Biologia Molecular - PCR

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PCrPCR
Polimerase Chain Reaction: Amplificação gênica
sequencial de fragmentos de DNA pré
determinados e específicos de um determinado
organismo.
Potencial de amplificação: Até cerca de um
milhão de vezes.
Uma vez amplificada, a sequência de nucleotídeos
poderá ser detectada por eletroforese em gel de
poliacrilamida.
Obs.: PCR é a sigla para reação da polimerase em 
 cadeia. Ela visa reproduzir, aumentar, sequências de
fragmentos de DNA que são predeterminadas e
específicas. Como há uma amplificação muito grande 
 desse material genético, é preciso determinar 
 exatamente o que se está procurando, para evitar
resultados falso positivos ou contaminações. Portanto,
a etapa de análise prévia ao processo de PCR é muito
importante.
Obs.: A eletroforese separa, de acordo com o peso
molecular, as diferentes bandas de sequências de
nucleotídeos que foram amplificados com a reação de
PCR.
Obs.: A enzima DNA polimerase consegue reproduzir 
cópias do DNA empregando os nucleotídeos. Para
que a reação possa ocorrer a DNA polimerase necessita
de uma fita de DNA que será copiada e uma região 
 iniciação, ou seja, o ponto a partir de qual
queremos que se inicie a cópia.
Essa região é estabelecida com o uso de um 
 primer, que é uma sequência de bases nucleicas
que se liga em uma hidroxila livre.
A técnica de PCR nada mais é do que um processo em
larga escala de uma reação que ocorre naturalmente
em nosso organismo.
Etapas do PCREtapas do PCR
1. Desnaturação
O DNA genômico contendo a sequência a ser 
 amplificada é desnaturado por aquecimento acima 
 de 94ºC por cerca de 30 segundos. A dupla fita é 
 aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única.
Obs.: O DNA é uma dupla fita constituída por duas 
 cadeias complementares. No formato de dupla fita, 
 o primer não consegue se ligar na região de 
 iniciação. É necessário quebrar a ligação entre as
duas fitas, formando uma fita simples, para que seja
possível a ligação do primer. A ligação é quebrada por
meio de muito calor.
O processo de desnaturação é o que demanda maior
temperatura.
2. Anelamento ou Hibridização
Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou
primers (uma fita de DNA específica para o gene que 
se quer estudar) complementam a fita oposta da 
 sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um
deles é complementar à sequência em uma fita da
dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à 
 sequência na outra fita. O molde é determinado 
 pela posição dos iniciadores que se anelam à fita. Essa
etapa ocorre a uma temperatura de 60ºC (varia de
acordo com o primer utilizado).
Obs.: A partir do ponto que o primer foi ligado, irá
se iniciar a interpretação de que aquele é o molde
para a reação de PCR. Portanto, é o primer que
estabelece o molde.
Primer é a palavra-chave da segunda etapa.
São utilizados 2 primers para cada molécula de DNA
dupla fita.
3. Extensão ou Polimerização
Com o molde já identificado, a enzima Taq-DNA-
polimerase adiciona as bases complementares, 
 formando uma nova fita e então tem-se 
 novamente a duplicação da fita de DNA.
Esse processo acontece a uma temperatura de 72ºC.
Obs.: A Taq-DNA-polimerase é uma adaptação da 
 enzima DNA-polimerase elaborada para a realização 
do PCR in vitro no aparelho. Com o aquecimento do 
 DNA na fase e desnaturação, a DNA-polimerase 
 também seria desnaturada, pois uma enzima sofre
desnaturação em altas temperaturas.
Para solucionar esse problema, os pesquisadores 
 descobriram a Taq-DNA-polimerase, que é extraída
de uma bactéria muito resistente ao calor. Assim, essa
enzima não desnatura, permitindo a realização do
processo de PCR.
Temperaturas das fasesTemperaturas das fases
1ª fase: acima de 94º.
2ª fase: 60º.
3ª fase: 72º.
Na primeira fase, ocorre a maior temperatura.
A segunda fase, em regra, é a de menor temperatura.
Ciclo é reiniciado → Os produtos do primeiro ciclo 
 de replicação são desnaturados, hibridizados e
novamente replicados com DNA-polimerase. O
procedimento é repetido de 20 a 30 vezes até que o
nível desejado de amplificação seja obtido.
Obs.: Quando a terceira etapa é finalizada, volta a 
 ocorrer a primeira etapa – por isso, é considerada
uma reação em cadeia.
Trata-se de uma reação exponencial (2, 4, 8, 16...). 
 Por isso, no final de 30 ciclos, há milhões de cópias
de DNA.
Obs.: Etapa 1: Desnaturação – Ocorre acima de 94ºC.
Etapa 2: Anelamento – Dois primers ligam-se no 
 ponto de iniciação, formando o molde.
Etapa 3: Extensão ou Polimerização – Há o 
 fornecimento dos ácidos nucleicos e ocorre a ação 
 da DNA-polimerase, realizando a extensão da fita 
 do DNA, formando uma fita dupla novamente.
Para a realização do processo de PCR, é necessário 
um termociclador , que consegue realizar rápidas
mudanças de temperatura, propiciando o
acontecimento das 3 fases da reação de PCR.
Como cada etapa da reação ocorre em uma 
 temperatura específica, a reação pode ser
controlada.
O termociclador é usado para determinar o número 
 de ciclos, a temperatura e o tempo de cada etapa.
AplicaçõesAplicações
A detecção do produto de amplificação 
 normalmente é feita em eletroforese em gel de
agarose, corado com brometo de etídio, permitindo a 
visualização do DNA em transluminador de luz UV.
Existem termocicladores que, além de amplificar o
DNA, permitem a sua detecção – chamada PCR em
tempo real (qPCR ou PCR real time).
Medicina Forense.
Carga Viral.
Identificação de Patógenos em Amostras.
Paternidade.
Situações onde a quantidade de DNA disponível é
reduzida.