, fornecendo informações 
sobre sua estrutura, função e relação 
evolutiva com outros genes; 
• Tecnologias de primeira geração: 
 - Método de Maxam e Gilbert (1977): 
método de degradação química; 
 - Método de Sanger (1977): método 
enzimático ou de término da cadeia por 
adição de um dideonucleotídeo (ddNTP). 
 
Tecnologias do 
sequenciamento 
→ Tecnologias de primeira 
geração: 
Método de Maxam e Gilbert (1977): 
• Ele determina a sequência das bases 
através da clivagem química da terminação 
5’ dos fragmentos de DNA marcados 
radiotivamente; 
• Estes fragmentos clivados são corridos 
em eletroforese em gel e separados de 
acordo com seu tamanho. 
 
Método de Sanger (1977): 
• Utiliza ddNTPs, análogos químicos dos 
dNTPs, misturando-os em uma reação de 
PCR; 
• A síntese da nova fita de DNA continua 
até que um dos ddNTPs seja incorporado 
(etapa de elongação termina), já que, os 
análogos (ddNTP’s) não possuem a 
hidroxila 3’, que é necessário para a 
extensão das cadeias de DNA; 
• Ele incorporou aos reagentes padrões 
para uma técnica de PCR a adição dos 
ddNTPs marcados radioativamente; 
• Cada vez que um ciclo de PCR era 
finalizado, um fragmento de DNA de 
tamanho distinto poderia ser formado; 
• Essa variação dependia do 
incorporamento de um dNTP ou um 
ddNTP. Caso um ddNTP fosse 
incorporado, pela falta da hidroxila no 
carbono 3’ da pentose, o processo de 
extensão da cadeia crescente é 
interrompido, de forma que, essa hidroxila 
é necessária para dar continuidade ao 
processo; 
• Ao misturar os ddNTPs marcados 
radioativamente numa reação de PCR, a 
síntese da cadeia pelos dNTPs continua até 
que um dos análogos serem incorporados; 
• Cada reação vai terminar contendo uma 
reação em mistura com fitas de DNA de 
diversos comprimentos, todas terminadas 
com o ddNTP marcado para aquela reação; 
• Após os ciclos de PCR, as amostras dos 
tubos com os ddNTP’s são aplicadas em 
canaletas individualizadas de gel de 
acrilamida. Então, é feita a eletroforese e a 
leitura das bandas de baixo para cima 
determina a sequência correta da molécula 
de DNA em sua fita complementar; 
• Por não utilizar de computadores, ficou 
conhecida como uma técnica manual. 
 
Método semi-automatizado (1986): 
• Aprimoramento do método de Sanger; 
• O princípio do método permaneceu o 
mesmo; 
Marianne Barone (15A) Disciplina – Prof. Marianne Barone (15A) Biologia Molecular – Prof. Jerusa Arantes 
• Não há a utilização de compostos 
radioativos, assim, tornou-se uma técnica 
mais simples, rápida e segura; 
• Foram adicionados aos ddNTPs corantes 
que são capazes de emitir fluorescência 
quando excitados em comprimento de 
onda; 
• Com a consequente incorporação dos 
ddNTPs marcados com a fluorescência, as 
reações ocorrem em um tubo único e o 
conteúdo pode ser aplicado em uma única 
canaleta, fazendo com que o número de 
amostras analisados por corrida fosse 4 
vezes maior. 
 
Método automatizado (anos 90): 
• Os géis foram substituídos por capilares 
preenchidos por polímeros onde os 
fragmentos de DNA são separados em alta 
velocidade; 
• As amostras são aplicadas, através de um 
sistema de eletroinjeção diretamente nos 
capilares; 
• Os fragmentos começam a migrar e 
encontram, num determinado ponto, um 
feixe de raios laser que excita os 
fluoróforos presentes na extremidade 
3 ́ de cada fragmento fazendo com que 
estes emitam fluorescência característica 
de um dos quatro tipos de fluoróforos; 
• Um detector registra esta fluorescência e 
a transmite para um computador que 
possui um software capaz de converter 
fluorescência em picos coloridos, sendo 
utilizado uma única cor para cada um dos 4 
tipos de nucleotídeos. Este procedimento é 
efetuado para cada fragmento no gel; 
• No final do processo, o software gera um 
cromatograma que corresponde a 
sequência de DNA complementar ao DNA 
molde utilizado; 
• O DNA alvo é copiado muitas vezes 
produzindo fragmentos de comprimentos 
diferentes; 
• Nucleotídeos “terminadores de cadeia” 
fluorescentes marcam os finais dos 
fragmentos e permitem que a sequência 
seja determinada; 
• Vantagens: possui alta confiabilidade, 
com possibilidade de leituras com até 1Kb, 
apresentando baixo custo por amostra e 
ideal para estudo de genes específicos; 
• Desvantagens: baixo throughput (taxa de 
transferência), grande dificuldade para 
sequenciar genomas, transcriptomas e 
metagenomas e ele atende no máximo 96 
amostras por vez; 
• Permite sequencias 700 nucleotídeos 
consecutivos por fragmento; 
• A fragmentação pode ser feita por: uso de 
enzimas de restrição ou quebra aleatória 
por fragmentação mecânica do genoma a 
ser sequenciado; 
• Esse método foi utilizado no Projeto 
Genoma Humano, que sequenciou o 
genoma humano, sendo concluído em 
2003, com o custo de 300 milhões de 
dólares, na época. 
 
→ Técnicas de sequenciamento de 
nova geração: 
• Com o passar dos anos, surgiram novas 
técnicas de sequenciamento, chamadas de 
INGs, na segunda e terceira gerações; 
• Elas possuem um menor custo, 
sequenciando uma maior quantidade em 
um menor tempo; 
• Os sequenciadores de 2ª geração podiam 
fazer o trabalho de 30.000 outros, baseados 
na metodologia de Sanger; 
• A automação das tecnologias de 
sequenciamento resultou na diminuição 
dos custos, permitindo que houvesse uma 
maior ocorrência de sequenciamentos e do 
lançamento de projetos genomas em 
laboratórios menores ao redor do mundo. 
 
Next Generation Sequencing, NGS (2005): 
• 2ª geração; 
• A nova geração começou com o sistema 
desenvolvido pela Roche-454 que 
sequenciou o genoma inteiro da bactéria 
Mycoplasma genitalium; 
• Métodos de segunda geração: Roche-
454, como Ion Torrent e Illumina; 
• Métodos de Terceira geração: Pacific 
Biosciences (PacBio) e Oxford Nanopore; 
• Todos têm como principal característica o 
processamento paralelo massivo de 
fragmentos de DNA; 
• Enquanto o sequenciador que utiliza 
eletroforese 96 fragmentos por vez, os 
sequenciadores de nova geração podem ler 
até bilhões de fragmentos 
simultaneamente. 
 
Pirosequenciamento – Roche-454 (2005): 
• 2ª geração; 
• Ele dispensa a clonagem e tem baixo 
custo, além de ser cerca de 100 vezes mais 
rápido que o método de Sanger; 
• Sua eficiência e rapidez comprovadas 
pelo genoma da bactéria Mycoplasma 
genitalium (96% de cobertura e 99.6% de 
precisão), em um período de 
sequenciamento 4 horas; 
• Seu preparo pode ser dividido em 3 
etapas: preparo da amostra, PCR em 
emulsão e sequenciamento; 
• No preparo da amostra, o DNA é 
fragmentado aleatoriamente e ligado aos 
adaptadores em suas extremidades, que 
permitem que os fragmentos ligados a 
esses adaptadores possam ser separados 
em uma biblioteca de DNA fita simples; 
 
• No PCR em emulsão, os fragmentos 
obtidos são ligados a microesferas 
magnéticas por meio do pareamento do 
adaptador “B” com sequências curtas 
complementares presentes na superfície da 
esfera, onde ocorrerá a amplificação do 
segmento; 
 - O adaptador “A” servirá de molde para 
o anelamento do primer responsável pelo 
início da amplificação; 
 - Desta forma, as microesferas vão agir 
como reatores de amplificação individual, 
produzindo milhares de cópia de um único 
molde; 
 
• No sequenciamento as microesferas 
ligadas as sequências alvo da fita simples 
são captadas individualmente e colocadas 
no suporte do sequenciamento e, então, são 
fornecidos reagentes para a reação do 
pirosequenciamento; 
 - Então, cada nucleotídeo incorporado nos 
poços da placa de sequenciamento irá 
liberar um pirofosfato, que será convertido 
em luz e, assim, registrado na forma de 
pirograma; 
 - O pirograma são decodificados, 
resultando em uma sequência única de 
nucleotídeo que representa cada bead; 
 - As microesferassão adicionadas a uma 
placa, na última etapa, de forma que, cada 
orifício da placa receba uma microesfera; 
 - Posteriormente, são adicionados os 
reagentes necessários para a amplificação 
do DNA. O pirofosfato inorgânico (PPI) é 
liberado a cada incorporação de 
nucleotídeo complementar a fita molde; 
 - Este PPI livre é convertido pela enzima 
ATP sulfurilase em ATP, que, por sua vez, 
fornece energia para oxidar a luciferina em 
oxiluciferina e, como consequência dessa 
reação, ocorre a liberação de luz, então, a 
cada incorporação de nucleotídeo a cadeia 
de DNA nascente, será emitida luz que é 
convertida em pirograma, este que é lido e 
permite identificar a sequência de 
nucleotídeo do DNA molde; 
 
• Com o pirosequenciamento, foi possível 
o sequenciamento de DNA de organismos 
já extintos, a partir de quantidades ínfimas 
de material genético, como o genoma de 
mamute; 
• O pirosequenciamento foi utilizado em 
pesquisas com genômica microbiana, 
análise de regulação gênica, transcritomas, 
pequenos RNAs (miRNA, siRNA), 
metagenômica e diversidade ambiental, 
além do contínuo sequenciamento do 
genoma humano e outros genomas 
completos. 
 
Plataforma Illumina (2008): 
• 2ª geração; 
• Sequenciamento por síntese (ponte) e 
consiste em fragmentar o DNA de 
interesse; 
• O sequenciamento Illumina é o mais 
amplamente utilizado no mundo 
atualmente pois tem possibilidade de 
multiplexagem de milhares de amostras em 
uma única corrida, juntamente com os 
menores custos e taxas de erro; 
• Pode gerar 20 bilhões de bases 
sequenciadas entre 19-40h (grandes 
genomas); 
• Possui uma ampla aplicação em 
pesquisas e desenvolvimento nas áreas de 
diagnóstico molecular, oncologia, genética 
microbiana, doenças complexas, genômica, 
entre inúmeras outras; 
• O sequenciamento de DNA pode 
englobar o sequenciamento completo de 
um genoma ou de algumas partes; 
 
• A: fragmentação do DNA (com seleção 
dos segmentos de tamanho apropriado) e 
ligação de adaptadores em ambas as 
extremidades; 
• B: ligação dos fragmentos na placa de 
vidro (flowcell), que é densamente 
povoada por adaptadores complementares 
aos adaptadores contidos nos fragmentos 
de DNA, permitindo a ligação dos 
fragmentos a placa; 
• C: incorporação de nucleotídeos não 
marcados com fluorescência, até que toda a 
extensão do fragmento seja amplificada; 
• D: amplificação em ponte; 
 
• E: desnaturação do duplex; 
• F: adaptadores livres se ligam a 
adaptadores complementares, iniciando um 
novo ciclo; 
• G: cluster sendo formado com mais de 1 
milhão de cópias do mesmo fragmento; 
• H: adiciona-se os 4 tipos de 
didesoxinucleotídeos terminadores 
reversíveis contendo fluoróforos e mais a 
DNA polimerase;
 
• I: registro da imagem (incorporação do 
primeiro didesoxinucleotídeo); 
• J e K: sucessivos ciclos de incorporação 
de didesoxinucleotídeos marcados, 
incidência de raios laser, emissão de luz e 
registro de imagem; 
• L: as imagens registradas em cada ciclo 
são decodificadas para determinar a 
sequência de bases de cada cluster na 
placa. 
 
Ion Torrent (2010): 
• 2ª geração; 
• Pela plataforma do Ion Torrent a 
identificação das bases se dá 
unicamente por pH (semiconductor), e 
não por ddNTPs ou reações luminosas; 
• A amostra de interesse é colocada em 
um pequeno chip, que contém em sua 
superfície nanoporos providos de 
medidores de pH, em nanoescala. Após 
ser colocado no chip, o DNA sofre uma 
reação irreversível de ligação a esses 
nanoporos; 
• Com o DNA ligado, as bases serão 
adicionadas uma de cada vez e um ciclo 
será repetido milhares de vezes; 
• Caso a base correta seja adicionada, a 
enzima DNA polimerase agirá e um 
íon H+ será liberado, provocando um 
aumento do pH no nanoporo. Este aumento 
será detectado e, dessa forma, a sequencia 
presente em cada nanoporo será 
determinada; 
• Menos de 1 dia é necessário para se 
preparar o DNA e obter os dados do 
sequenciamento; 
• Aplicações: principalmente o 
sequenciamento de genomas, regiões-alvo 
específicas em sequenciamentos de 
bibliotecas de amplicons e em exomas; 
• É bastante utilizada para detecção de 
variantes de DNA, como SNPs e na 
identificação de patógenos microbianos. 
 
Nanoporo (2012): 
• 3ª geração; 
• Sequenciamento baseado na análise do 
sinal elétrico gerado pela passagem de um 
fragmento de DNA por um poro proteico 
transmembrânico; 
• Baseia-se na leitura de uma molécula de 
DNA conforme esta atravessa o nanoporo. 
Mais especificamente, o sequenciador é 
composto por flow cells, onde há uma 
membrana contendo milhares de poros; 
• Após a preparação das bibliotecas, é 
aplicado uma diferença de potencial 
entre os dois lados da membrana gerando 
uma corrente iônica que passa pelos poros 
e é medida por sensores do aparelho; 
• Essa corrente é alterada quando uma 
molécula de DNA atravessa o poro, e 
cada nucleotídeo (A, C, T ou G) muda a 
corrente com uma intensidade diferente, 
sendo possível identificar todas as bases de 
uma molécula inteira; 
• MinION: é um sequenciador capaz de 
gerar grandes quantidades de dados, com 
um preparo de amostra simples resultando 
em longas leituras a um baixo custo. É um 
dispositivo portátil, pequeno, capaz de 
sequenciar 1 Gb de DNA em um tempo de 
corrida de 48h; 
• Desvantagens: menor rendimento, com 
taxa de erro em aproximadamente 
12%; 
• Aplica-se ao sequenciamento para 
vigilância de patógenos, detecção de 
mutações-alvo, metagenômica, genomas 
bacterianos e virais. 
 
Funções 
• Graças à tecnologia de sequenciamento, 
pesquisadores atualmente são capazes de 
comparar grandes extensões de DNA (1 
milhão de bases ou mais) de indivíduos 
distintos, de maneira mais rápida e barata; 
• A habilidade de sequenciar o genoma 
mais rapidamente e com melhor custo-
benefício cria o potencial para diagnóstico 
e terapias de doenças genéticas; 
• Apesar da utilização de sequenciamento 
de DNA em consultórios médicos ainda 
estar distante da realidade, alguns centros 
médicos e de pesquisa já utilizam a técnica 
para detectar (e prevenir) algumas doenças 
em pacientes de risco, como certos tipos de 
câncer; 
• O sequenciamento de DNA também é 
utilizado em diversas áreas da ciência, 
como em estudos evolutivos, na 
compreensão da relação entre organismos 
distintos e sua evolução.