DIAGOSTICO IMUNODIFUSAO GEL DE AGAROSE

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ - UECE
FACULDADE DE VETERINÁRIA - FAVET
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS – PPGCV
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL EM DOENÇAS PARASITÁRIAS E INFECCIOSAS
Prof. Fátima Teixeira
DIANGÓSTICO SOROLÓGICO POR IMUNODIFUSÃO EM GEL DE AGAROSE (IDGA) 
Antônia Aniellen Raianne Moises Aguiar
	
Fortaleza
2020
Artigo: “An experimental study on the vertical transmission of caprine arthritis-encephalitis virus from naturally infected females to their offspring” 
“Um estudo experimental sobre a transmissão vertical do vírus da artrite encefalite caprina de fêmeas naturalmente infectadas para seus filhos”
Autores: Marjorie Yumi Hasegawa, Maria do Carmo Custodio de Souza Hunold Lara, Eliana Monteforte Cassaro Villa Lobos, Natalia Carrillo Gaeta, Mika Hayashi, Laız Shirayama, Roberto Soares de Castro, Lilian Gregory
Periódico: Small Ruminant Research, v. 149, p. 23-27, 2017.
A artrite encefalite caprina (CAE) é uma enfermidade incurável, degenerativa, com evolução lenta e de alta prevalência nos rebanhos caprinos nacionais (ANDRIOLI et al., 2007). É uma doença causada por um vírus de RNA pertencente ao gênero Lentivirus da família Retroviridae e subfamília Lentivirinae (KING et al., 2012). A CAE é uma doença infecciosa dos caprinos, podendo ocorrer também ovinos, que geralmente se apresenta de forma crônica, caracterizada por um longo período de incubação, em que, os animais infectados passam a ser portadores permanentes do vírus. 
A doença pode se manifestar por quadros clínicos de artrite, encefalite, mastite, pneumonia e emagrecimento crônico (FRANKE, 1998). A principal consequência do CAE são as importantes perdas econômicas devido à eliminação de animais positivos devido à rápida transmissão viral, e à diminuição da produção de leite (LEITNER et al., 2010) e da qualidade do leite. As vias de transmissão mais conhecidas para a artrite encefalite caprina são pela ingestão de leite e /ou colostro contaminados, contato direto entre animais saudáveis e infectados pela presença do vírus no trato reprodutivo feminino, particularmente no útero, caracterizando-se como transmissão vertical (ADAMS et al., 1983; CAVALCANTE et al., 2013; GAETA et al., 2016).
O diagnóstico dessa infecção viral é baseado na sorologia, sendo a prova de escolha a imunodifusão em gel de agarose (IDGA), embora outras técnicas para detecção do vírus possam ser utilizadas, tais como o isolamento viral, a hibridização in situ e a reação em cadeia da polimerase – PCR (ANDRIOLI et al., 2006). Embora a IDGA seja a principal forma de detecção de animais infectados pelo CAE e o teste indicado pela World Organization for Animal Health (OIE), possui um valor limitado na identificação de animais em fase inicial da infecção (FROTA et al., 2005). A técnica de imunodifusão em gel de agarose é de fácil execução, bastante específica, sendo a prova recomendada para diagnóstico sorológico, apesar de ser menos sensível que as técnicas de ensaio imunoenzimático (ELISA) e reação em cadeia polimerase (PCR), que é mais recomendada para o diagnóstico precoce da enfermidade. 
A imunodifusão em gel de agarose é uma técnica de imunodiagnóstico onde ocorre reações precipitações as quais envolvem a combinação de antígeno solúvel com o anticorpo solúvel para produzir complexos insolúveis. A visualização da reação é feita quando há formação de um imunocomplexo de elevado peso molecular que precipitam no suporte, ou seja, devido ao seu tamanho e peso, o complexo imune fica imobilizado no gel, precipitando, formando halo ou linha visível. Fatores como concentração dos reagentes, especificidade e avidez dos soros imunes e a escolha dos antígenos definem a eficiência do teste. Além disso, a difusão também depende do tamanho do orifício, temperatura, consistência do gel, concentração do anticorpo incluído no gel, tempo de difusão e outros parâmetros. 
A imunodifusão pode ser simples ou dupla. Na forma simples, o antígeno ou o anticorpo é fixado a um suporte e o outro componente se difunde no meio até ocorrer a precipitação. Já na dupla, é quando os dois componentes migram um em direção ao outro. A imunodifusão permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo. O gel de agarose é colocado em uma placa ou lâmina, são feitos seis furos periféricos e um central. No orifício central, é colocado o anticorpo com concentração desconhecida a ser determinada, e nos periféricos são colocados o soro teste (antígenos). O gel de agarose já apresenta quantidade específica de anticorpo incorporada. Desta forma, o antígeno se
difunde no gel até encontrar o anticorpo, formando os imunocomplexos como resultado. O suporte é incubado em câmara úmida até que ocorra difusão (48 a 72h). Desta forma, o antígeno se difunde no gel até encontrar o anticorpo, formando os imunocomplexos como resultado. Este resultado pode ser observado por meio da formação de um halo no entorno do poço em que o antígeno foi adicionado. Os diâmetros dos halos de precipitação corresponderão a concentração do antígeno em questão. 
Em um estudo cujo objetivo foi investigar a transmissão do vírus da artrite encefalite caprina (CAE) de fêmeas naturalmente infectadas para seus filhotes usando imunodifusão em gel de agarose (IDGA), utilizou-se cinco cabras positivas para CAE (grupo experimental) e duas cabras negativas para CAE (grupo controle). Estas foram inseminadas artificialmente com sêmen fresco obtido de um macho conhecido como negativo para CAE. Após o nascimento dos cabritos, houve a separação imediata para evitar qualquer fonte de infecção. Além disso, foram alimentados com colostro bovino e leite para evitar esta importante rota de transmissão. A coleta das amostras e qualquer outra manipulação foram realizadas com material estéril.
As amostras de sangue foram coletadas das cabras por punção venosa da veia jugular em tubo de coagulação de 7 mL com separador de gel. 3 mL de amostra de sangue foram obtidos dos cabritos usando seringa com uma agulha descartável 25G. As amostras foram armazenadas em temperatura ambiente até a observação de retração do coágulo e centrifugadas a 3.000 g por 15 minutos para obtenção do soro. O soro foi transferido para um microtubo e armazenado a -20°C. Além disso, foram coletados 2,7 mL (para cabras) e 1,9 mL (para cabritos) de amostras de sangue em tubos contendo citrato de sódio. As cabras foram amostradas a cada 15 dias durante a gestação e apenas aos 15 dias pós-parto. Os cabritos foram amostrados antes da administração de colostro, no dia 15 após o nascimento e uma vez por mês até completarem um ano de idade.
Após a coleta das amostras, para realização do diagnóstico usando imunodifusão em gel de agarose, utilizou-se um em kit comercial (Biovetech, Recife, PE, Brasil). Para isso, 14 mL de agarose foram distribuídos em placas de Petri e sete poços foram formados. Os antígenos foram adicionados no poço central, enquanto controles positivos e negativos e amostras foram adicionados alternadamente nos outros poços. As placas foram incubadas a 20°C – 25°C por 48 horas. A leitura inicial foi realizada 24 horas após a incubação. A leitura definitiva foi concluída após 48 horas. Ambas as leituras foram realizadas com luz negra. Os resultados obtidos dos testes do IDGA foram comparados aos obtidos dos testes com Nested-PCR e ELISA utilizando amostras das cabras naturalmente infectadas e filhotes. 
As cabras foram monitoradas com o teste de IDGA durante a gestação (15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135 e 150 dias) e 15 dias após o parto. Durante os dias de gestação foi possível observar positividade das cabras utilizando o teste de IDGA, mostrando-se ser um teste confiável e preciso. Para avaliação da transmissão vertical, 12 cabritos de fêmeas naturalmente infectadas e 4 cabritos de fêmeas do grupo controle foram acompanhados por 12 meses para confirmação da transmissão vertical. Com a análise dos resultados do teste de diagnostico por IDGA para avaliar a transmissão, não foi possível diagnosticar a transmissão vertical de nenhumfilhote de mãe naturalmente infectada. Nenhum filhote apresentou-se positivo para artrite encefalite caprina ao utilizar o teste IDGA. Para ELISA, obteve-se resultados semelhantes ao do IDGA, observando-se positividade de transmissão vertical apenas ao utilizar o Nested-PCR, com 6 filhotes positivos (50%).
O estudo demonstrou a transmissão do vírus da artrite encefalite caprina para filhotes por transmissão vertical, entretanto o diagnóstico da transmissão do vírus da artrite encefalite caprina para filhotes por transmissão vertical não pode ser observada utilizando apenas o teste de imunodifusão em gel de agarose. Para um bom diagnóstico da transmissão vertical é necessário a utilização de uma associação entre diferentes métodos e amostras, tais como Nested-PCR e ELISA. Em termos de controle da doença, é importante identificar e eliminar a presença de fêmeas infectadas no rebanho, o que acabará por reduzir as perdas econômicas com a doença.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADAMS, D.S., KLEVJER-ANDERSON, P., CARLSON, J.L., MCGUIRE, T.C., GORHAM, J.R. Transmission and control of caprine arthritis-encephalitis virus. Am. J. Vet. Res.v. 44, p. 1670- 1675, 1983.
ANDRIOLI, A.; PINHEIRO, R. R.; GOUVEIA A. M. G.; SOUZA, K. C.; SANTOS, D. O. Controle da artrite encefalite caprina através do uso de tecnologias reprodutivas aplicadas às fêmeas. Comunicado Técnico Embrapa, nov. 2007. Disponível em: <http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/handle/doc/526486%3E>. 
CAVALCANTE, RF.R.A.; ANDRIOLI, A.; PINHEIRO, R.R.; SOUSA, K.C.; VERAS, A.K.A.; LOPES, T.A.; SOUSA, S.D. Detecçao do vírus da Artrite Encefalite Caprina por nested PCR e nested RT-PCR em ovócitos e fluido uterino. Arq. Inst. Biol. v. 80, p. 381-386, 2013.
FRANKE, C.R., 1988. Controle sanitário da artrite-encefalite caprina, EDUFBA, Salvador.
FROTA, M.N.L., SILVA, J.B.A., ARAÚJO, S.A.C., TEIXEIRA, M.F.S. Artrite Encefalite Caprina em cabritos de rebanhos com programas de controle no estado do Ceará. Arq. Inst. Biol. v.72, n. 2, p. 147-152., 2005. 
GAETA, N.C., HASEGAWA, M.Y., RIBEIRO, B.L.M., GOMES, A.L., CASTRO, R.S., GREGORY, L. Studying the elimination pattern of caprine arthritis encephalitis virus in the milk of infected females. Acta Scientiae Veterinariae.v. 44, p. 1403, 2016.
KING, A.M.Q.; LEFKOWITZ, E.J.; ADAMS, M.J.; CARSTENS, E.B., 2012. Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses, in: King, A.M.Q.; Lefkowitz, E.J.; Adams, M.J.; Carstens, E.B. (Ed.), Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier, San Diego, pp. 725-741.
LEITNER, G., KRIFUCKS, O., WEISBLIT, L., LAVI, Y., BERNSTEIN, S., MERIN, U. The effect of caprine arthritis encephalitis virus infection on production in goats. Vet. J. v. 183, p. 328-331, 2010.