TCC Criopreservação de sêmen equino

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UNIVERSIDADE DE FRANCA 
 
 
 
ANA GABRIELA BATISTA DAVID 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EQUINO: REVISÃO DE 
LITERATURA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FRANCA – SÃO PAULO 
2020 
 
 
 
UNIVERSIDADE DE FRANCA 
 
 
 
ANA GABRIELA BATISTA DAVID 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EQUINO: UMA REVISÃO. 
 
 
 
 
 
Trabalho de Conclusão de Curso 
apresentado como exigência parcial para 
obtenção de grau no Curso de Medicina 
Veterinária da Universidade de Franca. 
 
Orientador: Prof. Dr. Jair Camargo 
Ferreira 
 
 
 
 
 
FRANCA – SÃO PAULO 
2020 
 
 
ANA GABRIELA BATISTA DAVID 
 
 
 
 
 
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EQUINO: UMA REVISÃO. 
 
 
 
 
Este Trabalho Conclusão de Curso foi julgado aprovado para obtenção do título de 
Bacharel em Medicina Veterinária pela Universidade de Franca. 
 
Franca-SP, 17 de novembro de 2020. 
 
 
Banca examinadora: 
 
 
________________________________________ 
Prof. Dr. Jair Camargo Ferreira 
 
________________________________________ 
Prof. Ms. Vitor Foroni Casas 
 
________________________________________ 
Ms. Samanta Maria Faleiros Correa 
 
 
 
 
 
FRANCA – SÃO PAULO 
2020 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Primeiramente agradeço aos meus pais Ronei e Amarildo e meu irmão João Lucas, 
por todo amor e dedicação que tiveram comigo, por contribuírem na minha formação 
pessoal, graças a eles me tornei a pessoa que sou hoje, e por sempre me apoiar na 
realização deste sonho, que não foi fácil. 
Às minhas amigas Simone, Laura e Gabi, por todo apoio, ensinamentos e amizade. 
Essas que não mediram esforços para me incentivar e jamais se recusaram a ajudar 
no meu crescimento profissional e na realização deste trabalho, o qual não seria 
possível sem elas. 
Ao meu namorado e amigo Rafael, por me dar tanto suporte, apoio e motivação para 
continuar nos momentos difíceis e se alegrar por mim nas pequenas conquistas. Não 
há palavras para descrever tamanha gratidão por tudo o que faz por mim. 
À minha cunhada Helena, por estar ao meu lado e me ajudar tanto na etapa final 
dessa jornada. 
Às minhas irmãs de coração Marina e Isabella, as quais sou grata a Deus por ter me 
proporcionado morar com elas, por todas as noites viradas estudando juntas, por todo 
o companheirismo e por me ensinarem o real significado da amizade. Elas que foram 
essenciais no meu crescimento pessoal e na minha vida. 
Aos meus amigos, em especial Carolina que esteve ao meu lado na pior fase da 
minha graduação, e por não se importar em brigar por mim e ser sempre justa; ao 
Mazur, Francine, Danielle, Aline, Otávio, André, Laureny, Tulio e Leandro por 
tornarem a vida (universitária) mais leve. 
A todos meus professores. Em especial Lucas, Vitor, Thaís, Daniel Honsho, 
Daniel Paulino, Jair, Jesse e funcionários do Hospital Veterinário, por todo 
aprendizado que me passaram, e por tornarem possível a realização do meu sonho; 
todos foram essenciais para que isso acontecesse, sempre serei grata a vocês. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Fracassar é frequentemente uma 
condição temporária. Desistir é o que a 
torna permanente.” 
 
Marilyn vos Savant 
 
 
 
 
RESUMO 
 
A biotécnica de criopreservação de sêmen teve início há mais de 60 anos com a 
descoberta do glicerol como crioprotetor e a utilização de substâncias com a 
capacidade de proteger a célula dos danos causados pelo congelamento. A partir 
disso essa biotécnica vem sendo aprimorada ao longo dos anos e somente não teve 
avanços maiores devido à desconfianças de um longo período por parte de alguns 
criadores de cavalos. Atualmente a inseminação artificial com sêmen refrigerado e 
congelado é permitida e tornou-se muito bem aceita entre os criadores e médicos 
veterinários. A facilidade do manejo, a segurança dos animais e o melhor 
aproveitamento do potencial reprodutivo são alguns fatores contribuintes do seu 
sucesso, além outras diversas vantagens. Por muitos anos a utilização do sêmen 
congelado foi associada à baixa fertilidade, porém com o desenvolvimento de novas 
tecnologias de congelamento e com a descoberta de novas substâncias com 
propriedades crioprotetoras isso mudou. Hoje é sabido que o sêmen congelado possui 
boa fertilidade, mas deve-se levar em consideração a ampla variabilidade individual 
na congelabilidade do sêmen desses animais. O presente trabalho consiste em uma 
revisão de literatura acerca do tema de criopreservação do sêmen equino, apontando 
as vantagens e desvantagens da biotécnica, descreve a célula espermática e suas 
propriedades, os processos que o espermatozoide é submetido até o congelamento. 
Explica sobre os diluentes e os crioprotetores, o processo de congelamento e 
descongelamento e finaliza com as avaliações a serem feitas para mensurar a 
fertilidade do sêmen pós descongelamento. 
 
 
Palavras chave: biotécnica, congelamento, espermatozoide, reprodução 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
The semen cryopreservation biotechnology started more than 60 years ago with the 
discovery of glycerol as a cryoprotectant and the use of substances with the ability to 
protect the cell from damage caused by freezing. From that point on, this biotechnology 
has been improved over the years and has not had any major advances due to the 
suspicions of a long period on the part of some horse breeders. Nowadays artificial 
insemination with chilled and frozen semen is allowed and has become very well 
accepted among breeders and veterinarians. Ease of handling, animal safety and the 
best use of reproductive potential are some factors that contribute to its success, in 
addition to several other advantages. For many years the use of frozen semen has 
been associated with low fertility, but with the development of new freezing 
technologies and the discovery of new substances with cryoprotective properties this 
has changed. Today it is known that frozen semen has good fertility, but one must take 
into account the wide individual variability in the freezerability of some animal animals. 
The present work consists of a literature review on the subject of cryopreservation of 
equine semen, including the advantages and disadvantages of biotechnology, 
specifications of the sperm cell and its properties, the processes that the sperm is 
subjected to until freezing. Explains on the diluents and the cryoprotectants, the 
process of freezing and thawing and ends with as any all be made for measuring the 
fertility of semen after thawing. 
 
 
Keywords: biotechnology, freezing, sperm, reproduction. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇAO ........................................................................................... 
01 
2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................... 02 
2.1 CÉLULA ESPERMÁTICA ..................................................................... 02 
2.2 PLASMA SEMINAL .............................................................................. 04 
2.3 CAPACITAÇÃO ESPERMÁTICA E REAÇÃO ACROSSOMAL ........... 05 
2.4 CRIOPRESERVAÇÃO ......................................................................... 07 
2.5 CENTRIFUGAÇÃO .............................................................................. 09 
2.6 DILUENTES ......................................................................................... 10 
2.7 CRIOPROTETORES ............................................................................ 11 
2.7.1 Crioprotetores penetrantes ou intracelulares ..................................... 12 
2.7.2 Crioprotetores não penetrantes ou extracelulares ............................. 13 
2.8 REFRIGERAMENTO, CONGELAMENTO E DESCONGELAMENTO . 15 
2.9 AVALIAÇÃO ESPERMÁTICA ...............................................................17 
2.9.1 Motilidade e vigor ............................................................................... 18 
2.9.2 Morfologia espermática ..................................................................... 18 
2.9.3 Integridade da membrana plasmática ............................................... 19 
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................ 20 
REFERÊNCIAS ............................................................................................... 21 
 
 
 
 
 
1 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
A equinocultura teve um grande desenvolvimento no Brasil nos últimos anos, 
principalmente no âmbito esportivo (LIMA et al., 2012). Esse aumento na demanda 
fez com que técnicas fossem desenvolvidas para possibilitar o maior aproveitamento 
do potencial reprodutivo da espécie, das quais destaca-se a criopreservação de 
gametas (BRANDÃO, 2008). Por meio dessa tecnologia, tecidos são conservados em 
temperaturas inferiores ao ponto de congelamento da água com o propósito de 
preservar a viabilidade e a composição celular por tempo indeterminado (PEGG, 
2002). 
Por muito tempo, parte das associações dos criadores impediu o registro de potros 
oriundos do uso do sêmen congelado, o que dificultou avanços maiores e mais 
significativos da biotécnica de criopreservação nas últimas décadas. As alegações 
para tal reprovação eram que, poderiam expandir o número de fraudes no registro 
genealógico (ALVARENGA, 2002). Atualmente, porém, a biotécnica já é permitida e 
tem sido utilizada para a preservação de material genético de cavalos de quase todas 
as raças. 
O glicerol, pertencente à função álcool, tem apresentação líquida quando em 
temperatura ambiente, além de ser higroscópico, inodoro e viscoso. Tal composto 
orgânico tem sido utilizado como crioprotetor de espermatozoides nos últimos 60 anos 
(OLIVEIRA, 2013). 
Dentre os diversos benefícios da criopreservação de espermatozoides, pode-se 
destacar a possibilidade de criação de bancos de reserva genética, do transporte de 
amostras seminais para regiões distantes, além de permitir um maior número de 
coberturas por estação de monta sem induzir um desgaste do garanhão (WATSON, 
2000; BARRETO et al., 2008). Quando comparado com as taxas de fertilização ao se 
2 
 
 
 
utilizar sêmen resfriado ou fresco, o sêmen criopreservado de garanhões possui 
índices de sucesso inferiores. Isso se deve em parte a ampla variedade individual na 
congelabilidade de sêmen, aparentando estar associada a aspectos genéticos da 
espécie (ALMEIDA, 2006). 
Durante o processo de criopreservação, nota-se um grande estresse celular, 
especialmente em constituintes de membrana plasmática, que resultam em condições 
que diminuem a viabilidade espermática pós-descongelamento (WATSON, 2000; 
PURDY, 2006). Acredita-se que vários desses danos poderiam ser minimizados pela 
não remoção do plasma seminal, visto que esse é uma fonte de proteção natural dos 
espermatozóides. Existem várias tentativas de confirmar os benefícios da adição 
desse plasma ao espermatozóide armazenado, contudo, não avaliam o efeito direto 
na proteção contra o estresse oxidativo (ALMEIDA, 2006). 
O objetivo do presente estudo foi apresentar uma revisão de literatura sobre o 
processo de criopreservação de espermatozoides de equino. Além de apresentar a 
técnica de preservação genética, a revisão argumentou sobre os possíveis danos 
celulares induzidos pela criopreservação, assim como sobre protocolos de 
congelamento diversos e os diluentes utilizados. 
 
 
2. REVISÃO DE LITERATURA 
 
2.1 CÉLULA ESPERMÁTICA 
O espermatozoide é uma célula alongada constituída por três partes básicas: 
Cabeça, peça intermediária e cauda. Toda a característica estrutural dessa célula tem 
a função única de garantir a liberação do material genético compreendido no seu 
3 
 
 
 
núcleo para o oócito, tendo como finalidade a formação do zigoto (GARNER & HAFEZ, 
1995). 
Ao amadurecer as três porções do espermatozoide tornam-se especializadas. 
Primeiro a cabeça, região onde está presente o DNA e é essencial para a interação 
espermatozoide-oócito. A peça intermediária onde estão presentes as mitocôndrias 
que produzem a energia para a célula e o flagelo ou cauda responsáveis pela 
motilidade espermática (GADELLA et al., 2001). Na extremidade apical da cabeça do 
espermatozoide também está localizado o acrossomo, uma vesícula onde está 
presente enzimas necessárias à penetração da zona pelúcida e consecutiva 
fertilização do oócito (YANAGIMACHI, 1994). 
A superfície externa da célula espermática é revestida completamente pela 
membrana plasmática, que por sua vez é constituída por proteínas e uma bicamada 
lipídica de fosfolipídios, glicolipídios e colesterol. A membrana plasmática possui 
características de semipermeabilidade, pois é metabolicamente ativa e impermeável 
à grande parte das moléculas. Dessa forma, ela é responsável por manter o gradiente 
químico de íons e outros componentes solúveis. Proteínas específicas da membrana 
plasmática auxiliam no transporte de glicose e frutose, fontes energéticas 
imprescindíveis para a sobrevivência do espermatozoide (SILVA & GADELLA, 2006). 
Assim, a principal função da membrana plasmática é fazer a interseção de interações 
com o meio externo, controlando o influxo de água e eletrólitos (COOPER, 1996). 
Quando comparada às outras espécies, a membrana plasmática dos 
espermatozóides de cavalos contém menor quantidade de colesterol. Além disso, a 
proporção de colesterol de um indivíduo pode variar ao longo da estação reprodutiva 
e até mesmo entre os ejaculados (GADELLA et al., 2001). Essa variação na 
quantidade de colesterol pode comprometer a capacitação espermática e a fertilidade 
4 
 
 
 
do ejaculado ao ser submetido ao resfriamento ou congelamento (YANAGUIMACHI 
et al., 1994). 
Os fosfolipídios da membrana plasmática sofrem uma transição de fase líquida para 
fase gel ao serem resfriados a temperaturas inferiores a 18°C. Essa transição lipídica 
aumenta a permeabilidade da membrana, podendo inclusive resultar no seu 
rompimento (BRANDÃO, 2008). Estudos realizados por Parks e Lynch (1992), 
apontam que a adequada proporção fosfolipídios/colesterol da membrana proporciona 
maior fluidez e estabilidade durante a criopreservação. Isso porque o colesterol 
preserva o estado de fluidez em baixas temperaturas, reduzindo os danos à 
membrana (Silva e Gadella, 2006). 
Ao ser resfriada, a célula entra em um estado de quiescência. A diminuição 
metabólica resulta em preservação energética e produção de catabólitos tóxicos, 
colaborando para a conservação celular. Ao mesmo tempo em que diminui ou paralisa 
determinadas reações bioquímicas, o congelamento também pode acelerar outras, 
gerando danos severos ou até morte celular (WATSON, 2000). 
 
2.2 PLASMA SEMINAL 
O plasma seminal corresponde a cerca de 01% do volume total do ejaculado 
(WITE, 1988). O plasma é constituído por secreções oriundas do epidídimo, glândulas 
acessórias e rede testis. 
A constituição do plasma seminal varia de acordo com a fração excretada 
(KARESKOSKI & KATILA, 2008). A primeira fração é denominada pré-espermática e 
possui função de limpeza do canal uretral e lubrificação do canal vaginal. 
Normalmente ela é translúcida e tem origem da glândula bulbo uretral. A segunda 
fração tem aspecto leitoso e é rica em espermatozóides, ergotioneína e 
5 
 
 
 
glicerilfosforilcolina (GPC). Ela é constituída por secreções do epidídimo, da ampola 
do ducto deferente e próstata. Finalmente, a terceira fração contém poucos 
espermatozoides e grandes quantidades de ácido cítrico e gel. Essa última fração é 
oriunda das glândulas vesiculares e tem por função carrear os espermatozoides 
remanescentes até a uretra (AMANN & GRAHAM, 1993). 
Acredita-se que o plasma seminal cumpre diversas funções sobre o 
metabolismo espermático e no processo de fecundação.Além disso, ele auxilia no 
deslocamento das células espermáticas, exerce ação antimicrobiana e inibe a ação 
de proteases. Finalmente, o plasma seminal atua como mediador da capacitação 
espermática e da resposta inflamatória (ELZANATY et al., 2002; TROEDSSON at al., 
2005). 
Segundo Schimitt (2002), o papel do plasma seminal é contraditório, uma vez 
que o mesmo é importante para fertilização e possui ações deletérias sobre a 
conservação espermática em determinadas concentrações (KARESKOSKI & KATILA, 
2008). 
Preconizada nos protocolos de criopreservação seminal, a remoção do plasma 
antes do congelamento é benéfica para preservar a motilidade espermática pós-
descongelamento. Isso porque as altas concentrações presentes de cloreto de sódio 
no líquido seminal podem induzir danos aos espermatozóides criopreservados 
(NISHIKAWA, 1975). 
 
2.3 CAPACITAÇÃO E REAÇÃO ACROSSOMAL 
Capacitação é uma série de mudanças na sua arquitetura e metabolismo da célula 
espermática que ocorrem no trato reprodutivo da fêmea e que são essenciais para o 
processo de fertilização (ALMEIDA, 2006). Estas mudanças compreendem o aumento 
6 
 
 
 
de cálcio intracelular, níveis de AMPc, aumento na fluidez, aumento na amplitude do 
batimento flagelar, dentre outros (NEILD et al., 2005). Essa parte da capacitação é 
denominada hiperativação espermática, processo o qual é caracterizado por uma 
mudança no padrão de motilidade espermática, conferindo-lhe movimentos vigorosos 
do flagelo. Dessa forma o espermatozoide torna-se capaz de se desprender do epitélio 
do oviduto onde irá progredir até sua penetração na zona pelúcida (TÖPFER-
PETERSEN et al., 2005) 
No decorrer da passagem pelo epidídimo, o espermatozoide recebe uma camada 
glicoproteica acrescentada deproteínas do plasma seminal e liberadas durante a 
ejaculação. Essa camada tem a finalidade de preservar a integridade da membrana 
espermática durante a passagem pelo trato reprodutivo feminino (TÖPFER-
PETERSEN et al., 2005). A remoção gradual dessa camada glicoproteica resulta na 
exposição de receptores de membrana que atuam no reconhecimento e ligação na 
zona pelúcida (NEILD et al. , 2005). 
A reação acrossomal é um evento irreversível que ocorre após a capacitação 
espermática e que é induzida pela ligação do espermatozoide à zona pelúcida. No 
decorrer da reação acrossomal, a membrana plasmática e a membrana acrossomal 
externa se fundem em vários locais da porção anterior da cabeça do espermatozoide, 
o que resulta na liberação do conteúdo do acrossoma. As enzimas acrossomais, por 
sua vez, promovem a interação e penetração na zona pelúcida (ALMEIDA, 2006). 
Na criopreservação, a célula espermática passa por alterações muito 
semelhantes às ocorridas durante a capacitação, as quais podem reduzir a 
longevidade da célula criopreservada. Logo, um maior controle do momento da 
inseminação se faz necessário ao se utilizar sêmen congelado (ELLINGTON et al., 
1999). O menor tempo de sobrevivência das células criopreservadas no trato 
7 
 
 
 
reprodutivo da fêmea ocorre devido a incapacidade de se ligarem ao epitélio da tuba 
uterina para que formassem o reservatório espermático (ABAD et al., 2007). 
 
 
2.4 CRIOPRESERVAÇÃO 
A criopreservação é composta por cinco etapas: i) diluição, ii) centrifugação, iii) 
resfriamento, iv) congelamento e v) descongelamento. Ao longo desse processo, os 
espermatozoides podem sofrer danos estruturais, bioquímicos, físicos ou funcionais 
(ALMEIDA, 2006). 
A capacidade fertilizante pós-descongelação depende de um alto metabolismo, 
motilidade progressiva, enzimas acrossomais funcionais e integridade de membrana 
plasmática. A destruição dos componentes celulares, relacionada com uma, ou mais 
de tais funções, certamente diminuirá a fertilidade (AMANN & PICKETT, 1987). 
No início do processo de criopreservação, os espermatozóides sofrem um 
estresse térmico ao serem resfriados à temperatura próxima de 5°C. Caso a 
velocidade de queda de temperatura for inadequada, a célula espermática pode sofrer 
uma série de danos irreversíveis caracterizadas por um padrão anormal de motilidade 
e mudanças bioquímicas. Além disso, uma redução da taxa de glicose e na respiração 
celular, além de um aumento da permeabilidade, também induzem perdas dos 
componentes intracelulares (GRAHAM, 1996; WATSON, 2000; ALMEIDA, 2006). 
Modificações do pH, denominado efeito solução, é outro ponto crítico da 
criopreservação. Desidratação celular excessiva e aumento na concentração de 
solutos são frequentes consequências da mudanças de pH (FAHY, 1980). Para 
Zúccari (1988), há dificuldades na compreensão do efeito solução, pelo fato de 
diferentes fatores estarem implicados no processo de congelamento. Dentre eles, 
8 
 
 
 
destacam-se: i) remoção da água pura em forma de gelo, ii) concentração de solutos 
de diferentes pesos moleculares, iii) precipitação dos solutos e iv) diminuição do 
volume celular. Com exceção da precipitação de solutos, os demais fatores são 
dependentes da temperatura e intercorrem concomitantemente à congelação. 
A formação de cristais de gelo extracelulares ocorre a partir do momento em que 
a suspensão de espermatozóides é submetida a temperaturas inferiores a 0°C, o que 
eleva a concentração de sais no líquido extracelular. A migração da água intracelular 
para o meio extracelular induz uma desidratação progressiva da célula espermática. 
Logo, as células espermáticas podem sofrer uma desidratação excessiva em 
processos de congelamento excessivamente lentos. Por outro lado, congelamentos 
muito rápidos induzem a formação excessiva de cristais de gelo intracelulares, o que 
resulta em lesões de membrana irreversíveis. Portanto, a curva de queda de 
temperatura durante o congelamento deve respeitar o equilíbrio entre esses dois 
fatores (MAZUR, 1984; AMANN & PICKETT, 1987). 
Assim como o congelamento, o descongelamento deve respeitar a curva de 
temperatura afim de evitar danos celulares irreversíveis. Assim, células espermáticas 
congeladas de forma lenta devem ser descongeladas lentamente para que a mesma 
tenha tempo de se reidratar e preservar a integridade das membranas biológicas 
(SILVA & GUERRA, 2011). 
A regulação do influxo de cálcio é diretamente afetada pelo resfriamento, sendo 
que tais modificações são incompatíveis com a viabilidade espermática. (OLIVEIRA, 
2013). De forma semelhante ao que ocorre na capacitação, a entrada de cálcio na 
célula colabora para a fusão entre a membrana plasmática e a parte interna da 
membrana acrossomal externa, o que é classificado como uma maneira 
desorganizada da reação acrossômica (WATSON, 2000). 
9 
 
 
 
No momento em que o volume celular chega a um mínimo critico, a bicamada de 
fosfolipídios da membrana, se comprime muito fazendo com que sua estrutura se 
rompa, alterando funções de transporte e incapaz de manter a proteção da membrana. 
Simultaneamente as rupturas da membrana promovem uma ligação para que o gelo 
extracelular migre para o interior da célula (AMANN & PICKETT, 1987). 
Assim sendo, as lesões causadas durante todo o processo de criopreservação 
são devidos à formação de cristais de gelo no interior da célula, afetando a estrutura 
celular; concentração de soluto decorrente ao processo de desidratação, que 
acontece no meio extra e intracelular durante o congelamento e a interação entre 
esses fatores (AMANN & PICKETT, 1987). 
 
 
2.5 CENTRIFUGAÇÃO 
A centrifugação é fundamental para o processo de criopreservação de sêmen ao 
auxiliar na eliminação do plasma seminal. O sedimento altamente concentrado em 
espermatozoides formado a partir da centrifugação é essencial para o envasamento 
do sêmen nas concentrações adequadas às palhetas a serem utilizadas (DE VITA, 
2004). 
A centrifugação exige diluidores específicos e baixas forças de rotação para 
minimizar os efeitos deletérios do procedimento (JASKO, 1994). Segundo Pickett et 
al.,(1975) as centrifugações entre 370 e 829x g não tiveram efeito deletério aos 
espermatozoides. 
Antes de ser centrifugado o sêmen é diluído na proporção 1:1, com diluentes 
específicos, geralmente são utilizadas soluções a base de glicose-EDTA ou diluidores 
a base de leite (PAPA et al., 1998). Esta diluição inicial tem por finalidade calcular a 
10 
 
 
 
concentração espermática e deste modo, ajustar o volume para obter a concentração 
desejada (MCKINNON, 1996). Os melhores resultados foram observados com 
concentrações entre 100 e 200 milhões de espermatozoides/mL (NASCIMENTO, 
2006) 
Após a centrifugação, o sobrenadante é removido. Em seguida, o pellet 
constituído por um concentrado de espermatozoides deve ser ressuspendido com um 
diluidor específico para congelamento (JASKO, 1994). A seguir, é realizado o 
envasamento do sêmen diluído em paletas plásticas de 0,25mL ou 0,5mL com o 
propósito do congelamento uniforme das amostras (VIDAMENT et al., 1997). 
 
2.6 DILUENTES 
Diluentes específicos são utilizados para o congelamento de células espermáticas 
para minimizar a desestabilização dos componentes da membrana plasmática. Para 
tanto, os diluentes devem ter em sua composição crioprotetores e macromoléculas 
como fosfolipídeos e lipoproteínas, os quais possuem ação estabilizadora na 
membrana plasmática. Além disso, os diluentes devem oferecer uma fonte de 
nutriente e tamponantes (PARKS & GRAHAM, 1992; JASKO, 1994). 
Um diluidor perfeito deve manter a pressão osmótica e o equilíbrio mineral, além 
de neutralizar catabólitos espermáticos e garantir o ambiente livre de patógenos. 
Adicionalmente, é desejável que o diluente proteja o sêmen contra as variações de 
temperatura, mantenha a estabilização de membranas e não apresente toxicidade 
aos espermatozoides e a genitália feminina (AMANN & PICKETT,1987; SILVA FILHO, 
1994). 
Em equinos, os principais diluidores são a base de leite em pó desnatado, glicose 
e bicarbonato. Diluidores derivados de tal meio são adicionados a diferentes 
11 
 
 
 
constituintes, como açúcares, antibióticos, gema de ovo, aminoácidos e outros 
componentes com características favoráveis ao sêmen (SAMPER, 2007). 
Capacidade protetora de um diluente pode variar dentre indivíduos. A suspeita é 
que isso ocorra devido às diferenças na composição lipídica da membrana plasmática 
entre espécies, raças e ainda entre indivíduos da mesma espécie (HOLT, 2000). 
 
 
2.7 CRIOPROTETORES 
A ação dos crioprotetores consiste principalmente na redução do ponto de 
solidificação da solução no congelamento, proporcionando um maior tempo para a 
desidratação celular, reduzindo assim, a formação de cristais de gelo no interior da 
célula (MAZUR, 1984). Além disso, eles interagem com a membrana celular, 
aumentando a estabilidade da mesma durante as mudanças de estado (líquido e 
sólido) durante a congelação e descongelação. Finalmente, os crioprotetores 
minimizam os efeitos das elevadas concentrações osmóticas no decorrer da 
desidratação celular, onde várias moléculas se dissolvem na mistura de crioprotetor e 
água, tornando-se menos danoso para a célula (SEIDEL, 1986). 
Os crioprotetores devem ser acrescentados ao meio diluente para fornecer uma 
proteção ao espermatozoide durante os processos de congelação e descongelação. 
Ao longo dos últimos anos, uma série de substâncias tem sido utilizada na tentativa 
de proporcionar a correta proteção às células espermáticas durante tal processo 
(SQUIRES et al., 1999; ARRUDA, 2000). Segundo Alvarenga et al. (2000), somente 
uma parcela dos garanhões possuem sêmen com boa resposta à congelação. Logo, 
a busca por substâncias com funções crioprotetoras é uma realidade atual. 
12 
 
 
 
Independente da técnica e protocolos a serem realizados, a utilização de 
crioprotetores com a função de proteger as células e tecidos dos efeitos deletérios 
causado ao espermatozoide durante todo o processo da criopreservação é 
fundamental para manutenção da viabilidade espermática (ALVARENGA et al., 2005). 
Há uma divisão básica que agrupa os crioprotetores em penetrantes ou intracelulares 
e não penetrantes ou extracelulares (AMANN E PICKETT, 1987). 
 
2.7.1 Crioprotetores penetrantes ou intracelulares 
Os penetrantes possuem capacidade de atuação nos meios extra e intracelular. 
Devido ao seu pequeno tamanho molecular, crioprotetores penetrantes conseguem 
atravessar a membrana plasmática do espermatozoide (AMANN E PICKETT, 1987). 
Essa classe de crioprotetores possui atuação através de suas propriedades 
coligativas, diminuindo o ponto crioscópico intracelular. Consequentemente, uma 
quantidade mais elevada de água permaneça em seu estado líquido quando exposta 
a baixas temperaturas. Desta forma, a concentração intracelular de solutos é reduzida, 
tornando o ambiente menos deletério para a célula espermática durante o processo 
de congelação (WATSON, 1995). Dentre os crioprotetores penetrantes pode-se citar: 
Glicerol, propilenoglicol, etilenoglicerol, acetamida e outras amidas, 1,2 propanodiol e 
dimetilsulfóxido, assim como suas combinações (SOARES et al., 2009). 
Dentre os crioprotetores penentrantes, o glicerol é o mais utilizado na espécie 
equina. Após penetrar a célula, o glicerol habita na membrana celular e no citoplasma. 
Porém, seu efeito mais positivo é observado no meio extracelular. Além de exercer 
um efeito osmótico nas células, o glicerol possui efeito direto na membrana plasmática 
ao se ligar imediatamente aos fosfolipídeos da membrana, o que resulta na diminuição 
de sua fluidez e alterando na permeabilidade (OLIVEIRA et al., 2013). A concentração 
13 
 
 
 
do glicerol nos diluidores de sêmen equino, pode variar de 3,5 a 5% (COCHRAN et 
al., 1984). Dentre os efeitos negativos, o glicerol pode induzir estresse osmótico, 
mudanças na fluidez, na organização e na permeabilidade da membrana e alterações 
em sua composição lipídica (AMANN & PICKETT, 1987). 
As amidas, por sua vez, possuem menos efeitos nocivos aos espermatozoides 
(AMANN & PICKETT, 1987; GRAHAM, 1996). Tal eficácia está relacionada ao seu 
baixo peso molecular, quando comparada ao glicerol, que lhe proporciona uma maior 
permeabilidade na membrana plasmática e acrossomal, e como resultado, causa 
menor dano osmótico aos espermatozoides (MEDEIROS, 2003). As aminas 
apresentam boa eficiência na criopreservação do sêmen equino, em especial para 
garanhões que apresentam resultados desfavoráveis com o uso do glicerol 
(ALVARENGA et al., 2005). Consequentemente, sua utilização como crioprotetor é 
cada vez mais frequente na espécie (OLIVEIRA et al., 2013). 
 
2.7.2 Crioprotetores não penetrantes ou extracelulares 
Os nãos penetrantes, por sua vez, não atravessam a membrana já que possuem 
um peso molecular superior aos outros. Dentre os crioprotetores não penetrantes, 
destacam-se as proteínas presentes no leite e na gema do ovo, os açúcares (lactose, 
frutose, manose etc.) e os polímeros sintéticos como polivinilpirrolidona e 
metilcelulose (AMANN & PICKETT, 1987). 
A proteção celular desses crioprotetores ocorre por meio de mecanismos 
osmóticos, que promovem um meio hipertônico induzindo a saída de água do meio 
intracelular. Dessa forma, a desidratando da célula espermática é induzida, o que 
diminui a probabilidade de formação de cristais de gelo (AMANN & PICKETT, 1987). 
14 
 
 
 
O leite é utilizado no processo de criopreservação por possuir lactose e proteínas. 
A lactose funciona como um componente energético, enquanto que as proteínas do 
leite potencializam a atividade cinética dos espermatozoides (OLIVEIRA, 2013). O 
leite tem ainda viscosidade propícia para a manutenção dos espermatozoides no meio 
líquido com grande oferta de carboidratos, os quais são utilizados pelas células para 
produção de energia e também apresenta uma capacidade tampão (MANJUNATH, 
2012). 
De acordo com Freitas (2013), o uso somente do leite desnatadoUHT como 
diluente do sêmen para a centrifugação durante o congelamento é suficiente para 
proteger os espermatozoides. Ele avaliou 14 ejaculados, separados em dois grupos, 
grupo controle, utilizando a diluição 1:1 em meio comercial Botu-Sêmen® e o grupo 
leite, utilizando a mesma proporção 1:1 em leite desnatado UHT, para a centrifugação 
e posterior adição do crioprotetor (Botu-Crio®) para congelamento nos dois grupos. 
Após o descongelamento foram avaliadas a cinética espermática, integridade das 
membranas plasmática e acrossomal, e a viabilidade espermática, e os resultados 
demonstraram que não houve diferenças entre os meios diluentes empregados. 
A gema do ovo tem por principal característica crioprotetora a capacidade de 
diminuir os efeitos negativos do choque térmico, estabilizando as membranas 
espermáticas. Essa substância é capaz de fornecer diferentes graus de proteção aos 
espermatozoides de diversas espécies, devido à existência de diferentes 
composições lipídicas das membranas plasmáticas entre as espécies (HOLT, 2000). 
A concentração da gema de ovo pode variar de 2 a 20% nos diluidores utilizados para 
congelamento de sêmen equino, sendo adequada aos níveis de glicerol e leite 
utilizados no diluidor (CLULOW et al., 2007). 
 
15 
 
 
 
2.8 REFRIGERAÇÃO, CONGELAMENTO E DESCONGELAMENTO 
Após a centrifugação e a adição do crioprotetor, é realizada a refrigeração para 
que ocorra a estabilização da membrana plasmática da célula. As taxas de 
resfriamento são classificadas em: lentas (<0,33°C/min), médias (0,33°C/min a 
1,0°C/min) e rápidas (>1,0°C/min), até a estabilização em 5°C. (DOUGLAS-
HAMILTON et al., 1984). 
Após a refrigeração, a amostra é congelada. Não há um protocolo para uma curva 
ideal, pois existem diversos fatores que influenciam, como por exemplo, à composição 
do meio diluidor, o crioprotetor e a concentração utilizada e taxas de resfriamento 
(HEITLAND et al., 1996). 
Antes de congeladores programáveis, a maioria dos protocolos utilizava uma 
curva de congelamento rápida de -60°C/min., atingida pela exposição das palhetas 
horizontalmente, 6 cm acima do vapor de nitrogênio entre 15 e 20 minutos (AMANN 
E PICKET, 1987). A grande vantagem das máquinas de congelamento de sêmen 
atuais é a possibilidade de programação da curva de refrigeração e de congelamento. 
Após a congelação rápida, para então o armazenamento, as palhetas de sêmen são 
mergulhadas no nitrogênio líquido e, em seguidas, armazenadas (PURDY, 2006). 
Um estudo realizado por Andrade et al., (2011) utilizou cinco ejaculados de quatro 
garanhões com fertilidade comprovada. As amostras foram avaliadas com uma média 
de motilidade total de 78,31 ± 10,90% (média ± padrão desvio). Posteriormente o 
sêmen foi diluído na proporção 1:1 no extensor a base de leite desnatado e em 
seguida centrifugado a 500g por 15 minutos. Foi retirado o sobrenadante e 
acrescentado o crioprotetor até obter a concentração de 200x106 
espermatozoides/mL, em seguida as amostras foram envasadas em palhetas de 
16 
 
 
 
0,5mL e adicionadas em um sistema automático de congelação. A taxa de 
resfriamento utilizada foi de -0,25ºC/min até estabilizar em 5°C e iniciar a curva de 
congelação de -20°C/min por cinco minutos até a temperatura de -120°C. 
Subsequentemente as palhetas foram imersas em nitrogênio líquido. O 
descongelamento foi realizado em banho-maria a 37°C por 30 segundos e submetidos 
à diversas avaliações as quais apresentou bons resultados. 
Foram utilizados sêmen de dois garanhões em atividade sexual e com fertilidade 
comprovada, sendo um de seis e o outro de trinta anos de idade. O ejaculado de cada 
garanhão foi dividido em duas partes, onde uma de cada animal utilizou o diluente 
Botu-sêmen® e a outra o FR-1®, e foram classificadas como amostra “1” e “2”, 
respectivamente. Foram centrifugadas por 10 minutos a 650g e após finalizado, o 
sobrenadante foi descartado. Utilizaram-se dois tipos de crioprotetores, o Botu-Crio® 
e o FR-5® nas amostras “1” e “2”, respectivamente, seguido do envasamento em 
palhetas de 0,5mL na concentração de 50x106 espermatozoides. Dois protocolos de 
congelamento foram adotados, o primeiro foi denominado curva “A”, com a amostra 
“1” de cada garanhão. 
Utilizou-se um congelador programável onde teve início em 24°C com redução de 
0,3C°/min até 5°C, seguindo em -10°C/min até -15°C e finalmente por -25°C/min até 
os -100°C. A curva “B” foi realizada de forma manual, contendo as amostras “2”, onde 
as palhetas foram dispostas horizontalmente em vapor de nitrogênio líquido, em uma 
estande posicionada a 3 centímetros acima do nível do nitrogênio, por 20 minutos e 
em seguida mergulhadas no mesmo. Em tal sistema a taxa média de congelamento 
é de -70°C/minuto. O descongelamento foi realizado em banho-maria a 37°C por 30 
segundos, posteriormente foi feita a avaliação espermática. Conclui-se que as 
17 
 
 
 
amostras congeladas com o Botu-Crio® tiveram resultados significativamente 
superiores em todos parâmetros avaliados, quando comparadas com o diluente FR-
5® (TERRACIANO et al., 2008). 
A curva de descongelamento está intimamente relacionada à curva de 
congelamento. Quando o congelamento é realizado muito rápido, o tempo fica 
insuficiente para que a célula se desidrate de forma correta, resultando na formação 
de cristais de gelo intracelulares. Neste caso, o descongelamento também deverá ser 
realizado de maneira rápida para evitar a recristalização (fusão dos cristais de gelo) 
e, consequentemente lesão celular. Quando o congelamento é lento, há uma maior 
desidratação da célula e por isso precisa de um maior tempo de reidratação, para 
preservar sua viabilidade morfofuncional (MAZUR, 1985). 
Oliveira et., al (2019) comparou diferentes curvas de descongelamento com 
diferentes diluidores, e obteve melhores resultados com o protocolo de 
descongelamento a 37°C por 30 segundos, quando comparado a 75°C por 7 
segundos, onde no primeiro os espermatozoides apresentaram uma melhor 
motilidade progressiva média. 
 
2.9 AVALIAÇÃO ESPERMÁTICA 
Existem diferentes técnicas a serem utilizadas para determinar características 
biológicas e estruturais relacionadas com a fertilidade do sêmen. De acordo com o 
Colégio Brasileiro de Reprodução Animal no Brasil, para inseminação artificial, após 
o descongelamento as amostras de sêmen equino devem apresentar 30% de 
motilidade progressiva ≥30%, vigor ≥3 e células defeituosas ≤40%. Contudo, quanto 
mais características avaliadas, mais exata será a estimativa de fertilidade (ALMEIDA, 
18 
 
 
 
2006). Segundo Fürst (2006), as técnicas de avaliação que utilizam corantes 
específicos, microscopia eletrônica ou avaliação do comportamento do sêmen diante 
das soluções hiposmóticas são capazes de avaliar com maior precisão a capacidade 
fertilizante do gameta masculino. 
 
2.9.1 Motilidade e vigor 
A motilidade e o vigor dos espermatozoides são parâmetros utilizados 
rotineiramente para avaliar a viabilidade espermática, especialmente por serem de 
rápida execução e baixo custo (ALMEIDA, 2006). De acordo com Kátila (2001), a 
motilidade é importante por retratar diversos aspectos do metabolismo espermático. 
Entretanto, sempre deverá ser avaliada em conjunto com outros parâmetros seminais, 
a fim de estimar o potencial fertilizante do sêmen. Diversos fatores podem afetar a 
motilidade do sêmen que foi submetido ao processo de congelamento, como a 
composição do diluidor, tempo de centrifugação, taxa de resfriamento, volume da 
palheta e a concentração de espermatozoides/ml, uma vez que todos estes processos 
podem ser prejudiciais à célula espermática (HEITLAND et al., 1996). 
A avaliação da motilidade espermática também pode ser realizada através da 
Análise Espermática Assistida por Computador (CASA), com alto nível de precisão e 
de forma objetiva. Tal sistema também possibilita determinar a velocidade e o tipo de 
trajetóriados espermatozoides (GRAHAM & MOCÉ, 2005). Contudo, o elevado custo 
do equipamento e a necessidade de uma maior uniformização das características de 
cada espécie tornam esse método não viável (ALMEIDA, 2006). 
 
2.9.2 Morfologia espermática 
19 
 
 
 
Os defeitos na morfologia dos espermatozoides são divididos em maiores ou 
menores. Defeitos maiores estão relacionados com queda do potencial fecundante, 
enquanto que defeitos menores não apresentam influência direta na fecundação e 
podem ser compensados através do acréscimo de um maior volume de sêmen (RAO, 
1980). 
De acordo com Almeida (2006), a possibilidade da criopreservação interferir na 
morfologia dos espermatozoides é baixa. Todavia, uma manipulação inadequada do 
sêmen ou temperaturas inadequadas de armazenamento podem provocar alterações 
irreversíveis como danos de cauda ou acrossoma. 
 
2.9.3 Integridade da membrana plasmática 
A avaliação da integridade da membrana é realizada com o uso de corantes 
impermeáveis, onde células que emitem fluorescência indicam lesão na membrana e 
as que não emitem evidenciam que a membrana permanece intacta (BRANDÃO, 
2008). O aprimoramento de técnicas de coloração com corantes supra-vitais e 
fluorescentes aumentaram as chances de uma análise mais criteriosa da integridade 
estrutural da célula espermática (ALMEIDA, 2006). 
 
Corantes derivados da fluoresceína, a eosina e a nigrosina são utilizados 
frequentemente para avaliar a qualidade espermática de equinos. A eosina é um 
corante supra-vital que só penetra em células com danos à membrana, que ficam 
impregnadas com a cor rosa. A nigrosina faz um contraste escuro ao fundo, permitindo 
a visualização dos espermatozoides com a membrana intacta, ou seja, não corados 
pela eosina (BRITO, 2007). Todavia, a avaliação com esses corantes não é indicada 
20 
 
 
 
para amostras de sêmen criopreservado, pois a presença do crioprotetor pode 
interferir no processo de coloração (ALMEIDA, 2006). 
O teste hiposmótico permite a avaliação da integridade funcional da membrana 
do espermatozoide (FÜRST, 2006). Esse teste é embasado na capacidade da célula 
espermática de reagir quando submetido a soluções hiposmóticas. Nessas condições 
ocorre influxo de cálcio para o meio intracelular na tentativa de estabelecer o equilíbrio 
osmótico entre os meios intra e extracelular, causando aumento de volume celular e 
o dobramento de cauda (JEYENDRAN et al., 1992). 
 
 
 
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS 
O desenvolvimento das técnicas de criopreservação de sêmen tem sido de grande 
importância para a equinocultura, principalmente por possibilitar o transporte para 
longas distâncias. Além disso, a facilidade de manejo e a segurança propiciada aos 
animais também contribuem para o crescente uso de sêmen congelado. Desde seu 
surgimento, o aprimoramento contínuo da técnica ocorre por meio do 
desenvolvimento de meios diluentes, crioprotetores e diferentes curvas de 
congelamento. 
 
 
 
 
 
21 
 
 
 
 
 
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